Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

פרוטוקולים אלה פותחו כדי לנתח מורפולוגיה עדשה קורטיקלית, שלמות מבנית של התפרים העדשה דג זברה בעדשות קבועות וחיות למדוד את המיקום של גרעין העדשה דג זברה לאורך הציר האחורי הקדמי.

Abstract

דג דג זברה מתאים באופן ייחודי מניפולציה גנטית vivo הדמיה, מה שהופך אותו מודל פופולרי יותר ויותר עבור מחקרים גנטיים הפוכה ועבור דור של transgenics עבור הדמיה vivo . אלה יכולות ייחודי להפוך את דג זברה פלטפורמה אידיאלית כדי ללמוד התפתחות עדשה עינית ופיזיולוגיה. הממצאים האחרונים שלנו כי aquפורטל in-0, Aqp0a, נדרש עבור היציבות של תפר העדשה הקדמית, כמו גם עבור שינוי של גרעין העדשה אל מרכז העדשה עם הגיל הובילו אותנו לפתח כלים במיוחד מתאים לנתח את המאפיינים של עדשות דג זברה. כאן אנו מתווה שיטות מפורטות לניתוח עדשות שניתן להחיל הן על הזחל והן עדשות למבוגרים, כדי להכין אותם ניתוח היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה והדמיה. אנו מתמקדים בניתוח של שלמות תפר עדשה ומורפולוגיה תא קורטיקלית ולהשוות נתונים שנוצרו מעדשות גזור עם נתונים שהתקבלו מתוך vivo הדמיה של מורפולוגיה עדשה האפשרי על ידי קו מגנטי הרומן הטרנסגניים עם מגנטית סמן פלורסנט מקודד. ניתוח לגזור עדשות בניצב הציר האופטי שלהם מאפשר כימות של המיקום היחסי של גרעין העדשה לאורך הציר הקדמי האחורי. התנועה של הגרעין העדשה מעמדה קדמית ראשונית למרכז נדרש עבור עדשה רגילה אופטיקה בוגרים zebrafish. כך, מידה כמותית של העמדה הגרעינית עדשה במישרין ישירות עם תכונות אופטיות שלה.

Introduction

דג דג זברה הוא מודל מעולה ללמוד פיתוח עדשות ופיזיולוגיה בשל הדמיון האנטומי לעדשות היונקים, קלות יחסית של מניפולציה גנטית ופרמקולוגית, מהירות של פיתוח עיניים עובריים, גודל קטן ושקיפות בשלבים המוקדמים המאפשרים הדמיה vivo . השיטות המתוארות כאן פותחו כדי לנתח את מורפולוגיה עדשה של דג דג זברה ב שלבים עובריים ומבוגרים עם דגש על שלמות sutural מורפולוגיה קרום הקליפת בתוך מבחנה ב vivo, ומיקום של מיקום העדשה גרעינית לאורך ה הצירים האחוריים לשעבר vivo. שיטות אלה משמשות כנקודת התחלה עבור מחקרים פונקציונליים של פיתוח עדשות ופיזיולוגיה, כמו גם מסכי גנטי הפוכה עבור פנוטיפים עדשה ב-zebrafish.

דימות מורפולוגיה של עדשות ההדמיה

אקופורטל 0 (AQP0) הוא חלבון ממברנה שופע ביותר העדשה הוא קריטי עבור הן, פיתוח עדשה ובהירות, בשל פונקציות חיוניות מרובות יונקים. Zebrafish יש שני Aqp0s (Aqp0a ו Aqp0b) ואנחנו פיתחנו שיטות לנתח את האובדן של הפונקציות שלהם בעדשות עובריים ולמבוגרים. מחקרים שלנו לגלות כי aqp0a-/-מוטציות לפתח אטימות הקוטב הקדמי עקב חוסר יציבות של תפר קדמי, ו aqp0a/b מוטציות כפולות לפתח אטימות גרעינית1. AQP0 הוכח לשחק תפקידים בתחבורה מים2, הדבקה3,4, השלד הציטומי עיגון5 והדור של מדד השבירה הדרגתי6, אבל מחקרים אלה בוצעו בעיקר ב . בעלי מבחנה דג דג זברה מספק הזדמנות ייחודית ללמוד כיצד אובדן פונקציה, או פונקציה מודאג של Aqp0a או Aqp0b ישפיע על מורפולוגיה ותפקוד בעדשה חיה. כדי להעריך מורפולוגיה של תא עדשה ושלמות sutural במהלך הפיתוח, אנו שונו הקיים שיטות מחוץ לתחום האימונוהיסטוכימיה7 לשימוש בעדשות עובריים ומבוגרים, ו transgenics שנוצר כדי לפקח על תהליך זה vivo .

