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Biology

Bewertung von Zebrafischen Lens Nukleus-Lokalisierung und Suturenintegrität

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Morphologie der kortikalen Linsen, die strukturelle Integrität der Nähte von Zebrafischen in festen und lebenden Linsen zu analysieren und die Position des Zebrafischlinsennkerns entlang der Anterior-nachträglichen Achse zu messen.

Abstract

Der Zebrafisch eignet sich eindeutig für die Genmanipulation und die In-vivo-Bildgebung und ist damit ein immer beliebter werdendes Modell für umgekehrte genetische Studien und für die Generierung von Transgenik für die In-vivo-Bildgebung. Diese einzigartigen Fähigkeiten machen den Zebrafisch zu einer idealen Plattform, um die Entwicklung und Physiologie der Augenlinsen zu untersuchen. Unsere jüngsten Erkenntnisse, dass ein Aquaporin-0, Aqp0a, für die Stabilität der vorderen Linsennaht sowie für die Verschiebung des Linsenkerns in das Linsenzentrum mit zunehmendem Alter erforderlich ist, haben uns dazu gebracht, Werkzeuge zu entwickeln, die besonders geeignet sind, die Eigenschaften von Zebrafischlinsen zu analysieren. Hier skizzieren wir detaillierte Methoden für die Linsenabtration, die sowohl auf Larven-als auch auf erwachsene Linsen angewendet werden können, um sie auf histologische Analysen, Immunhistochemie und Bildgebung vorzubereiten. Wir konzentrieren uns auf die Analyse der Linsen-Naht-Integrität und der kortikalen Zellmorphologie und vergleichen Daten, die aus zerschnittenen Linsen generiert werden, mit Daten, die aus der in vivo-Bildgebung gewonnenen Bildgebung der Linsenmorphologie gewonnen werden, die durch eine neuartige transgene Zebrafischlinie mit einer genetischen Kodiert fluoreszierenden Marker. Die Analyse von zersplitterten Linsen, die senkrecht zu ihrer optischen Achse stehen, ermöglicht eine Quantifizierung der relativen Position des Linsenkerns entlang der anterior-nachträglichen Achse. Die Bewegung des Linsenkerns von einer anfänglichen vorderen Position in die Mitte ist für die normale Linsenoptik bei erwachsenen Zebrafischen erforderlich. So korreliert eine quantitative Messung der nuklearen Position der Linse direkt mit ihren optischen Eigenschaften.

Introduction

Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und Physiologie aufgrund der anatomischen Ähnlichkeiten mit Säugetierlinsen, der relativen Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation, der Geschwindigkeit der embryonalen Augenentwicklung, der geringen Größe und Transparenz. In der Anfangsphase , die es in vivo der Bildgebung erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um die Morphologie der Zebrafischlinse in Embryonal-und Erwachsenenstadien zu analysieren, wobei der Schwerpunkt auf der heilsamen Integrität, der kortikalen Membranmorphologie in vitro und in vivoliegt, sowie die Lage der nuklearen Position der Linse entlang der Anterior-nachträgiere Achse ex vivo. Diese Methoden dienen als Ausgangspunkt für funktionelle Studien zur Linsenentwicklung und Physiologie sowie für umgekehrte genetische Bildschirme für Linsenphänotypen in Zebrafischen.

Bildgebung Zebrafisch-Linsenmorphologie

Aquaporin 0 (AQP0) ist das am häufigsten vorkommende Linsenmembranprotein und ist sowohl für die Entwicklung der Linsen als auch für die Klarheit der Linsen von entscheidender Bedeutung, da es bei Säugetieren viele wesentliche Funktionen gibt. Zebrafische haben zwei Aqp0s (Aqp0a und Aqp0b) und wir haben Methoden entwickelt, um den Verlust ihrer Funktionen sowohl in embryonalen als auch in erwachsenen Linsen zu analysieren. Unsere Studien zeigen, dass aqp0a---Mutanten aufgrund der Instabilität der vorderen Naht eine vordere polare Deckkraft entwickeln, und aqp0a/b Doppelmutanten die nukleare Deckkraft 1 entwickeln. AQP0 hat sich als eine Rolle im Wassertransport 2,Haftung3,4, Zytoskelett-Verankerung 5 und Erzeugung des Brechungsindex Gradienten6, aber diese Studien wurden weitgehend inder vitro. Der Zebrafisch bietet eine einzigartige Gelegenheit, zu untersuchen, wie Funktionsverlust, oder gestörte Funktion von Aqp0a oder Aqp0b die Morphologie und Funktion in einer lebenden Linse beeinflussen würde. Um die Morphologie der Linsenzellen und die Integrität der Sutural während der Entwicklung zu beurteilen, haben wir die bestehenden In-vitro-immunhistochemischen Methoden 7 für den Einsatz in embryonalen und erwachsenen Linsen modifiziert und Transgenik erzeugt, um diesen Prozess in vivo zu überwachen. .

Die immunhistochemische Analyse der Plasma-Membranstruktur und der sutural integtären Struktur wurde in ganzen festen Embryonen und erwachsenen Linsen durchgeführt. Zebrafischlinsen sind extrem klein (der Linsendurchmesser beträgt ~ 100 μm bei Embryonen und bei Erwachsenen bis zu 1 mm) im Vergleich zu ihren Säugetier-Pendants und haben Punktzahl8, die in Kryoschnitten selten erfasst werden. Daher sind ganze Objektive für die Analyse der Integrität des uturalen. Denn in vivo-Analyse der vorderen Nahtbildung und Abbildung der präzisen Linsenzellen-Architektur haben wir Transgenik erzeugt, die mApple-spezifisch kennzeichnende Linsenmembranen ausdrückt.

Die Vorteile der Live-Bildgebung von Objektivmembrantransgenik sind: 1) Vermeidung von Fixierungsarten, 2) das Studium dynamischer morphologischer Veränderungen in Zeitraffer-Filmen und 3) die Möglichkeit länglicher Studien, in denen frühere Ereignisse mit späteren Phänotypen. Die Pigmentierung der Iris verhindert in der Regel eine klare Abbildung der Linsenperipherie. Die Zugabe von 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) vor der Primordia-5 (Prim-5) Stufe9 verhindert Melanogenese und Augenpigmentierung bis zu etwa 4 Tagen Postfertilisation (dpf). Nach 4 dpf wird die Linsenperipherie jedoch in vivoverdeckt, besonders in älteren Stadien. Darüber hinaus verdeckt die Dichte der Linse selbst die Abbildung des hinteren Pols. Um die Morphologie der Linsenperipherie oder der hinteren Naht nach 4 dpf zu studieren, müssen die Linsen daher exzessiv und fixiert werden.

