Summary
Disse protokoller blev udviklet til at analysere kortikale linse morfologi, strukturel integritet af: zebrafisk linse suturer i faste og levende linser og til at målepositionen af zebrafisklinsen kerne langs den forreste-posteriore akse.
Abstract
Den zebrafisk er unikt egnet til genetisk manipulation og in vivo Imaging, hvilket gør det til en stadig mere populær model for reverse genetiske undersøgelser og for generation af transgenics for in vivo Imaging. Disse unikke kapaciteter gør Zebrafisken til en ideel platform til at studere okulær linse udvikling og fysiologi. Vores nylige fund, at en aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabiliteten af den forreste linse sutur, samt for skiftet af linsen kerne til linsen Center med alderen førte os til at udvikle værktøjer specielt velegnet til at analysere egenskaberne af: zebrafisk linser. Her skitserer vi detaljerede metoder til linse dissektion, der kan anvendes til både larve og voksne linser, til at forberede dem til histologisk analyse, immunhistokemi og billeddannelse. Vi fokuserer på analyse af linse sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligne data genereret fra dissekerede linser med data fra in vivo billedbehandling af linse morfologi muliggjort af en roman transgene: zebrafisk linje med en genetisk kodede fluorescerende markør. Analyse af dissekerede linser vinkelret på deres optiske akse gør det muligt at kvantificere den relative position af linse kernen langs den forreste-posteriore akse. Bevægelse af linse kernen fra en indledende forreste position til centrum er nødvendig for normal linse optik i voksne zebrafisk. Således en kvantitativ måling af linsen nukleare position direkte korrelerer med sine optiske egenskaber.
Introduction
Den: zebrafisk er en glimrende model for at studere linse udvikling og fysiologi på grund af de anatomiske ligheder med pattedyrs linser, relativ lethed af genetiske og farmakologiske manipulation, hastighed af embryonale øjen udvikling, lille størrelse og gennemsigtighed tidligt stadie, hvilket muliggør in vivo -billeddiagnostik. De metoder, der er beskrevet her blev udviklet til at analysere: zebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på den suturmæssige integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og placeringen af linsen nukleare position langs forreste-posteriort akse ex vivo. Disse metoder tjener som udgangspunkt for funktionelle undersøgelser af linse udvikling og fysiologi, samt omvendte genetiske skærme til linse fænotyper i zebrafish.
Billeddannende zebrafisklinse morfologi
Aquaporin 0 (AQP0) er den mest rigelige linse membran protein og er afgørende for både linse udvikling og klarhed, på grund af flere væsentlige funktioner i pattedyr. Zebrafish har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b), og vi har udviklet metoder til at analysere tabet af deres funktioner i både embryonale og voksne linser. Vores undersøgelser afslører, ataqp0a-/-mutanter udvikler forreste polær uigennemsigtighed på grund af ustabilitet i den forreste sutur, og aqp0a/b dobbelt mutanter udvikler nuklear opacitet1. AQP0 har vist sig at spille roller i vand transport2, vedhæftning3,4, cytoskeletale forankring5 og generering af brydningsindeks gradient6, men disse undersøgelser er stort set blevet udført i vitro-diagnostik. Den: zebrafisk giver en unik mulighed for at studere, hvordan tab af funktion, eller forstyrres funktion af Aqp0a eller Aqp0b ville påvirke morfologi og funktion i en levende linse. For at vurdere cellernes morfologi og den kulturelle integritet under udviklingen ændrede vi eksisterende in vitro immunohistokemiske metoder7 til brug i embryonale og voksne linser og genererede transgenics til at overvåge denne proces in vivo .
Immunohistokemisk analyse af plasma membran struktur og den suturmæssige integritet blev udført i hele faste embryoner og voksne linser. Zebrafish linser er ekstremt små (linse diameter er ~ 100 μm i embryoner og op til 1 mm hos voksne) sammenlignet med deres pattedyr-modparter og har punkt suturer8, som sjældent fanges i kryosektioner. Således hele linser er afgørende for at analysere den kulturelle integritet. Til in vivo analyse af forreste sutur dannelse, og billeddannelse af præcis linse celle arkitektur, genererede vi transgenics udtrykker Mapple specifikt mærkning linse membraner.
Fordele ved levende billeddannelse af linse membran transgenics omfatter: 1) undgå fiksering artefakter, 2) studere dynamiske morfologiske ændringer i time-lapse film, og 3) muliggør langsgående undersøgelser, hvor tidligere begivenheder kan korreleres med senere Fænotyper. Pigmentering af iris forhindrer normalt klar billeddannelse af objektivets periferi. Tilsætning af 1-phenyl 2-thiourea (PTU) før primordia-5 (Prim-5) stadie9 forhindrer melanogenese og øjen pigmentering op til omkring 4 dage efter befrugtning (DPF). Efter 4 DPF skjules objektivets periferi dog in vivo, især i ældre stadier. Endvidere, tætheden af linsen selv tilslører billeddannelse af sin posterior stang. Derfor, for at studere morfologi af linsen periferi, eller posterior sutur, efter 4 DPF, linser skal være fjernet og fast.