אימונוהיסטוכימיה ניתוח של מבנה קרום הפלזמה ויושר שלמות התבצע בעוברים קבועים שלמים ועדשות מבוגרים. עדשות zebrafish הם קטנים מאוד (קוטר העדשה הוא ~ 100 יקרומטר בעוברים ועד 1 מ"מ בקרב מבוגרים) לעומת עמיתיהם היונקים שלהם יש תפר נקודה8, אשר נלכדו לעתים רחוקות ב קריודורים. לכן, עדשות שלמות חיוניים לניתוח שלמות. עבור בניתוח vivo של היווצרות תפר הקדמי, והדמיה של אדריכלות תא עדשה מדויקת, יצרנו transgenics המבטא mapple תיוג במיוחד ממברנות עדשה.

היתרונות של הדמיה חיה של העדשה ממברנה transgenics כוללים: 1) הימנעות ממצאים קיבעון, 2) לימוד שינויים דינמיים מורפולוגית בסרטים הזמן פקיעה, ו 3) המאפשר מחקרים האורך שבו ניתן לתאם אירועים מוקדמים יותר פנוטיפים. פיגמנטציה של הקשתית בדרך כלל מונע הדמיה ברורה של הפריפריה העדשה. תוספת של 1-פניקסיל 2-thiourea (PTU) לפני הפרידייה-5 (פרים-5) שלב9 מונע מלאנוגנזה ועין פיגמנטציה עד סביב 4 ימים הפריה (dpf). עם זאת, לאחר 4 dpf, הפריפריה העדשה מטושטשת בvivo, במיוחד בשלבים הישנים. יתר על כן, הצפיפות של העדשה עצמה מטשטש הדמיה של הקוטב האחורי שלה. לכן, כדי ללמוד מורפולוגיה של הפריפריה העדשה, או את התפר האחורי, לאחר 4 dpf, עדשות צריך להיות מסודר וקבוע.

שורות הטרנסגניים משמשות לניתוח מבנה קרום העדשה העובריים ב vivo10. Q01 טרנסגניים מבטאת חלבון פלורסנט ציאן התמזגו לרצף המיקוד של קרום, Gap43, מונע על ידי היזם EF1α והוא הרכיב של האלמנט DF4 pax6 שיפור אוביסקוטיות בתאי סיבים העדשה11. Q01 יש ביטוי אקסטרה מולקולרית, כולל תאים אמקרין ברשתית, אשר מוסיף אות ברקע אם העניין העיקרי הוא העדשה. פיתחנו קו טרנסגניים הרומן המבטא ממברנה קשור ממברנות במיוחד בעדשה, עם המטרה של הימנעות כל האות הנוספת העדשה.

לוקליזציה של גרעין העדשה

גילינו כי גרעין העדשה נע ממיקום הקדמי הראשוני בזחל הדגים למיקום מרכזי בציר הקדמי-אחורי של עדשות למבוגרים. זה משמרת במיקום של השבירה הגבוהה מדד העדשה הגרעין הוא חשב להיות דרישה להתפתחות נורמלית של עדשת העדשה של דג זברה1. השיטות שלנו מאפשרות לכמת את העדשה של צנטליזציה גרעינית ביחס לרדיוס העדשה. באמצעות שיטה זו, הראנו כי Aqp0a נדרש עבור העדשה ריכוז גרעיני1, ושיטה זו פשוטה ניתן להחיל על מחקרים אחרים של פיתוח ופיזיולוגיה של העדשה התכונות האופטיות שלה במודל דג זברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקולים בעלי חיים המשמשים במחקר זה לדבוק הצהרת ARVO לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