Mit transgenen Zebrafischlinien wurden die embryonalen Linsenmembranstrukturen in vivo10analysiert. Das transgene Q01 drückt ein cyan fluoreszierendes Protein aus, das zu einer Membranzielsequenz, Gap43, verschmolzen ist, angetrieben vom EF1 α-Promoter und einem Hexamer des DF4 pax6-Enhancer-Elements, das in Linsenfaserzellen 11 allgegenwärtig ist. Q01 hat einen extra-Lentikelausdruck, einschließlich Amacrin-Zellen in der Netzhaut, was Hintergrundsignal hinzufügt, wenn das primäre Interesse die Linse ist. Wir haben eine neuartige transgene Linie entwickelt, die einen Membran-gebärten mApple speziell in der Linse ausdrückt, mit dem Ziel, jedes extra-linsenförmige Signal zu vermeiden.

Lens nucleus Lokalisierung

Wir entdeckten, dass sich der Linsenkern von einer anfänglichen vorderen Position in Larvenzebrafischen zu einem zentralen Ort in der anterior-nachträglichen Achse in erwachsenen Linsen bewegt. Diese Verschiebung der Position des hochbrechenden Indexlinsenkerns gilt als Voraussetzung für die normale Entwicklung der Zebrafischlinsen-Optik1. Unsere Methoden ermöglichen die Quantifizierung der nuklearen Zentralisierung der Linse in Bezug auf den Linsenradius. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass Aqp0a für die Atomzentralisierung1benötigt wird, und diese einfache Methode kann auf andere Studien zur Entwicklung und Physiologie des Objektivs und seiner optischen Eigenschaften im Zebrafischmodell angewendet werden.

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Protocol

Die in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle halten sich an das ARVO-Statement für die Verwendung von Tieren in der Augen-und Sehforschung und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Irvine, genehmigt.

1. Zebrafisch Husbandry und Euthanasie

  1. Zebrafische (AB-Stamm) unter normalen Laborbedingungen zu züchten und zu pflegen12. Embryonen im Embryomedium (EM) 12erhöhen. Fügen Sie 0,003% PTU ab 20-24 h Postfrulisation (vor der Prif-5-Phase) zu EM hinzu, um die Pigmentbildung in Embryonen zu verhindern, die fürdie Bildgebung in den Embryonalstadien verwendet werden. Erhöhen Sie Larven von 6-30 Tagen Postfertilisation (dpf) auf eine Diät von lebenden Rotiferen bis 14 dpf, und leben Artemianach 14 dpf 12.
    CAUTION: PTU ist sehr giftig
  2. Fische mit Trikaine anästhetisieren, bis sie nicht ansprechbar sind.
    1. Bereiten Sie den Tricainbestand vor, indem Sie 400 mg 3-Aminino-Benzoikacidethylester mit 2,1 mL von 1 M Tris (pH 9), in 100 mL von ddH2O. PH 7,0.
      CAUTION: Tricaine ist giftig.
    2. Zonieren Sie 4,2 ml Trikaine-Bestand in 100 ml Tankwasser, um Larvae/Erwachsene zu betäuben oder in EM, um Embryonen zu betäuben (endgültige Konzentration von Trikaine bei 0,165% w/v).

2. Fixierung von Embryonen und Larven

NOTE: Immunhistochemische Protokolle wurden aus den zuvor veröffentlichten Materialien 7 angepasst.

  1. Fix dechorionierte Embryonen oder Larven bis zu 2 Wochen Postfertilisation in 4% (v/v) Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferten Saline (PBS) über Nacht bei 4 ° C auf einem Rocker.
    CAUTION: PFA ist brennbar und krebserregend.
  2. Embryonen dreimal für 10 min in PBS waschen und in PBS mit 10% Triton und 1% DMSO (PBS-T) über Nacht bei 4 ° C durchdringen.
    CAUTION: DMSO ist giftig, durch Einnahme oder Hautaufnahme schädlich, trägt gefährliche Stoffe durch die Haut und ist brennbar. Triton ist giftig, korrosiv und gefährlich für die aquatische Umwelt.

3. Dissection of Larval and Adult Zebrafish Linsen

  1. Anästhesieren Sie Fische von 6 dpf-Larven bis zum Erwachsenenalter mit Trikain bis hin zum Anfassen, aber dennoch mit einem starken Herzschlag. Messen Sie die Standardlänge des Fisches nach Schilling (2002)für die Inszenierung 13.
  2. Sofort mit Mikrodissektionschere die Augen abwechseln und in eine Sektionsschüssel in PBS (Abbildung 2 für erwachsene Augen) geben.
    1. Machen Sie eine individuelle 35-mm-Schale mit Silikon für Linsenabschnitte gefüllt. Sobald Silikon gesetzt ist, wird ein Divot mit einem Durchmesser von etwa 2-3 mm und einer Tiefe von 0,5 mm für die Immobilisierung erwachsener Eyeses/Linsen während der Trennung angeziert.
  3. Dissektion der erwachsenen Zebrafischlinsen
    1. Legen Sie ein erwachsenes Auge in das Gericht divot hintere Seite mit PBS gefüllt. Das Auge durch das Einsetzen von Zangen bei & lt;45 ° Winkel durch die Optikscheibe zu mobilisieren. Achten Sie darauf, das Objektiv nicht zu nicken oder zu komprimieren. Machen Sie zwei oder drei radiale Schnitte durch Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe in die Ziliarzone mit Sektionsschere.
    2. Die Netzhaut schälen und die Blütenblätter schälen und das Auge umdrehen, die Hornhaut nach oben. Wenden Sie die Linse indirekt durch Manipulation der Sklera und Hornhaut mit der flachen Seite der Schere, während Sie die Netzhaut und befestigte Gewebe mit Zangen wegziehen. Überschüssiges Gewebe vorsichtig aus der Linse schneiden.
      NOTE: Es ist wichtig, sorgfältig zu zerlegen, um durchweg gesunde Linsen zu erhalten.
  4. Dissektion der Larvenzebrafischlinsen
    1. Legen Sie eine Larval-Augenhinterseite nach oben auf den flachen Teil der Silikon-Schale mit PBS gefüllt und verwenden Sie eine geschärfte Wolfram-Nadel, um radiale Schnitte durch die Netzhaut und Sklera zu machen, während die Immobilisierung des Auges mit einer anderen Wolfram-Nadel oder Zangen.
      NOTE: Achten Sie darauf, dass Sie das Objektiv nicht beschädigen.
      1. Schärfen Sie die Spitze einer 2 cm langen Länge von 0,1 mm Wolframdraht elektrolytisch, indem Sie die Drahtspitze in 10% (w/v) NaOH aufsetzen und einen Niederspannungs-Wechselstrom14anwenden. Sichern Sie sich die Nadel in eine Pasteur-Pipette, indem Sie das Glasende mit einem Bunsenbrenner schmelzen.
        NOTE: Es können auch alternative Feinschnittswerkzeuge verwendet werden.
        CAUTION: NaOH ist korrosiv.
    2. Die Linse vorsichtig mit einer stumpfen Nadelseite aus dem distanzierten Auge ausstechen und das angeschlossene Gewebe vorsichtig wegziehen.