Transgene: zebrafisk linjer er blevet anvendt til at analysere embryonale linse membran struktur i vivo10. Q01 transgene udtrykker et cyan fluorescerende protein, der er smeltet til en membran målretnings sekvens, Gap43, drevet af EF1α promoter og en hexamer af DF4 PAX6 forstærker-elementet allestedsnærværende i linse fiber celler11. Q01 har ekstra-lenkulære udtryk, herunder amacrine celler i nethinden, som tilføjer baggrunds signal, hvis den primære interesse er linsen. Vi udviklede en roman transgene linje, der udtrykker en membran-tøjret mApple specifikt i linsen, med det formål at undgå enhver ekstra-linse-signal.
Lokalisering af linse kerne
Vi opdagede, at linse kernen bevæger sig fra en indledende forreste placering i larve: zebrafisk til en central placering i den forreste-posterior akse i voksne linser. Dette skift i positionen af den høje brydningsindeks linse kerne menes at være et krav til normal udvikling af: zebrafisk linse optik1. Vores metoder muliggør kvantificering af objektivets nukleare centralisering i forhold til linse radius. Ved hjælp af denne metode, vi viste, at Aqp0a er nødvendig for linse nuklear centralisering1, og denne enkle metode kan anvendes til andre undersøgelser af udviklingen og fysiologi af linsen og dens optiske egenskaber i: zebrafisk model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyre protokoller, der anvendes i denne undersøgelse, overholder ARVO-erklæringen om brug af dyr i oftalmisk forskning og Synsundersøgelse og er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) fra University of California, Irvine.
1. opdræt af zebrafish og eutanasi
- Hæv og vedligehold zebrafisk (AB stamme) under standard laboratoriebetingelser12. Fostre embryoner i embryonale medium (EM)12. Tilsæt 0,003% PTU til EM fra 20-24 h postbefrugtning (før Prim-5 scenen) for at forhindre pigmentdannelse i embryoner12 anvendes til billeddannelse på embryonale stadier9. Hæv larverne fra 6-30 dage efter befrugtning (DPF) på en diæt af levende rotifere indtil 14 DPF, og levende artemia After 14 DPF12.
Forsigtig: PTU er meget giftigt -
Anæstetize fisk ved hjælp af tricainmethansulfonat indtil ikke-lydhør over for berøring.
- Forbered tricain-materiel ved at kombinere 400 mg 3-amino benzoinsyre, med 2,1 mL af 1 M tris (pH 9), i 100 mL ddH2O. Justér til pH 7,0 og opbevar ved-20 °c.
Forsigtig: Tricaine er giftig. - 4,2 mL tricain-bestand fortyndes i 100 mL tank vand for at bedøve larver/voksne eller i EM for at bedøve embryoner (endelig koncentration af tricain ved 0,0165% w/v).
- Forbered tricain-materiel ved at kombinere 400 mg 3-amino benzoinsyre, med 2,1 mL af 1 M tris (pH 9), i 100 mL ddH2O. Justér til pH 7,0 og opbevar ved-20 °c.
2. fiksering af embryoner og larver
Bemærk: Immunohistokemiske protokoller blev tilpasset fra tidligere offentliggjorte materialer7.
- Der fastsættes dechorionerede embryoner eller larver i op til 2 uger efter befrugtning i 4% (v/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfat bufferet saltvand (PBS) natten over ved 4 °C på en rocker.
Forsigtig: PFA er brændbart og kræftfremkaldende. - Vask embryoner tre gange i 10 min i PBS, og permeabilize i PBS med 10% Triton og 1% DMSO (PBS-T) natten over ved 4 °C.
Forsigtig: DMSO er giftigt, er skadeligt ved indtagelse eller hudabsorption, transporterer farlige materialer gennem huden og er brændbart. Triton er giftigt, ætsende og farlig for vandmiljøet.
3. dissektion af larval og voksne Zebrafish linser
- Anæstetize fisk fra 6 DPF larver til voksenalderen med tricainmethansulfonat indtil ikke-lydhør over for berøring, men stadig viser en stærk hjerterytme. Mål fisk standard længde som pr Schilling (2002) for mellemstation13.
-
Straks punkt lige øjne ved hjælp af mikro-dissektion saks og sted i en dissektion ret i PBS (figur 2 vist for voksne øjne).
- Lav en brugerdefineret 35 mm skål fyldt med silikone til linse dissektioner. Når silikone har sat, punktafgifter en divot's omkring 2-3 mm i diameter og 0,5 mm dyb for immobiliserende voksne øjne/linser under Dissection.
-
Dissektion af voksne: zebrafisk linser
- Læg et voksent øje i skålen divot's posterior side op fyldt med PBS. Ved at indsætte pincet ved < 45 ° vinkel gennem den optiske skive. Vær omhyggelig med ikke at Nick eller komprimere linsen. Lav to eller tre radiale snit gennem nethinden og sclera fra den optiske skive til den ciliære zone med dissektion saks.