1. גידול דגים והמתת חסד

  1. העלאה ושמירה של דג הזברפיש (המתח AB) תחת תנאי מעבדה סטנדרטיים12. העלאת עוברים במדיום העובר (EM)12. הוסף 0.003% PTU כדי EM מ 20-24 הפריה הדואר (לפני השלב של פרים 5) כדי למנוע היווצרות פיגמנט בעוברים12 המשמש לדימות בשלבים עובריים9. להעלות את הזחלים מ 6-30 ימים הפריה (dpf) על דיאטה של בעלי חיים עד 14 dpf, ולחיות ארטמיה לאחר 14 dpf12.
    זהירות: PTU הוא רעיל מאוד
  2. דג מורדם באמצעות tricaine עד שאינו מגיב למגע.
    1. להכין את המניה tricaine ידי שילוב 400 מ"ג של 3-הבנזואית שלושה אמינו acidethylester, עם 2.1 mL של 1 M טריס (pH 9), ב 100 mL של ddH2O. כוונון ל-pH 7.0 ולאחסן ב-20 ° c.
      זהירות: . טריקיין רעיל
    2. לדלל 4.2 mL של מלאי tricaine ב 100 מ ל של מי טנקים להרדמה הזחלים/מבוגרים או EM כדי לעבור עוברים למטה (הריכוז הסופי של tricaine ב 0.0165% w/v).

2. קיבוע של עוברים וזחלים

הערה: הפרוטוקולים האימונוהיסטוכימיים הותאמו מחומרים שפורסמו בעבר7.

  1. לתקן עוברים או הזחלים של עד 2 שבועות הפריה בתוך 4% (v/v) פאראפורמלדהיד (למעלה) בתמיסת מלח (PBS) ב -4 ° c על נדנדה.
    זהירות: היחידה למען הסדר. היא דליקה ומסרטנים
  2. רוחצים את העוברים שלוש פעמים עבור 10 דקות ב-PBS, והחדירות ב-PBS עם 10% טריטון ו-1% DMSO (PBS-T) לילה ב 4 ° c.
    זהירות: DMSO הוא רעיל, מזיק על ידי בליעה או ספיגת העור, נושאת חומרים מסוכנים דרך העור, והוא דליק. טריטון רעיל, מאכל ומסוכן. בסביבות מימיות

3. חיתוך של זחל ולמבוגרים עדשות דגים

  1. דג מורדם מ 6 הזחלים לבגרות עם tricaine עד שאינו מגיב למגע אך עדיין מראה פעימת לב חזקה. למדוד את אורך בתקן הדג לפי שילינג (2002) עבור האחסון הזמני13.
  2. עיניים בורקות מיד שימוש במספריים לחיתוך מיקרו ומניחים לתוך צלחת לחיתוך ב-PBS (איור 2 המוצג לעיניים בוגרות).
    1. הפוך צלחת 35 mm מותאמת אישית מלא סיליקון לניתוח עדשות. לאחר הסיליקון הגדיר, בבלו דיבוט סביב 2-3 מ"מ קוטר ו 0.5 mm עמוק לשתק עיניים מבוגרים/עדשות במהלך הניתוח.
  3. חיתוך של עדשות בוגרים מדגים
    1. הניחו עין מבוגרת בתוך המנה הצדדית המלאה של הערוץ. לשתק את העין על ידי החדרת מלקחיים בזווית < 45 ° דרך הדיסק האופטי. להיזהר לא ניק או לדחוס את העדשה. הפוך שניים או שלושה חתכים רדיאליים דרך הרשתית והsclera מהדיסק האופטי לאזור הסיליארי עם מספריים לחיתוך.
    2. קליפת לאחור את הרשתית ואת sclera כמו כותרת פרח להפוך את העין, הקרנית בצד למעלה. לשתק את העדשה בעקיפין באמצעות מניפולציה של sclera ו קרנית עם הצד השטוח של המספריים, תוך משיכת הרשתית ואת הרקמות המצורפת עם מלקחיים. לקצץ בזהירות רקמות עודף מן העדשה.
      הערה: זה חיוני כדי לנתח בקפידה כדי להשיג עדשות בריאים בעקביות.
  4. חיתוך עדשות זחל מדגים
    1. מקום עין זחל האחורי למעלה אל החלק השטוח של צלחת הסיליקון מלא PBS ולהשתמש מחט טונגסטן מחודדים לעשות חתכים רדיאליים דרך הרשתית ואת sclera תוך השתק את העין עם מחט טונגסטן אחר או מלקחיים.
      הערה: להיזהר לא לפגוע בעדשה.
      1. לחדד את הקצה של 2 ס"מ באורך של 0.1 מ"מ חוט טונגסטן באופן אלקטרוסטי על ידי השעיית קצה החוט לתוך 10% (w/v) NaOH והחלת מתח נמוך לסירוגין הנוכחית14. על ידי המסת הזכוכית. בעזרת מבער באנסן
        הערה: ניתן להשתמש גם בכלי ניתוח חלופיים משובחים.
        זהירות: . נאאה הוא מאכל
    2. בעדינות להוציא את העדשה מן העין הנתק עם צד קהה של המחט, ובזהירות למשוך את הרקמה המצורפת.