4. Fixierung von verseuchteten Linsen

  1. Die zerlegten Linsen in 1,5% (v/v) PFA in PBS für 24 h bei Raumtemperatur (RT) sofort fixieren. In PBS dreimal Linsen für jeweils 10 min waschen.
  2. Permeabilisize-Linsen für die gesamte Montageanalyse oder Kryooprotekte zur Kryosektion (siehe Abschnitt 8).
    1. Durchlässigkeit der Linsen in PBS-T über Nacht bei 4 ° C.

5. Lens Immunhistochemie

  1. Etikettenmembranen von festen Embryo/Larvalen oder erwachsenen Linsen durch Inkubation in Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) und Zellkernen mit DAPI (1:1000 von 5 mg/mL Stock) in PBS-T-Übernachtung bei 4 ° C.
    CAUTION: DAPI ist ein Haut-und Augenräuzstoff.
  2. Mit PBS-T dreimal für jeweils 10 min waschen. Klargewebe durch Inkubation in 30%, 50% und 70% Glycerin in PBS-T (v/v) für mindestens 1 h bei RT, oder über Nacht bei 4 ° C.
  3. Montieren Sie Fisch in 70% Glycerin in PBS-T (v/v) auf Glasboden 35 mm Mikrowell-Geschirr mit Augen so flach und gerade gegen den Deckel rutschen wie möglich. Bei jüngeren Fischen kann eine leichte Anterior-seitliche Neigung helfen, die Linsennaht parallel zum Kitzelzug zu orientieren.

6. Analyse von Zebrafischen Vorderlinsen Sutures Mit einer transgenen Linie in Vivo

  1. Erzeugen Sie Tg-Linien (βB1cry: mAppleCAAX) mit dem Tol2-Kit15. Das met2-transposable Elementsystem15 ermöglicht eine stabile Integration des Konstrukts, bei dem mApple von 300 bp des menschlichen βB1-kristallin-Promoters 16 angetrieben wird, der durch die CAAX-Sequenz an die Membran gebunden wird, was zum Ausdruck führt. Speziell in Linsenfaserzellmembranen.
    NOTE: Dieses Konstrukt (ID:122451) ist zum Kauf erhältlich.
    1. Am Morgen der Injektion, bereiten Sie die Injektionsmischung und halten Sie auf Eis. Um einen endgültigen Volumen von 10 μL mit RNase-und DNasefreien H2 O zuerreichen, Fügen Sie hinzu: 1,5 μL von hu βB1-Schrei: mAppleCAAX DNA-Konstrukt bei 50 ng/μL-[0,375-0,75 pg/Ende-Injektion], 1,5 μL von Tol2 Transposase mRNA bei 300 ng/μL (Tol2 Kit) 15 [15-30 pg/ Die Endspritze und 1 μL Phenol-roter Indikator bei 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/finale Injektion].
    2. Einspritzung 50-100 pL Injektionsgemisch in 1-Zell-Stage-Embryonen12.
  2. Messung der Transgenesis-Effizienz in F0 injizierten Embryonen durch Messung der Häufigkeit von Embryonen mit mApple-Positivlinsen bei 3 dpf.
    NOTE: Rechnen Sie damit, dass mit dieser Methode eine% gt;80 Transgenese-Effizienz erfolgen wird. F0-Mosaike ermöglichen eine detaillierte Analyse der Membranmorphologien einzelner Zellen. Die unterschiedlichen Ebenen des Mosaikismus erlauben es, die Morphologien einzelner oder kleiner Gruppen von Zellen darzustellen, während eine globalere Linsenexpression die Analyse von multizellulären Strukturen wie Linsennächten in vivo erlaubt.
  3. Outcross F0-Mosaikfische zur Erzeugung stabiler Linien, die alle Faserzellmembranen kennzeichnen. F0-Gründer mit dem in die Keimbahn integrierten Transgen generieren Nachkommen mit stabilen Integrationen, die als transgene Linien erhalten bleiben können.

7. Analyse von Zebrafischen Vorderlanden Sutures Mit einer transgenen Linie in Vivo

  1. Anästhesium 3 dpf oder erwachsene Mosaik oder stabile transgene Fische und montieren Sie in 1% niedriger Schmelzfläche (LMA) mit Tricaine mit dem Auge flach gegen den Deckungsrutsch von Glasboden Mikrowell-Gerichte.
    1. 1 g LMA in 100 mL EM (ohne Methylenblau) auflösen, um 1% LMA zu machen. Langfristig als 15 mL Vorrat bei 4 ° C. Mikrowelle, um den Vorrat aufzulösen und bei 42 ° C zu speichern, bis jedes Rohr verwendet wird.
  2. Bedecken Sie Fische bis zu 6 dpf mit EM mit Trikaine, oder mit Tankwasser mit Trikaine für Erwachsene, wenn LMA gesetzt wird.
    1. Mischen Sie 5 ml EM ohne Methylenblau oder Tankwasser mit 250 μL Tricainvorrat und 7 μL PTU, wenn PTU behandelten Fisch abgebildet.