- Skræl tilbage nethinden og sclera ligesom blomster blade og invertere øjet, hornhinden side op. Immobilize linsen indirekte via manipulation af sclera og cornea med den flade side af saksen, mens trække væk nethinden og vedlagte væv med pincet. Trim forsigtigt overskydende væv fra linsen.
Bemærk: Det er vigtigt at dissekere omhyggeligt for at opnå konsekvent sunde linser.
-
Dissektion af larve: zebrafisk linser
- Placer et larve øje posterior side op på den flade del af silikone skålen fyldt med PBS og bruge en skærpet wolfram nål til at gøre radiale nedskæringer gennem nethinden og sclera mens blokeret øjet med en anden wolfram nål eller pincet.
Bemærk: Pas på ikke at beskadige linsen.- Skærp spidsen af en 2 cm længde på 0,1 mm wolfram wire elektrolytisk ved at suspendere wire spidsen i 10% (w/v) NaOH og anvende en lav spænding vekselstrøm14. Fastgør nålen til en Pasteur-pipette ved at smelte glas enden ved hjælp af en Bunsen-brænder.
Bemærk: Alternative findissektions værktøjer kan også anvendes.
Forsigtig: NaOH er ætsende.
- Skærp spidsen af en 2 cm længde på 0,1 mm wolfram wire elektrolytisk ved at suspendere wire spidsen i 10% (w/v) NaOH og anvende en lav spænding vekselstrøm14. Fastgør nålen til en Pasteur-pipette ved at smelte glas enden ved hjælp af en Bunsen-brænder.
- Hæld forsigtigt linsen ud af det dissocierede øje med en stump side af nålen, og træk forsigtigt det vedlagte væv væk.
- Placer et larve øje posterior side op på den flade del af silikone skålen fyldt med PBS og bruge en skærpet wolfram nål til at gøre radiale nedskæringer gennem nethinden og sclera mens blokeret øjet med en anden wolfram nål eller pincet.
4. fiksering af Dissekterede linser
- Fastgør straks dissekterede linser i 1,5% (v/v) PFA i PBS i 24 timer ved stuetemperatur (RT). Vask linser tre gange i PBS i 10 min hver.
- Permeabilize linser til helmonterings analyse eller kryoprotect til kryosektionering (se punkt 8).
- Permeabilize linser i PBS-T natten over ved 4 °C.
5. linse Immunohistokemi
- Etiket membraner af fast embryo/larve eller voksne linser ved inkubation i Phalloidin-Alexa fluor 546 (1:200 ) og cellekerner med dapi (1:1000 af 5 mg/ml lager) i PBS-T natten over ved 4 °c.
Forsigtig: DAPI er et irritationsmoment for hud og øjne. - Vask tre gange med PBS-T i 10 min. Klart væv ved inkubation i 30%, 50% og 70% glycerol i PBS-T (v/v) i mindst 1 time ved RT hver, eller natten over ved 4 °C.
- Monter fisk i 70% glycerol i PBS-T (v/v) på glasbund 35 mm mikrobrønd retter med øjne som flade og lige mod Cover sedlen som muligt. For yngre fisk, kan en let anterior-lateral hældning bidrage til at orientere linsen sutur at være parallel med coverslip.
6. analyse af Zebrafish anterior linse suturer ved hjælp af en Trans Geniske linje in vivo
- Generer TG (βB1cry: mAppleCAAX)- linjer ved hjælp af Tol2 kit15. Tol2-føres element system15 muliggør stabil integration af konstruktionen, hvor Mapple drives af 300 BP af den humane βb1-crystallin-promotor16 , der bindes til membranen af caax-sekvensen, hvilket resulterer i ekspression specifikt i linse fiber cellemembraner.
Bemærk: Denne konstruktion (ID: 122451) kan købes.- Om morgenen af injektion, forberede injektion blandingen og holde på is. For at nå et endeligt volumen på 10 μL indeholdende RNase-og DNase-fri H2O, tilsættes: 1,5 μl af Huβb1Cry: MAPPLECAAX DNA-konstruktion ved 50 ng/μl-[0.375-0,75 PG/endelig injektion], 1,5 μl Tol2 Transposase mRNA ved 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 PG/ Endelig injektion] og 1 μL phenolrød indikator ved 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/Endelig injektion].
- Injicer 50-100 pL injektions blanding i 1-cellet stadie embryoner12.
- Mål gensplejsning effektivitet i F0 injicerede embryoner ved at måle hyppigheden af embryoner med Mapple positive linser ved 3 DPF.
Bemærk: Forvent at have > 80% gensplejsning effektivitet ved hjælp af denne metode. F0 mosaikker tillader detaljeret analyse af membran morfologier af individuelle celler. Varierende niveauer af mosaisme giver en til billede morfologier af enkelt eller små grupper af celler, mens mere globale linse udtryk tillader analyse af flercellede strukturer som linse suturer in vivo. - Outcross F0 mosaik fisk til at generere stabile linjer, som etiket alle fiber cellemembraner. F0 stiftere med transgen integreret i kimcelle vil generere afkom med stabile integrationer, der kan opretholdes som transgene linjer.