4. קיבוע של עדשות גזור

  1. מיד לתקן עדשות גזור ב-1.5% (v/v) כלפי מע ב PBS עבור 24 h בטמפרטורת החדר (RT). שטוף עדשות שלוש פעמים ב-PBS עבור 10 דקות כל אחד.
  2. עדשות מאופקות לניתוח מטען מלא או קריואופרזציה להקפאה (ראו סעיף 8).
    1. עדשות החדירות ב-PBS-T לילה ב 4 ° c.

5. עדשות אימונוהיסטוכימיה

  1. ממברנות תוויות של העובר קבוע/זחל או עדשות למבוגרים על ידי דגירה ב Phalloidin-אלקסה Fluor 546 (1:200) ו גרעיני תא עם dapi (1:1000 של 5 מ"ג/mL מניות) ב PBS-T לילה ב 4 ° c.
    זהירות: DAPI הוא מטרד לעור ולעיניים.
  2. לרחוץ שלוש פעמים עם PBS-T עבור 10 דקות כל אחד. רקמות ברורות על ידי דגירה 30%, 50% ו 70% גליצרול ב-PBS-T (v/v) עבור לפחות 1 h ב-RT כל אחד, או לילה ב 4 ° c.
  3. הר דגים ב 70% גליצרול ב PBS-T (v/v) אל התחתון זכוכית 35 מ"מ מנות למיקרוגל עם עיניים כמו שטוח ישר נגד שובר הכיסוי ככל האפשר. עבור דג צעיר יותר, הטיה לרוחב הקדמי קל עשוי לעזור המזרח העדשה תפר להיות מקביל את coverslip.

6. ניתוח של העדשה Zebrafish הקדמי באמצעות קו טרנסגניים בVivo

  1. הפקת קווים Tg (βB1cry: מפלט) באמצעות ערכת Tol215. מערכת אלמנט Tol2 סיבל15 מאפשר שילוב יציב של המבנה שבו mapple מונע על ידי 300 bp של האדם βB1-crystallin יזם16 קשור הממברנה על ידי רצף caax וכתוצאה מכך ביטוי במיוחד בקרום העדשה סיבי תאים.
    הערה: מבנה זה (ID: 122451) זמין לרכישה.
    1. בבוקר של הזרקה, להכין את תערובת ההזרקה ולשמור על קרח. כדי להגיע לנפח הסופי של 10 μL של המכיל RNase-and DNase-H חינם2O, להוסיף: 1.5 μl של huβB1Cry: מייפלט DNA לבנות ב 50 ng/μl-[0.375-0.75 pg/הזריקה הסופית], 1.5 μl של Tol2 טרנספט mrna ב 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 pg/ הזריקה הסופית], ו 1 μL של אינדיקטור אדום פנול ב 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/הזריקה הסופית].
    2. הכנס 50-100 pL של תערובת הזרקה לעוברים בשלב 1 תא12.
  2. למדוד יעילות טרנסגנזה ב F0 מוזרק העוברים על ידי מדידת תדירות של עוברים עם עדשות מהאפל ב 3 dpf.
    הערה: יש לצפות ש> 80% יעילות טרנסגנזה בשיטה זו. פסיפסים F0 לאפשר ניתוח מפורט של מורפולוגיות קרום של תאים בודדים. רמות שונות של פסיפס מאפשר לדמות את המורפולוגיות של קבוצות יחיד או קטנות של תאים, בעוד ביטוי עדשה גלובלית יותר מאפשר ניתוח של מבנים רב-תאיים כמו תפרים עדשה ב vivo.
  3. Outcross F0 דגים פסיפס כדי ליצור קווים יציבים, אשר תווית כל קרום התא סיבים. מייסדי F0 עם הטרנסגנים משולבים ב-germline יפיק צאצאים עם שילובים יציבים שניתן לשמור כקווים טרנסגניים.