8. Lens Cryosectioning und Immunhistochemie

  1. Cryoprotect fixe Embryonen oder erwachsene Linsen, indem sie in 10% Saccharose in PBS (w/v), 20% Saccharose für 1 h bei RT je (oder über Nacht bei 4 ° C) und über Nacht in 30% Saccharose bei 4 ° C.
  2. Das Gewebe in das OCT einbetten und dann mit OCT auf die Chucks einfrieren. Warme Abschnitte auf Rutsche für 10 Minuten auf einem Rutschwärmer auf ~ 35 ° C vorgewärmt.
  3. Mit PBS dreimal abwaschen, jeweils 10 min. Label-Abschnitte mit Phalloidin-Alexa Mehl 546 (1:200) mit DAPI (1:1000) oder WGA-Alexa Mehl 594 (1:200), gefolgt von drei PBS-Waschungen. Mit Anti-Fade-Beflademittel und Dichtkeillippe mit Nagellack montieren.

9. Bildgebung

  1. Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Erwerben Sie Z-Stapel oder optische Scheiben mit einem 60x N/A 1.2 Wassereintauchobjektiv oder ähnlichem an bestimmten Regionen vom vorderen bis zum hinteren Linsenpol. Verwenden Sie die folgenden Akquisitionseinstellungen: 1,2 luftige Disc mit dem 561 nm-Laser, Texas Rotfilter für Phalloidin-Alexa Mehl 546 oder mApple, oder der 405-Laser mit dem UV-Filter für DAPI.
  2. Die richtige Laserleistung der z-Intensität, um dem Signalverlust mit der Tiefe in die Linse entgegenzuwirken. Dies ermöglicht ein starkes Signal am hinteren Pol der fixen und lebenden 3 dpf-Embryonen und ein starkes Signal in äquatorialen optischen Scheiben in erwachsenen Fischlinsen.
  3. Kompilieren und betrachten Sie Bilder mit Hilfe von Bildbearbeitungssoftware.

10. Messung der Lens Nukleus-Lokalisierung in der Anterior-nachträglichen Achse

  1. Orient frisch ausgescannte Linsen axial in PBS in einer 35-mm-Schale mit einem Deckglasboden, mit Stöcken und Nähten, die parallel zur Fokusebene ausgerichtet sind. Suchen Sie nach einem Unterschied im Brechungsindex, der normalerweise an der Schnittstelle von Linsenkortex und Linsenkern auftritt, um den Linsenkern zu identifizieren.
    NOTE: Gesunde, wilde, wilde Objektive vom Typ Erwachsene sind extrem transparent, so dass es schwierig ist, die Nähte und den Kern der Linse zu sehen oder die Orientierung des Objektivs zu bestimmen. In diesem Fall verursacht ein leichtes Nicken mit Zangen an der Linsenkapsel kleinere Schäden, was die Nähte und den Linsenkern in etwa 10 Minuten sichtbar macht und hilft, das Objektiv für diese Messung zu orientieren. Allerdings werden die Objektive für nachgelagerte Anwendungen unbrauchbar, da sie nun beschädigt sind.
  2. Nehmen Sie Bilder von Objektiven mit dem Linsenkern im Fokus unter heller Feldbeleuchtung mit oder ohne DIC-Optik mit einem Trennmikroskop mit einer angehängten Kamera. Bilden Sie einen Mikrometer unter der gleichen Vergrößerung für die Kalibrierung.
    1. Klicken Sie auf die Live-View-Button, passen Sie die Belichtungseinstellungen an, um den Linsenkern und die Linsenperipherie zu visualisieren, und nehmen Sie ein Bild, indem Sie auf den Schnappschuss-Button klicken. Speichern Sie als Motiv-Datei.
    2. Verwenden Sie die Bildbearbeitungssoftware, um die erfassten Objektivbilder zu kalibrieren. Wählen Sie das geradlinige Werkzeug und zeichnen Sie eine Linie von bekannter Länge auf dem Mikrometer-Bild, klicken Sie auf Analyse | Die Skala. Geben Sie bekannte Distanz, Einheiten und wählen Sie "globale" Kalibrierung, und klicken Sie auf OK.
  3. Messen Sie den Abstand der Mitte des Linsenkerns zum vorderen Pol (a-r).
    1. Verwenden Sie das geradlinige Werkzeug in der Bildverarbeitungssoftware, um eine Linie über das abgebildete Zentrum des Linsenkerns in einer axialen Ausrichtung zu ziehen. Nehmen Sie die Mitte dieser Linie als die Mitte des Linsenkerns.
    2. Ziehen Sie eine weitere Linie von diesem Punkt auf den vorderen Pol des Objektivs und wählen Sie "Maß" im Menü "analysieren", um den Abstand (a-r) zu messen, wobei a der Radius der Linse ist und r ist der Abstand von der Mitte des Objektivs zur Mitte des Objektivs der Kern.
    3. Ziehen Sie eine weitere Linie von der Vorderseite bis zu den hinteren Polen und messen Sie diesen Abstand als Objektivdurchmesser (2a). Kopieren Sie diese Längen aus dem "Ergebnisfenster" und übertragen Sie auf ein Tabellenkalkulations-oder Statistikprogramm.
      NOTE: Es ist einfacher, von der Mitte des Kerns bis zum vorderen Pol präzise zu messen, als von der Mitte des Linsenkerns bis zur Mitte der Linse. Diese Messung wird durch die Formel in Schritt 10.3.5 umgewandelt, um den Abstand der Mitte des Objektivkerns zur Mitte des Objektivs zu melden. Verwenden Sie den erwachsenen Kern immer für Messungen, auch wenn der embryonale Kern offensichtlich ist.
    4. Teilen Sie den Durchmesser durch 2, um den Linsenradius zu berechnen, a.
    5. Berechnen Sie r/,da Equation 1 es sich um die normalisierte Lokalisierung des Objektivkerns in Bezug auf den Linsenradius handelt.
      NOTE: Für einen Kern, der näher an den vorderen Pol gelegt wird, wird r/und gt;0.0, während ein zentral lokalisierter Kern eine r/a von 0.0 haben wird.
  4. Graphen Sie das Protokoll der normalisierten Axialkernmessung als Funktion der Standardlänge, um Veränderungen in der Linsenkernlokalisierung während der Zebrafischentwicklung zu bestimmen.