7. analyse af Zebrafish anterior linse suturer ved hjælp af en Trans Geniske linje in vivo
- Anesthetize 3 DPF eller voksen mosaik eller stabile transgene fisk og montere i 1% lav smelte agopstået (LMA) med tricainmethansulfonat med øjet fladt mod dækslet slip af glasbund mikrovelretter.
- 1 g LMA opløses i 100 mL EM (uden methylenblåt) for at lave 1% LMA. Opbevares i lang tid som 15 mL-lagre ved 4 °C. Mikrobølgeovnen opløses i lageret og opbevares ved 42 °C, indtil hvert rør anvendes.
- Dække fisk op til 6 DPF med EM med tricainmethansulfonat, eller med tank vand med tricain for voksne, når LMA er indstillet.
- Der blandes 5 mL EM uden methylenblåt eller tank vand med 250 μL tricain-lager og 7 μL PTU, hvis der behandles PTU-behandlede fisk.
8. linse Kryosektionering og Immunohistokemi
- Cryoprotect faste embryoner eller voksne linser ved at anbringe 10% saccharose i PBS (w/v), 20% saccharose i 1 time ved RT hver (eller natten over ved 4 °C) og natten over i 30% saccharose ved 4 °C.
- Indlejre væv i Oct i base forme, og derefter fryse på spændeenheder med okt. cryosection ved 12-14 μm og indsamle på en superfrost/plus mikroskop slides. Varme sektioner på slide i 10 min på en slide varmere forvarmet til ~ 35 °C.
- Vask sektioner tre gange med PBS i 10 min hver. Label sektioner med Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) med DAPI (1:1000) eller WGA-Alexa Flour 594 (1:200), efterfulgt af tre PBS skyller. Mount med anti-fade monterings medium, og forsegle dækglas med neglelak.
9. billeddannelse
- Erhverve billeder med et confokal mikroskop. Erhverve z-stakke eller optiske skiver ved hjælp af en 60x N/A 1,2 vand-fordybelse mål, eller lignende, i bestemte områder fra den forreste til bageste linse stang. Brug følgende anskaffelses indstillinger: 1,2 Airy Disc ved hjælp af 561 nm laser, Texas Red filter for phalloidin-Alexa Flour 546 eller mApple, eller 405 laser med UV-filter til DAPI.
- Ret z-intensitet laser effekt til at modvirke signal tab med dybde i linsen. Dette giver mulighed for et stærkt signal ved den bageste pol af faste og levende 3 DPF embryoner, og stærkt signal i ækvatoriale optiske skiver i voksne fisk linser.
- Kompiler og se billeder ved hjælp af billedbehandlings software.
10. måling af linse kerne lokalisering i den forreste-posteriore akse
- Orienter frisk exciserede linser aksialt i PBS i en 35 mm skål med en dækglas bund, med stænger og suturer orienteret parallelt med planet af fokus. Kig efter en forskel i brydningsindekset, som normalt forekommer på grænsefladen af linsen cortex og linse kernen til at identificere linsen kerne.
Bemærk: Sunde vilde type voksen linser er ekstremt gennemsigtige gør det vanskeligt at se objektivet suturer og kerne, eller at bestemme linse orientering. I dette tilfælde, en lille Nick med pincet til linsen kapsel forårsager mindre skade, hvilket gør suturer og linse kerne tilsyneladende i omkring 10 min bidrage til at orientere linsen for denne måling. Men, linserne bliver ubrugelige for downstream applikationer, som de er nu beskadiget. - Tag billeder af linser med linse kernen i fokus under lyse felt belysning med eller uden dic Optik ved hjælp af et dissektion mikroskop med et kamera påsat. Billede et mikrometer under samme forstørrelse til kalibrering.
- Klik på Live View-knappen, Juster eksponeringsindstillingerne for at visualisere linse kernen og objektivets periferi, og tag et billede ved at klikke på snap shot-knappen. Gem som en tif-fil.
- Brug billedbehandlingssoftware til at kalibrere de erhvervede linse billeder. Vælg det lineære værktøj, og tegn en linje med kendt længde på mikrometer billedet, klik på analysér | den fastsatte skala. Indtast kendt distance, enheder og vælg ' Global ' kalibrering, og klik OK.
- Mål afstanden i midten af linse kernen til den forreste pol (a-r).
- Brug det lineære værktøj i billedbehandlings software til at tegne en linje på tværs af det ubeskadigede centrum af linse kernen i en aksial retning. Tag centrum af denne linje som centrum af linsen kerne.
- Tegn en anden linje fra dette punkt til den forreste pol af linsen og vælg ' mål ' i ' analys'-menuen for at måle afstanden (a-r), hvor a er radius af linsen og r er afstanden fra midten af linsen til midten af Kernen.
- Tegn en anden linje fra den forreste til de bageste poler og mål denne afstand som linse diameter (2a). Kopiér disse længder fra vinduet ' resultater ', og Overfør til et regneark eller et statistikprogram.