7. אנליזה של העדשה Zebrafish הקדמי באמצעות קו טרנסגניים בVivo

  1. שנרלים 3 dpf או פסיפס מבוגר או דגים הטרנסגניים יציב ו-1% נמוך להמיס agarose (LMA) עם tricaine עם העין שטוח נגד העטיפה של המכסה של הזכוכית התחתית מנות למיקרוגל.
    1. מפזר 1 גר' LMA ב 100 mL של EM (ללא מתילן כחול) כדי לבצע 1% LMA. חנות לטווח ארוך כ 15 מ"ל מניות ב 4 ° c. מיקרוגל להמיס מלאי ולאחסן ב 42 ° צ' עד כל שפופרת משמש.
  2. לכסות דגים עד 6 dpf עם EM עם tricaine, או עם מי טנקים עם tricaine עבור מבוגרים כאשר LMA מוגדר.
    1. מערבבים 5 מ ל EM ללא מתילן כחול או מים טנקים עם 250 μL של מלאי tricaine ו -7 μL של PTU אם הדמיה PTU התמונה דגים מטופלים.

8. העדשה קריוסטאז ואימונוהיסטוכימיה

  1. הקפאה של עוברים קבועים או עדשות מבוגרים על ידי הצבת 10% סוכות ב-PBS (w/v), 20% סוכרוז עבור 1 h ב-RT כל אחד (או לילה ב -4 ° c) ולילה ב 30% סוכרוז ב -4 ° c.
  2. הטמע רקמות ב-oct בתבניות בסיס, ולאחר מכן הקפא על הצ'קו עם OCT. קריודור ב 12-14 יקרומטר ולאסוף על מגלשות מיקרוסקופ rost/Plus. מקטעים חמים על שקופית עבור 10 דקות על מחמם שקופית מראש עד ~ 35 ° c.
  3. שטוף מקטעים שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד. מקטעי תווית עם Phalloidin-אלקסה קמח 546 (1:200) עם DAPI (1:1000) או WGA-אלקסה קמח 594 (1:200), ואחריו שלושה שוטף PBS. הר עם בינוני הרכבה אנטי לדעוך, ו חותם שמיכות עם לק ציפורניים.

9. הדמיה

  1. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. לרכוש z-ערימות או פרוסות אופטיות באמצעות 60x N/A 1.2 מטרה לטבילה במים, או דומה, באזורים מסוימים מתוך הקוטב הקדמי עד העדשה האחורי. השתמש בהגדרות הרכישה הבאות: 1.2 מאוורר דיסק באמצעות לייזר מ561 nm, טקסס מסנן אדום עבור phalloidin-אלקסה קמח 546 או מאפל, או לייזר 405 עם מסנן UV עבור DAPI.
  2. תיקון z בעוצמה לייזר כוח כדי לנטרל את אובדן האות עם עומק לתוך העדשה. זה מאפשר אות חזק בקוטב האחורי של קבוע לחיות 3 העוברים dpf, ואות חזק פרוסות אופטיות המשוונית בעדשות דגים למבוגרים.
  3. בצע קומפילציה והצג תמונות באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות.