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Representative Results

Erwachsene Zebrafische Augenanatomie ähneln der von Säugetieren (Abbildung 1A). Trotz einiger Unterschiede zwischen Zebrafischen und Säugetieren Augen, wie mit einer Ziliarzone statt mit einem Ziliarkörper 17,Unterschiede in den optischen Eigenschaften18, und Unterschiede in der Morphogenese während der Embryonalentwicklung 19, die Zebrafischauge ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Augenentwicklung und das Verständnis der Augenkrankheit20,21, 22. Ein einfaches Epithel reißt den vorderen Pol der Linse, der am Äquator einen lebenslangen Prozess der Vermehrung, Dehnung und Differenzierung in Faserzellen durchläuft, die den Großteil der Linse bilden. Reife Faserzellen (Abbildung 1B, hellblau) unterscheiden sich zunächst im Embryo, sind organellfrei und werden nie ersetzt. Differenzierende Faserzellen-Spitzen treffen sich an den Polen, um die vorderen und hinteren Nähte zu formen. Diese Zellen werden dann durch neu differenzierte Faserzellen verinnerlicht. Wie alle Wirbellinsen hat auch die Zebrafischlinse mit den ältesten Zellen in der Mitte des Linsenkerns einen Entwicklungsverlauf. Die Zebrafischlinsen-Placode bildet sich bei 16 h Postfertilisation (hpf), die sich zu den primären Linsenfasern mit 18 hpf verlängert, und Sekundärfasern bilden die Übergangszone bei 28-36 hpf. Die hintere Naht ist bei 48 hpf sichtbar, also vor der vorderen Naht wird 10 sichtbar.

Die präzise Entwicklung und Pflege der regulären Objektivarchitektur ist für die Optik unerlässlich. Hier beschreiben wir Methoden zur Analyse der Zebrafischlinsen-Zellmorphologie in vitro und in vivo, einschließlich sowohl Vorteile als auch Einschränkungen, die wir entwickelt haben, um Phenotypen zu analysieren, die aus Funktionsverlust von Mutanten zweier Zebrafische Aqp0s resultieren, Aqp0a und Aqp0b1. Zur Beurteilung der erwachsenen Linsenmorphologie in vitrowurden Linsen zerlegt (Abbildung 2) und sofort fixiert. Die embryonale Bewertung wurde in ganzen festen Embryonen (Abbildung 3) durchgeführt und mit lebenden transgenen Embryonen verglichen (Abbildung4). Zerstreute und fixierte Erwachsenenlinsen (Abbildung 5) wurden mit transgenen erwachsenen Linsen verglichen, die live abgebildet wurden (Abbildung6). Unterschiede in der Erkennung und Visualisierung bestimmter Teile des Objektivs mit diesen Methoden werden zusammengefasst (Tabelle 1).

Phalloidin wurde als überlegen für die Kennzeichnung von Linsenfaserzellmembranen in Zebrafischen im Vergleich zu Weizenkeimen Agglutinin (WGA) festgestellt. WGA ist ein Leptin, das an N-Acetyl-D-Glucosamin und Sialinsäure bindet, und WGA, die zu Fluorophoren konjugiert wird, wird in der Regel verwendet, um Linsenfaserzellmembranen inmenschlichen23, Rindern 24, Eizine25, Maus 26, Ratte27 und Zebrafisch28,29. Hier verwenden wir Phalloidin auf ganzen Zebrafischlinsen (Abbildung 3, Abbildung 5).

Embryonale und Larven-Zebrafischlarven bis zu 7 dpf sind klein und durchlässig genug, um das Eindringen von Phalloidin in den äußeren Kortex der Linse zu ermöglichen. Mit 3 dpf ist der Linsenkern kompakt und organellfrei, vordere Nähte bilden sich am vorderen Pol (Abbildung 3A, B),undPhalloidin wird in einer äquatorialen optischen Ebene (Abbildung 3C,D) aus dem Linsenkern ausgeschlossen. Phalloidin ist aufgrund der hohen Verdichtung von Faserzellmembranen, im Einklang mit früheren Studien 28, wahrscheinlich aus demZellkern ausgeschlossen. Der äußere Kortex wird jedoch mit dieser Färbung sehr detailliert visualisiert (Abbildung 3C-F). Im Querschnitt nehmen Faserzellen eine abgeflachte sechseckige Form an, mit längeren breiten Seiten und kürzeren schmalen Seiten. Phalloidin kennzeichnet sowohl die schmalen als auch die breiten Faserzellmembranen (Abbildung 3E-F), die die Verdichtung der kortikalen Faserzellen zwischen breiten Seiten hervorheben. Diese Organisation ist in aqp0a/b Doppelmutanten (Abbildung 3B, D, Fund H ) weitgehend unberührt.

Die mosaische Expression des Transgens (mApple, das durch das CAAX-Motiv, das von einem 300 bp-Promoter-Gebiet des menschlichen β-B1-kristallinen Promoters angetrieben wird, an die Zellmembran gebunden ist) drückt sich stark in Linsen aus, die bei 2 dpf beginnen. Das Transgene ist zufällig in das Genom integriert, was zu einer heterogenen Expression von mApple führt. Wir zeigen Beispiele für ein 3-dpf-Objektiv mit starkem Ausdruckim Kortex (Abbildung 4) und Ausdruck in Teilen des Kerns (Abbildung 4D). Die Membranmarkierung ist nicht durch Durchlässigkeit wie Phalloidin begrenzt, so dass sie den Linsenkern kennzeichnet. Mosaiken (Abbildung 4), die durch DNA-Injektionen erzeugt werden, die nur in einer kleinen Teilmenge von Zellen ausgedrückt werden, sind nützlich für die Analyse einzelner Zellmorphologien im Vergleich zu stabilen Linien, die jede Zelle, die βB1-Kristallin ausdrückt, kennzeichnen (Abbildung 6). In Tg (βB1cry: mAppleCAAX) mosaiken kann die Morphologie der vorderen Naht in z-Projektionen am vorderen Pol (Abbildung 4A,B) visualisiert werden. Beachten Sie, dass die Morphologie der Zellmembranen von festen Linsen unterscheidet, die mit Phalloidin (Abbildung 3A, B) gekennzeichnet sind, und dem Vorhandensein von Subdomänen in breiten Zellmembranen (Abbildung 4a' weiße Pfeile), die zuvor in Linsen von anderen identifiziert wurden. Die Art30 ist sichtbar. Die schwächere Beschriftung der schmalen Faserzellmembranen führt jedoch dazu, dass die markante Konvergenz der Zellen an der Vorderseite der Naht(Abbildung 4A , B-Pfeil) in festen Linsen mit Phalloidin gekennzeichnet ist (Abbildung 3A, B). Pfeile).