Bemærk: Det er lettere præcist at måle fra midten af kernen til den forreste pol, end at måle fra midten af linse kernen til midten af linsen. Denne måling konverteres af formlen i trin 10.3.5 til at rapportere afstanden mellem centrum af linse kernen til midten af linsen. Brug altid den voksne kerne til målinger, selv om den embryonale kerne er tydelig. - Dividerer diameteren med 2, for at beregne linse radius, a.
- Beregn r/a, som
er den normaliserede lokalisering af linse kernen med hensyn til linse radius.
Bemærk: for en kerne, der er placeret tættere på den forreste pol, vil r/a være > 0,0, mens en centralt lokaliseret kerne vil have en r/a på 0,0.
- Graf loggen af den normaliserede aksiale kerne måling som en funktion af den standard længde for at bestemme ændringer i linse kerne lokalisering under: zebrafisk udvikling.
er den normaliserede lokalisering af linse kernen med hensyn til linse radius.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne: zebrafisk øjen anatomi ligner nøje pattedyr (figur 1a). På trods af nogle forskelle mellem zebrafisk og pattedyr øjne, såsom at have en ciliære zone i stedet for en ciliære krop17, forskelle i optiske egenskaber18, og forskelle i morfogenese under fosterudvikling19, den : zebrafisk Eye er en glimrende model til at studere øjen udvikling og forståelse oftalmologiske sygdom20,21,22. En simpel epitel linjer den forreste pol af linsen, som ved ækvator gennemgår en livslang proces af spredning, forlængelse, og differentiering i fiber celler, der udgør hovedparten af linsen. Modne fiber celler (figur 1b, lyseblå) først differentiere i embryonet, er blottet for organeller og er aldrig erstattet. Differentiating fiber celle tips mødes på polerne til at danne de forreste og bageste suturer. Disse celler er derefter internaliseret af nyligt differentierede fiber celler. Ligesom alle hvirveldyr linser,: zebrafisk linsen har således en gradient af udvikling med de ældste celler placeret i midten af linsen kerne. Den: zebrafisk linse placode former ved 16 h postbefrugtning (HPF), som aflange til at danne den primære linse fibre ved 18 HPF, og sekundære fibre danner overgangszonen på 28-36 HPF. Den bageste sutur er synlig ved 48 HPF, som er før den forreste sutur bliver synlig10.
Den præcise udvikling og vedligeholdelse af regelmæssig linse arkitektur er afgørende for dens optik. Her beskriver vi metoder til analyse af: zebrafisk linse celle morfologi in vitro og in vivo, herunder både fordele og begrænsninger, som vi udviklet til at analysere fænotyper som følge af tab af-funktion mutanter af to: zebrafisk Aqp0s, Aqp0a og Aqp0b1. Til vurdering af voksne linse morfologi in vitro, linser blev dissekeret (figur 2) og straks fast. Embryonal vurdering blev udført i hele faste embryoner (figur 3) og sammenlignet med levende transgene embryoner (figur 4). Dissekterede og faste voksen linser (figur 5) blev sammenlignet med transgene voksne linser, der var i live (figur 6). Forskelle i påvisning og visualisering af specifikke dele af linsen ved hjælp af disse metoder er opsummeret (tabel 1).
Phalloidin fandtes at være overlegen for mærkning linse fiber cellemembraner i: zebrafisk sammenlignet med hvedekim agglutininsygdom (WGA). WGA er en lektin, der binder sig til N-acetyl-D-Glucosamin og sialsyre, og WGA konjugeret til fluorophores er typisk bruges til at mærke linse fiber cellemembraner i human23, kvæg24, får25, mus26, rotte27 og : zebrafisk28,29. Her bruger vi phalloidin på hele: zebrafisk linser (figur 3, figur 5).
Embryonale og larve: zebrafisk larver op til 7 DPF er små og gennemtrængelig nok til at tillade penetration af phalloidin i linsen ydre cortex. Ved 3 DPF linse kernen er kompakt og blottet for organeller, forreste suturer form på den forreste pol (figur 3a,B), og phalloidin er udelukket fra linsen kernen i et ækvatoriale optiske plan (figur 3c,D). Phalloidin er sandsynligvis udelukket fra kernen på grund af den høje komprimering af fiber cellemembraner, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser28. Men, den ydre cortex er visualiseret i stor detalje med denne farvning (figur 3c-F). I tværsnit, fiber celler tage på en flad sekskantede form, med længere brede sider, og kortere smalle sider. Phalloidin stærkt etiketter både de smalle og brede fiber cellemembraner (figur 3E-F) fremhæve komprimering af kortikale fiber celler mellem brede sider. Denne organisation er stort set upåvirket i aqp0a/b dobbelt mutanter (figur 3b, D, F og H).