10. מדידת הלוקליזציה של גרעין העדשה בציר הקדמי-אחורי

  1. אוריינט עדשות טרי מחדש axially ב-PBS בצלחת 35 מ"מ עם התחתון coverglass, עם מוטות ותפרים מונחה במקביל למישור המיקוד. חפש הבדל במדד השבירה, אשר מתרחשת בדרך כלל בממשק של קליפת העדשה וגרעין העדשה כדי לזהות את גרעין העדשה.
    הערה: בריא מסוג פראי עדשות מבוגרים שקופים מאוד מקשה לראות את התפרים העדשה ואת הגרעין, או כדי לקבוע את כיוון העדשה. במקרה זה, ניק קל עם מלקחיים כדי קפסולת העדשה גורמת נזק קטין, מה שהופך את התפרים ואת הגרעין העדשה לכאורה ב 10 דקות עוזר האוריינט העדשה עבור מדידה זו. עם זאת, העדשות להפוך לבלתי שמיש עבור יישומים במורד כפי שהם פגומים עכשיו.
  2. קח תמונות של עדשות עם הגרעין העדשה בפוקוס תחת התאורה באור שדה בהיר עם או בלי אופטיקה DIC באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה עם מצלמה מחוברת. התמונה מיקרומטר תחת אותה הגדלה לכיול.
    1. לחץ על לחצן תצוגה חיה, להתאים את הגדרות החשיפה כדי להמחיש את הגרעין העדשה הפריפריה העדשה, ולקחת תמונה על ידי לחיצה על כפתור לצלם. שמור כקובץ tif.
    2. השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי לכייל את תמונות העדשה הנרכשת. בחרו בכלי קו ישר וציירו קו אורך ידוע בתמונת המיקרומטר, לחצו על הלחצן ' ניתוח ' | קביעת קנה המידה. הזן מרחק ידוע, יחידות ובחר כיול ' כללי ' ולחץ על הלחצן ' אשר '.
  3. למדוד את המרחק של מרכז גרעין העדשה אל הקוטב הקדמי (a-r).
    1. השתמש בכלי קו ישר בתוכנת עיבוד תמונה כדי לשרטט קו על פני מרכז הדימות של גרעין העדשה בכיוון צירית. קח את המרכז של הקו הזה כמרכז של גרעין העדשה.
    2. צייר קו אחר מנקודה זו אל הקוטב הקדמי של העדשה ובחר ' מדידה ' בתפריט ' לנתח ' כדי למדוד את המרחק (a-r), שם הוא רדיוס של העדשה ו- r הוא המרחק ממרכז העדשה למרכז ה גרעין.
    3. ציירו קו נוסף מהקדמית לקטבים האחוריים ולמדוד את המרחק הזה כמו קוטר העדשה (2a). העתק אורכים אלה מחלון ' תוצאות ' והעבר לתוכנית גיליון אלקטרוני או סטטיסטיקה.
      הערה: קל יותר למדוד בדיוק ממרכז הגרעין אל הקוטב הקדמי, מאשר מדידה ממרכז הגרעין של העדשה למרכז העדשה. מדידה זו מומרת על ידי הנוסחה בשלב 10.3.5 כדי לדווח על המרחק של מרכז גרעין העדשה למרכז העדשה. השתמש תמיד בגרעין המבוגר למדידות, גם אם הגרעין העובריים ניכר.
    4. לחלק את הקוטר ב 2, כדי לחשב את רדיוס העדשה, a.
    5. חשב r/a, כפי Equation 1 שהוא הלוקליזציה המנורמל של גרעין העדשה ביחס לרדיוס העדשה.
      הערה: עבור גרעין שמוקם קרוב יותר לקוטב הקדמי, r/a יהיה > 0.0, בעוד שהגרעין המותאם לשפה המקומית יהיה r/a של 0.0.
  4. גרף את היומן של המדידה של גרעין הציר המנורמל כפונקציה של האורך הסטנדרטי כדי לקבוע שינויים בלוקליזציה של גרעין העדשה במהלך התפתחות הדגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האנטומיה של עיניים בוגרים דומה מאוד לזו של יונקים (איור 1A). למרות הבדלים מסוימים בין הדגים הזברזיים ועיני היונקים, כגון האזור הסילימארי במקום גוף מעונה17, הבדלים בתכונות אופטיות18, והבדלים מורפולגנזה במהלך התפתחות מתחלקים19, ה זברדג עין הוא מודל מצוין לחקר התפתחות העין והבנה מחלות אופטלמולוגיות20,21,22. האפיתל פשוט קווים הקוטב הקדמי של העדשה, אשר בתוך קו המשווה עובר תהליך חיים ארוך של התפשטות, התארכות, בידול לתאי סיבים, המהווים את החלק העיקרי של העדשה. תאי סיבים מבוגרים (איור 1B, כחול בהיר) מבדילים תחילה בעובר, נטולי אורגלים ולעולם אינם מוחלפים. הבחנה עצות תא סיבים לפגוש את הקטבים כדי ליצור את התפרים הקדמי והאחורי. תאים אלה הפנימו על ידי תאי סיבים חדשים הבדיל. כמו כל עדשות בעלי חוליות, העדשה דג זברה כך יש הדרגתי של פיתוח עם התאים העתיקים ביותר ממוקם במרכז הגרעין של העדשה. העדשה דג זברה צורות בשנת 16 הפריה הדואר (hpf), אשר תארכת ליצור את סיבי העדשה העיקרי ב 18 hpf, וסיבים משניים טופס באזור המעבר ב 28-36 hpf. תפר האחורי גלוי ב 48 hpf, אשר לפני התפר הקדמי הופך גלוי10.