Interessanterweise zeigen optische Scheiben, die am Objektiväquator aufgenommen werden, auch ein anderes Kennzeichnungsmuster, mit offensichtlichen Störungen des Zellvolumens in den aqp0a/b Doppelmutanten im Vergleich zu WT (Abbildung 4C-F). Dies ist wahrscheinlich, weil die transgenen Etiketten breite Faserzellmembranen effektiver als Phalloidin. Wir waren in der Lage, z-Projektionen durch den hinteren Pol zu erhalten, um die Integrität der hinteren Naht mit Hilfe von Z-Korrektur zu analysieren, die die Laserleistung mit der Tiefe in Gewebe erhöhte. Die klare Analyse der hinteren Naht (Abbildung 4G,H) in intakten Fischen beschränkte sich auf die ersten 5 dpf, und danach war die Linse zu dicht, was zu einem Signalverlust im hinteren Teil der Linse führte.

Die mit Phalloidin beschrifteten Objektive aus erwachsenen Gebäuden offenbarten ein auffälliges Detail in der hoch geordneten Architektur der Faserzellenreihen, die sichzu vorderen Nähten (Abbildung 5A, Pfeil) und Morphologie des Cortex zusammenschlossen (Abbildung 5C-H), Durch die sehr starke Beschriftung der schmalen Faserzellmembranen durch Phalloidin. Maximale Z-Projektionen des vorderen Pfostens zeigten den Verlust einer engen vorderen Naht in aqp0a/b Doppelmutanten-Linsen (Abbildung 5B, Pfeil), im Vergleich zu WT (Abbildung5A, Pfeil), die als Masse von Membranen und Zellkernen in optischer Scheiben 30 μm vom vorderen Pol (Abbildung 5D). In tieferen optischen Scheiben wurde die Phalloid-Kennzeichnung aus dem tieferen Linsenkortex und Kernausgeschlossen (Abbildung 5E,F). Die Gesamtorganisation der Faserzellreihen im äußeren Kortex wurde durch das Fehlen einer engen vorderen Naht in aqp0a/b Doppelmutanten-Linsen etwas beeinträchtigt, so dass es unmöglich war, die Linsen genau senkrecht zur Bildfläche zu positionieren (Abbildung 5F). ) im Vergleich zu WT-Objektiven (Abbildung 5E). Hohe Leistungsbilder von Faserzellreihen, die in der Äquatorialebene aufgenommen wurden, zeigten jedoch, dass Zellen im äußeren Kortex noch geordnete Reihen bildeten, die durch eine starke enge Faserzellbeschriftung sichtbar waren (Abbildung 5G,H). Durch eine Kombination aus enger Verdichtung und schwachem Signal war es nicht möglich, einzelne Faserzellbreiten Membranen zu erkennen. Da diese Linsen zerlegt wurden, konnten sie mit der hinteren Seite, die dem Objektiv zugewandt war, montiert werden, so dass z-Projektionen der hinteren Nähte, die keine Unterschiede zwischen den Genotypen zeigten, da die hinteren Faserzellspitzen enge Nähte bildeten (Abbildung 5I,J Pfeile).

Z-Projektionen von Linsen des lebenden, anästhesierten erwachsenen Stalls Tg (βB1cry: mAppleCAAX) Fische zeigen die kortikale Membranmorphologie im vorderen Kortex (Abbildung 6A,a '), sowie das Ausmaß der Zellkonvergenz am vorderen Pol ( Abbildung 6B). Schwieriger war es, die Fische mit Linsennächten senkrecht zur Bildfläche zu montieren, im Vergleich zu festen, zerlegten Linsen. Stabile Linien, die den Transgene tragen, drücken mApple im Linsenkern aus (Abbildung 6C,D). Optische Scheiben am Äquator zeigten ein starkes Signal, das auf eine umfangreiche Verdichtung des Kerns hinweist, wenn sie mit der gleichen Laserleistung wie der vordere Kortex abgebildet wurden (Abbildung 6C). Interessanterweise war bei Erwachsenen, anders als bei Embryonen, keine zelluläre Auflösung des äußeren Kortex erkennbar. Dies ist wahrscheinlich, weil die Iris ein klares Signal von der Linsenperipherie blockiert. Es kann möglich sein, ein stärkeres kortikales Linsensignal durch Vergrößerung des Schülers vor der Bildgebung zu erhalten. Mit reduzierter Laserleistung konnte man einige Zellschichten im Linsenkern unterscheiden (Abbildung 6D). Die erwachsene Zebrafischlinse ist sehr dicht, und es war unmöglich, Signal aus dem hinteren Pol in vivozu erhalten.