Mosaik udtryk af transgenet (mApple bindes til cellemembranen af CAAX motiv drevet af en 300 BP promotor region af den menneskelige βB1 crystallin promotor) udtrykker stærkt i linser begyndende ved 2 DPF. Transgenet er tilfældigt integreret i genomet, hvilket resulterer i heterogent udtryk af mApple. Vi viser eksempler på en 3 DPF linse med stærkt udtryk i cortex (figur 4) og udtryk i dele af kernen (figur 4d). Membranen markør er ikke begrænset af permeabilitet som phalloidin, dermed etiketten linse kernen. Mosaikker (figur 4) genereret af DNA-injektioner, der kun udtrykkes i en lille delmængde af celler, er nyttige til at analysere individuelle cellers morfologier sammenlignet med stabile linjer, som mærker hver celle, der udtrykker βb1 crystallin (figur 6). I TG (βB1cry: mAppleCAAX) mosaikker morfologien af den forreste sutur kan visualiseres i z-projektioner taget på den forreste pol (figur 4a,B). Bemærk, at morfologien af cellemembraner afviger fra faste linser mærket med phalloidin (figur 3a,B) og tilstedeværelsen af underdomæner i brede cellemembraner (figur 4a' hvide pile), der tidligere er identificeret i linser fra andre arter30 er synlig. Men, svagere mærkning af smalle fiber cellemembraner resulterer i en manglende evne til at se den slående konvergens af celler på den forreste sutur (figur 4a,B pil) ses i faste linser mærket med Phalloidin (figur 3a,b piletasterne).
Interessant, optiske skiver taget på linsen ækvator også afsløre en anden mærkning mønster, med åbenlyse afbrydelser til celle volumen i aqp0a/b dobbelt mutanter sammenlignet med WT (figur 4c-F). Dette er sandsynligvis fordi de transgene etiketter bred fiber cellemembraner mere effektivt end phalloidin. Vi var i stand til at opnå z-projektioner gennem posterior pol til at analysere integriteten af posterior sutur med brug af Z-korrektion, som øgede laser magt med dybde i væv. Klar analyse af posterior sutur (figur 4g,H) i intakt fisk var begrænset til de første 5 DPF, og efter at linsen var for tæt, hvilket resulterede i tab af signal i den bageste del af linsen.
Fast dissekeret voksen linser mærket med phalloidin afslørede slående detaljer i den højt ordnede arkitektur af fiber cellerækker konvergerende at danne forreste suturer (figur 5a, pil) og morfologi af cortex (figur 5c-H), på grund af meget stærk mærkning af smalle fiber cellemembraner af phalloidin. Maksimale Z-projektioner af den forreste pol afslørede tab af en stram forreste sutur i aqp0a/b dobbelt mutante linser (figur 5b, pil), sammenlignet med WT (figur 5a, pil), som tydeligt som en masse af membraner og cellekerner i optisk skiver 30 μm fra den forreste pol (figur 5D). I dybere optiske skiver blev phalloidin-mærkningen ekskluderet fra den dybere linse cortex og kerne (figur 5E,F). Den samlede organisering af fiber cellerækker i den ydre cortex var noget påvirket af manglen på en stram forreste sutur i aqp0a/b dobbelt mutante linser, hvilket gør det umuligt at placere linser nøjagtigt vinkelret på billedbehandlings planet (figur 5F ) sammenlignet med WT-linser (figur 5e). Men, høj effekt billeder af fiber cellerækker taget i ækvatoriale plan afslørede, at celler i den ydre cortex stadig dannet ordnede rækker, synlige på grund af stærke smalle fiber celle mærkning (figur 5g,H). Det var umuligt at skelne individuelle fiber celle brede membraner på grund af en kombination af deres stramme komprimering, og svage signal. Da disse linser blev dissekeret, kunne de monteres med den bageste side mod målet, så z-projektioner af posterior suturer, som viste ingen forskelle mellem genotyper som posterior fiber celle spidser dannet stramme suturer (figur 5I,J pile).
Z-fremskrivninger af linser af levende bedøvet voksne stabile TG (βB1cry: mAppleCAAX) fisk afslører kortikale membran morfologi i den forreste cortex (figur 6a,a '), samt omfanget af celle konvergens på den forreste pol ( Figur 6B). Det var vanskeligere at montere fiskene med linse suturer vinkelret på billedbehandlings flyet, sammenlignet med faste dissekterede linser. Stabile linjer, der transporterer transgenet Express mApple i linse kernen (figur 6c,D). Optiske skiver ved ækvator afslørede et stærkt signal, der indikerer omfattende komprimering af kernen, når den er indpakket med samme laser effekt som den forreste cortex (figur 6c). Interessant, ingen cellulære opløsning af den ydre cortex var tydelig hos voksne, i modsætning til i embryoner. Dette skyldes sandsynligvis, at iris blokerer et klart signal fra objektivets periferi. Det kan være muligt at opnå en stærkere linse kortikale signal ved dilatation af eleven før billeddannelse. Med reduceret laser effekt var det muligt at skelne nogle cellelag i linse kernen (figur 6D). Den voksne: zebrafisk linse er meget tæt, og det var umuligt at få signal fra posterior pol in vivo.
Vi har vist, at zebrafisklinse kernen bevæger sig i den optiske akse fra en indledende forreste position i larve linser til en central position i voksne1. Disse bevægelser er fremhævet i aksiale linse sektioner, da phalloidin og WGA er ekskluderet fra linse kernen (figur 7A-C). Vi har vist, at Aqp0a er nødvendig for denne centraliseringsproces1, men denne mekanisme vil sandsynligvis blive påvirket af andre proteiner. Lokalisering af centrum af linse kernen i forhold til dens position langs den forreste-posteriore akse blev målt ved at placere dissekerede hele linser i deres aksiale orientering og billeddannelse under DIC belysning, hvilket fremhæver små forskelle i refraktive egenskaber (figur 7E). Suturerne har normalt en anden brydningsindeks end den omgivende cortex, så kan bruges som en vejledning til orientering. Unge larve linser har mere indlysende suturer (posterior suturer i meget unge linser), og linse kerner, som har et andet brydningsindeks, er naturligvis asymmetrisk, hvilket gør det lettere at orientere linser på disse stadier. Den relative afstand mellem centrum af linse kernen fra midten af linsen (r) er normaliseret til linse radius (a). Dette er så graferet med relation til: zebrafisk udvikling, som standard længdemåling anvendes13. I WT starter linse kernen tættere på den forreste linse stang 
og centraliserer 
derefter i voksenalderen (figur 7F).
Figur 1 : Zebrafish voksen øje og objektiv diagram. Anterior er taget som hvor lyset kommer ind i øjet, som i zebrafiskene er faktisk lateral. (A) zebrafisklinsen sammen med hornhinden fokuserer lyset på nethinden. I akvatiske dyr, hornhinden spiller en mindre rolle i lys refraktion, men i stedet, linsen har en højere refraktive indeks18. Linsen adskiller det forreste kammer fyldt med vandigt humor og posterior kammer fyldt med glaslegemet humor. B) zebrafisklinsen er mere sfærisk end linser af pattedyr. Fiber celle spidser mødes ved punkt-eller navle suturer8 ved de forreste og bageste poler. Differentierende fiber celler i linsen cortex har kerner og organeller, mens modne fiber celler i linsen kernen (lyseblå) er blottet for organeller og kerner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Zebrafish linse Dissection. (A) øjnene er dissekeret fra bedøvet fisk og placeret posterior side op (B). (C) øjnene er immobiliseret af pincet via den optiske Skive (OD) og to til tre radiale snit er lavet i nethinden og sclera fra den optiske skive til zonules. (D) fold klapper ud for at afsløre linsen. (E) Drej øjet til ansigt hornhinden op, immobiliserer linsen indirekte via hornhinden og trække væk sclera-Retina. (F) trim væk resterende nethinden og ciliære zone/zonler fra linsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Embryonale linse morfologi in vitro. Faste og permeabiliserede embryoner mærket med phalloidin (rød) og cellekerner med DAPI (blå) afslører membran morfologi og sutur integritet ved polerne. Z-prognoser viser, at WT og aqp0/b dobbelt mutante linser udviser meget regelmæssig fiber celle arrangement, der mødes på en meget stram forreste sutur (pile) ved 3 DPF (a, b). Optiske skiver taget på ækvator afslører stramme rækker af sekskantede fiber celler pakket i den ydre cortex i begge genotyper (C-F). Både smalle og brede sider af fiber cellemembraner mærkes som vist i (E). Posterior suturer (pile) dannes og stramt i begge genotyper (G, H). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Embryonale linse morfologi in vivo. Levende billedbehandling af anæstetiseret 3 DPF mosaik F0 injiceret TG (βb1cry: mapplecaax) linser afslører forreste suturer (pile) i z-projektioner (a, B). (a ') Membran underdomæner er tydelige som puncta (hvide pile) i brede fiber cellemembraner. Smalle fiber cellemembraner er også tydelige (sorte pile). WT linser afslører stramt pakket linse kortikale fiber celler (C, E), sammenlignet med forstyrret cortex af aqp0a/b dobbelt mutanter- med tydeligt hævede celler (D, F). Med fokus på posterior (g, h) suturer (pile) afslører ingen forskel mellem Geno typerne (g, h). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Voksen linse morfologi in vitro. Exciterede, faste og permeabiliserede linser fra fisk over 23 mm standard længde blev mærket med phalloidin (rød) og DAPI (blå). 150 μm Z-projektion ved den forreste pol afslører streng arrangement af fiber celle spidser, der konvergerer ved en stram sutur (pil) i WT (a), men ikke aqp0a/b dobbelt mutanter (Arrow), som i stedet har en masse af membraner og kerner (b). En optisk skive taget 42 μm fra den forreste pol afslører bestilte celler konvergerende i midten i WT (C), men en masse af kerner, hvor sutur bør være i mutant linser (D). Optiske skiver gennem objektivets ækvator, ved 130 μm fra den forreste pol afslører tætpakkede rækker af fiber celler i WT (E, G) og mutanter (F, H). Posterior suturer (pile) dannes og stramt i begge genotyper (i, J). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 Voksne linse morfologi in vivo. Levende billedbehandling af anæstetiseret voksen stabilt TG (βB1cry: mAppleCAAX) WT linser. Z-projektioner på den forreste cortex afslører kortikale morfologi (a, a '), og forreste sutur (pil), med celler konvergerende til et punkt i et enkelt optisk Skive (B, pil). Cortex kan visualiseres ved højere laser effekt i en optisk skive gennem ækvator (C), sammenlignet med det stærkere signal danner linse kernen (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Zebrafish linse kerne centraliseringen. Faste og kryoprotekterede embryoner (a) og linser (B, C) var aksialt Cryo-sekteret og mærket med phalloidin-546 (rød i a, b), Dapi (blå i a, b) eller WGA-594 (rød i C). Linse kernen er blottet for cellekerner, og er placeret tættere på den forreste (a) linse ved 3 DPF (a), og i 1 måned gamle linser (B), sammenlignet med at være centralt placeret i voksne linser (C). Dissekted linser fra en 1 måned gammel: zebrafisk af 4,1 mm standard længde var orienteret equatorially (D), eller aksialt (E). Den relative lokalisering af linse kernen i aksen blev beregnet ved hjælp af følgende strategi: (E) afstanden til midten (*) af linse kernen (den hvide stiplede linje) blev målt til den forreste pol, da dette er mere praktisk end at måle afstand (r) til midten af linsen (plus). Dette blev normaliseret til linsen radius (a), som blev initialt målt som den aksiale (Ant.-pos.) linse diameter. Loggen for den normaliserede aksiale kerne lokalisering blev graferet som en funktion af: zebrafisk udvikling, målt ved standard længde (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Funktion | IHC embryo | TG embryo | Hele IHC voksen linse | TG Adult |
| Live | N | Y | N | Y |
| Anterior sutur | Y | Noget | Y | Noget |
| Posterior sutur | Y | Y | Y | N |
| Kortikale cellulære detaljer | Noget | Y | Y | Anterior noget |
| Linse kerne detalje | N | Y (stabilt) | N | Y (stabilt) |
| Sekundær etiket | Y-antistoffer | Kun live med TG | Y-antistoffer | Kun live med TG |
| Bred/smal fiber etiket | Både | Bred | For det meste smalle | Bred |
Tabel 1: oversigt over sammenligningen af in vivo vs in vitro metoder til analyse af linse morfologi i zebrafisk. Y = ja, N = nej
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse af: zebrafisk linse morfologi er det første skridt til at forstå fænotyper i mutanter, eller virkningerne af farmakologiske interventioner rettet mod at studere biologi af okulær linse. Vi skitserer metoder til at analysere linse suturer, kortikale fiber celle morfologi og aspekter af linsen kerne. Disse tilgange er en kombination af in vitro og in vivo (sammenlignet i tabel 1). In vitro metoderne giver mulighed for større detaljering af den ydre kortikale cellers morfologi samt adgang til posterior sutur i voksne linser.
In vivo analyse er mulig ved brug af transgene markører. Det transgen, vi introducerer her, er objektiv membran specifik, sammenlignet med den eksisterende Q01 : zebrafisk linje, som samtidig mærkning linsen membraner også etiketter andre celletyper i øjet, herunder amacrine celler, komplicerende fortolkning11 . In vivo signalet er begrænset af det pigmenterede epitel i øjet, som dannes i løbet af den anden dag af embryogenese, så embryoner skal være PTU behandlet til analyse på dette og efterfølgende stadier. Hos voksne, iris skjuler klar analyse af linsen cortex, men giver mulighed for in vivo analyse af den forreste linse cortex. Levende billeddannelse af fiske linser giver mulighed for langsgående undersøgelser af linse morfologi i samme dyr. Dette kan være et yderst nyttigt værktøj til at studere effekter på dynamiske processer, såsom celle volumen afbrydelse som reaktion på osmotiske eller farmakologiske forstyrrelser. En uventet konstatering er, at vi klart kan visualisere membranen underdomæner i brede fiber cellemembraner i levende larve transgenics, men ikke i faste linser. Dette fremhæver forskellen i mærkningen af transgenet og phalloidin samt det faktum, at disse underdomæner kan blive påvirket af fikserings processen.
Analyse af de molekylære mekanismer linse kerne centralisering ved hjælp af de metoder, vi beskriver, kan afdække mekanismer afgørende for udviklingen af objektivets optiske egenskaber. Selv om, til dato, aksial linse kerne asymmetri er kun blevet rapporteret i zebrafish, ved at studere denne proces, vi er tilbøjelige til at få indblik i mekanismer, der kræves for udvikling af linse optik i andre arter. I fremtiden kan de transgene dyr anvendes i kombination med andre applikationer-såsom overekspression undersøgelser, med brug af en grøn gensplejsning markør. Disse kan bruges til at studere virkningerne af at over udtrykke et bestemt protein i linsen, eller til redning af fænotyper i eksisterende mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende vores finansieringskilde: NIH R01 EY05661 til J. E. H, Ines gehring for at hjælpe med at generere aqp0a/b dobbelt mutanter og: zebrafisk opdræt, Dr. Daniel dranow for diskussioner, der fører til generation af transgenics, Dr. Bruce Blumberg og Dr. Ken Cho's laboratorier for brug af deres dissekere mikroskoper, og Dr. Megan Smith for hjælp med statistisk analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21 °C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION - toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T.
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
- Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