Wir haben gezeigt, dass sich der Zebrafisch-Linsenkern in der optischen Achse von einer anfänglichen vorderen Position in Larvalllinsen zu einerzentralen Position bei Erwachsenen 1 bewegt. Diese Bewegungen werden in Axiallinsenabschnitten hervorgehoben, da Phalloidin und WGA aus dem Linsenkern ausgeschlossen sind (Abbildung7A-C). Wir haben gezeigt, dass Aqp0a für diesen Zentralisierungsprozess1 benötigtwird, aber dieser Mechanismus wird wahrscheinlich von anderen Proteinen beeinflusst werden. Die Lokalisierung des Zentrums des Linsenkerns in Bezug auf seine Position entlang der anteriorberen Achse wurde gemessen, indem zerlegte ganze Linsen in ihre axiale Ausrichtung und Bildgebung unter die DIC-Beleuchtung gestellt wurden, wodurch leichte Unterschiede in der Brechungseigenschaften (Abbildung 7E). Die Nähte haben in der Regel einen anderen Brechungsindex als der umgebende Kortex, können also als Orientierungshilfe dienen. Junge Larvenlinsen haben offensichtlichere Nähte (nachträgliche Nähte bei sehr jungen Linsen), und Linsenkerne, die einen anderen Brechungsindex haben, sind offensichtlich asymmetrisch, was es einfacher macht, Linsen in diesen Stadien zu orientieren. Der relative Abstand der Mitte des Linsenkerns von der Mitte des Objektivs (r) wird auf den Linsenradius (a) normalisiert. Diese wird dann in Bezug auf die Entwicklung von Zebrafischen, für die Standard-Längenmessung 13 verwendet wird,dargestellt. Im WT beginnt der Linsenkern Equation 2 näher an der vorderen Linsenstange und zentralisiert sich dann im Erwachsenenalter ( Equation 3 Abbildung7F).

Figure 1
Bild 1 : Zebrafische Erwachsene Augen-und Linsendiagramm. Vor dem Auge wird das Licht als das Auge genommen, das im Zebrafisch eigentlich seitlich ist. (A) Die Zebrafischlinse zusammen mit dem Hornhautfokuslicht auf die Netzhaut. Bei Wassertieren spielt die Hornhaut bei der Lichtbrechung eine untergeordnete Rolle, stattdessen hat die Linse einen höheren Brechungsindex18. Die Linse trennt die vordere Kammer, die mit wässrigem Humor und hinterem Körper gefüllt ist. (B) Die Zebrafischlinse ist sphärischer als Säugetierlinsen. Faserzellen-Spitzen treffen an den vorderen und hinteren Polen an Punktoder Nabelsen 8. Differenzierende Faserzellen im Linsenkortex haben Kerne und Organellen, während reife Faserzellen im Linsenkern (hellblau) frei von Organellen und Kernen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.    

Figure 2
Bild 2 : Zebrafischlinsen-Linsenabteil. (A) Die Augen werden von den betäubenden Fischen getrennt und auf der hinteren Seite nach oben (B) gestellt. (C) Die Augen werden durch Zangen über die optische Scheibe (od) immobilisiert und zwei bis drei radiale Schnitte werden in Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe bis zu den Zoneln gemacht. D) Falten Sie die Klappen aus, um die Linse zu zeigen. (E) Drehen Sie das Auge um die Hornhaut nach oben, immobilisieren Sie die Linse indirekt über die Hornhaut und ziehen Sie die Sklera-Netzhaut weg. (F) Die verbleibenden Netzhaut und die Ziliarenzone/Zoneln aus der Linse entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Bild 3 : Embryonale Linsenmorphologie in vitro. Feste und durchlässige Embryonen, die mit Phalloidin (rot) und Zellkernen mit DAPI (blau) gekennzeichnet sind, zeigen Membranmorphologie und Nahtintegrität an den Polen. Z-Projektionen zeigen, dass WT und aqp0/b Doppelmutant-Objektive eine sehr regelmäßige Faserzell-Anordnung aufweisen, die bei einer sehr engen Vorderseite (Pfeile) bei 3 dpf (A, B)aufeinandertreffen. Optische Scheiben, die am Äquator aufgenommen werden, zeigen enge Reihen von sechseckigen Faserzellen, die in beiden Genotypen (C-F) im äußeren Kortex verpackt sind. Sowohl die schmalen als auch die breiten Seiten der Faserzellmembranen sind wie in (E) dargestellt gekennzeichnet. In beiden Genotypen (G,H) werden Posterioruturen (Pfeile) gebildet und eng. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Bild 4 : Embryonale Linsenmorphologie in vivo. Live-Bildgebung von anässierten 3 dpf Mosaik F0 injizierte Tg (βB1cry: mAppleCAAX) Linsen zeigen vordere Nähte (Pfeile) in z-Projektionen (A, B). (a ') Membransubdomänen werden als Pünktchen (weiße Pfeile) in breiten Faserzellmembranen sichtbar. Schmale Faserzellmembranen sind ebenfalls sichtbar (schwarze Pfeile). Die WT-Linsen zeigen fest verpackte Linsen-Kortikaserzellen (C, E) im Vergleich zu einem gestörten Kortex von aqp0a/b Doppelmutanten-mit offensichtlichen geschwollenen Zellen (D, F). Die Fokussierung auf nachträgliche (G, H) Nähte (Pfeile) zeigt keinen Unterschied zwischen den Genotypen (G, H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 5
Bild 5 : Adultäre Linsenmorphologie in vitro. Die gepolenen, fixierten und durchlässigen Linsen von Fischen über 23 mm Standardlänge wurden mit Phalloidin (rot) und DAPI (blau) gekennzeichnet. 150 μm Z-Projektion am vorderen Pol zeigt eine strenge Anordnung von Faserzellen-Spitzen, die bei einer engen Naht (Pfeil) in WT (A) zusammenlaufen, aber nicht aqp0a/b Doppelmutanten (Pfeil), die stattdessen eine Masse von Membranen und Nuklei (B) haben. Eine optische Scheibe, die 42 μm aus dem vorderen Pol genommen wird, offenbart geordnete Zellen, die sich in der Mitte in WT (C) zusammenfügen, aber eine Masse von Kernen, bei denen die Naht in Mutantenlinsen (D) sein sollte. Optische Scheiben durch den Äquator des Objektivs, bei 130 μm vom vorderen Pol, zeigen dicht gepackte Reihen von Faserzellen in WT (E, G) und Mutanten (F,H). Posterioruturen (Pfeile) werden in beiden Genotypen (I, J)geformt und eng. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 6
Bild 6 Adulte Linsenmorphologie in vivo. Live-Abbildung von anässitisierten erwachsenen stabilen Tg (βB1cry: mAppleCAAX) WT-Objektive. Z-Projektionen am vorderen Kortex zeigen die kortikale Morphologie (A, a ') und die vordere Naht (Pfeil), wobei die Zellen in einer einzigen optischen Scheibe (B, Pfeil) zu einem Punkt zusammenlaufen. Der Kortex kann bei höherer Laserleistung in einer optischen Scheibe durch den Äquator (C) visualisiert werden, verglichen mit dem stärkeren Signal aus dem Linsenkern (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 7
Bild 7: Zebrafischlinsenlinsen-Zentralisierung. Feste und kryoförmige Embryonen (A)und Linsen (B, C) wurden axial kryo-Sektorin und mit Phalloidin-546 (rot in A, B), DAPI (blau in A, B) oder WGA-594 (rot in C)gekennzeichnet. Der Linsenkern ist frei von Zellkernen und wird näher an die vordere (a) Linse mit 3 dpf (A) und in 1 Monat alten Linsen (B) gelegt, im Vergleich zu zentral in erwachsenen Linsen (C). Abgetrennte Linsen aus einem 1 Monat alten Zebrafisch von 4,1 mm Standardlänge wurden gleichmäßig (D) oder axial (E) ausgerichtet. Die relative Lokalisierung des Linsenkerns in der Achse wurde mit folgender Strategie berechnet: (E) Der Abstand des Zentrums (*) des Linsenkerns (weiß gestrichelte Linie) wurde am vorderen Pol gemessen, da dies praktischer ist als die Messung der Abstand (r) zur Mitte des Objektivs (plus). Diese wurde auf den Linsenradius (a) normalisiert, der als axialer (Ant.-pos.) Linsendurchmesser gemessen wurde. Das Protokoll der normalisierten Axialkernlokalisierung wurde als eine Funktion der Zebrafischentwicklung, gemessen an der Standardlänge (F), dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

das Merkmal IHC Embryo Tg Embryo Ganze IHC-Erwachsenenlinse Tg erwachsene
leben N Y N Y
Vorderliche Naht Y etwas Y etwas
Posterior-Suture Y Y Y N
Kortikale Zelldetails etwas Y Y Vorwärts etwas
Lens nukleus detail N Y (stabil) N Y (stabil)
Sekundärkennzeichnung Y-Antikörper Nur mit Tg leben Y-Antikörper Nur mit Tg leben
Broad/Narrow Faserlabel beide Breit Meist schmal Breit

Tabelle 1: Zusammenfassung des Vergleichs von in vivo vs in vitro Methoden zur Analyse der Linsenmorphologie im Zebrafisch. Y = Ja, N = Nein

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Discussion

Die Analyse der Zebrafisch-Linsenmorphologie ist der erste Schritt, um Phenotypen bei Mutanten zu verstehen, oder die Auswirkungen pharmakologischer Eingriffe, die auf die Erforschung der Biologie der Augenlinse abzielen. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Linsennähten, kortikalen Faserzellmorphologie und Aspekten des Linsenkerns. Diese Ansätze sind eine Kombination von in vitro und in vivo (im Vergleich in Tabelle 1). Die In-vitro-Methoden ermöglichen eine größere Detailgenauigkeit der äußeren kortikalen Zellmorphologie sowie den Zugang zur hinteren Naht in erwachsenen Linsen.

In vivo ist eine Analyse mit Hilfe von transgenen Markern möglich. Das Transgen, das wir hier einführen, ist eine Linsenmembran , die spezifisch ist, im Vergleich zur bestehenden Zebrafischlinie Q01, die bei der Kennzeichnung der Linsenmembranen auch andere Zelltypen im Auge kennzeichnet, einschließlich Amacrine-Zellen, was die Interpretationerschwert 11 . Das In-vivo-Signal wird durch das pigmentierte Epithel des Auges begrenzt, das sich am zweiten Tag der Embryogenese bildet, so dass Embryonen in diesem und weiteren Stadium zur Analyse PTU behandelt werden müssen. Bei Erwachsenen verdeckt die Iris eine klare Analyse des Linsenkortex, erlaubt aber in vivo eine Analyse des vorderen Linsenkortex. Die Live-Abbildung von Fischlinsen ermöglicht Längsschnittstudien der Linsenmorphologie im gleichen Tier. Dies kann ein äußerst nützliches Werkzeug sein, um Effekte auf dynamische Prozesse zu untersuchen, wie etwa Zellvolumenunterbrechungen als Reaktion auf osmotische oder pharmakologische Störungen. Ein unerwarteter Befund ist, dass wir die Membransubdomänen in breiten Faserzellmembranen in den lebenden Larventransgenik, aber nicht in festen Linsen, klar visualisieren können. Dies zeigt den Unterschied bei der Kennzeichnung durch das Transgen und Phalloidin sowie die Tatsache, dass diese Subdomänen durch den Fixierungsprozess beeinflusst werden können.

Die Analyse der molekularen Mechanismen der Zentralisierung des Linsenkerns mit den von uns beschriebenen Methoden kann Mechanismen aufdecken, die für die Entwicklung optischer Eigenschaften der Linsen unerlässlich sind. Obwohl bis heute die Axiallinsenkern-Asymmetrie nur bei Zebrafischen gemeldet wurde, werden wir durch die Untersuchung dieses Prozesses wahrscheinlich Einblicke in die Mechanismen gewinnen, die für die Entwicklung der Linsenoptik bei anderen Arten erforderlich sind. Künftig können die transgenen Tiere in Kombination mit anderen Anwendungen eingesetzt werden-etwa mit Überexpression von Studien, mit dem Einsatz eines grünen Transgenesmarkers. Diese könnten verwendet werden, um die Auswirkungen einer Überausdrückung eines bestimmten Proteins in der Linse zu untersuchen, oder um Phenotypen in bestehenden Mutanten zu retten.

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Disclosures

Wir haben keine Enthüllungen.

Acknowledgments

Wir möchten unsere Finanzierungsquelle würdigen: NIH R01 EY05661 an J.E.H, Ines Gehring für die Unterstützung bei der Generierung der aqp0a/b Doppelmutanten und Zebrafischhaltung, Dr. Daniel Dranow für Diskussionen, die zur Generierung der Transgenik führen, Dr. Bruce Die Labore von Blumberg und Dr. Ken Cho für die Verwendung ihrer sektoralen Mikroskope und Dr. Megan Smith für die Hilfe bei der statistischen Analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

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Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

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