הפיתוח והתחזוקה המדויקים של ארכיטקטורת העדשה הסדירה חיונית לאופטיקה שלה. כאן אנו מתארים שיטות לניתוח של מורפולוגיה תא עדשה דג זברה ב מבחנה ב vivo, כולל הן יתרונות ומגבלות, אשר פיתחנו כדי לנתח פנוטיפים כתוצאה מאובדן של תפקוד המוטנטים של שני דג זברה Aqp0s, Aqp0a ו Aqp0b1. להערכת מורפולוגיה עדשה מבוגרים בתוך מבחנה, עדשות היו גזור (איור 2) ומיד תוקן. הערכה עובריים בוצעה במשך כל העוברים קבוע (איור 3) ולעומת עוברי הטרנסגניים חיים (איור 4). לגזור עדשות למבוגרים קבוע (איור 5) הושוו עדשות מבוגרים הטרנסגניים לחיות (איור 6). הבדלים באיתור ובהדמיה של חלקים ספציפיים של העדשה באמצעות שיטות אלה מסוכמים (טבלה 1).

Phalloidin נמצא מעולה לתיוג העדשה ממברנות תא סיבים ב דג זברה לעומת הנבט החיטה ציטינטין (WGA). WGA הוא לקטין הנקשר ל-N-מרחקסיל-D-msm-גלוקוסם וחומצה סילית, וWGA מצופף ל-fluorophores משמש בדרך כלל כדי לתייג את ממברנות תא סיבים העדשה באדם23, שור24, כבש25, עכבר26, עכברוש27 ו . דג ברשיר28,29 כאן אנו משתמשים phalloidin על כל עדשות הדגים המלא (איור 3, איור 5).

עובריים וזחל דג זברה הזחלים עד 7 dpf הם קטנים וחדיר מספיק כדי לאפשר חדירה של phalloidin לתוך הקליפה החיצונית של העדשה. על ידי 3 dpf הגרעין העדשה קומפקטית ונטול של אורגלים, התפר הקדמי הטופס על הקוטב הקדמי (איור 3A,B), ו phalloidin הוא נשלל הגרעין העדשה במישור אופטי המשוונית (איור 3a,D). Phalloidin כנראה נשלל מן הגרעין בשל דחיסה גבוהה של קרום התא סיבים, עקבי עם מחקרים קודמים28. עם זאת, קליפת המוח החיצונית הוא דמיינו בפירוט רב עם זה כתמים (איור 3C-F). בחלק הצלב, תאי סיבים לקחת על צורה משושה משוטח, עם צדדים רחבים יותר, והצדדים צרים קצר יותר. Phalloidin בחוזקה מתייג הן ממברנות התא צר ורחב סיבי (איור 3E-F) המדגיש את הדחיסה של תאי סיבים קורטיקלית בין הצדדים הרחבים. ארגון זה מושפע במידה רבה aqp0a/b מוטציות כפולות (איור 3b, D, F ו- H).

ביטוי פסיפס של הטרנסגנים (מאפל קשור קרום התא על ידי מוטיב CAAX מונע על ידי מיזם 300 bp אזור של היזם האנושי βB1 crystallin) מבטא בחוזקה עדשות החל 2 dpf. הטרנסגנים משולבים באופן אקראי לתוך הגנום וכתוצאה מכך ביטוי הטרוגניים של מאפל. אנו מראים דוגמאות של עדשה של 3 dpf עם ביטוי חזק בקליפת המוח (איור 4) וביטוי בחלקים של הגרעין (איור 4d). סמן הממברנה אינו מוגבל על ידי חדירות כמו phalloidin, ובכך הוא מתייג את גרעין העדשה. פסיפסים (איור 4) שנוצר על ידי זריקות DNA כי הם מבוטא רק בקבוצת משנה קטנה של תאים שימושיים לניתוח מורפולוגיות תא בודדים לעומת קווים יציבים, אשר תווית כל תא המבטא βB1 Crystallin (איור 6). בפסיפס Tg (βB1cry: מפלט) המבנה של התפר הקדמי ניתן לדמיין ב-z תחזיות הננקטות בקוטב הקדמי (איור 4a,ב). שימו לב כי המבנה של ממברנות התאים שונה מעדשות קבועות המסומנת ב-phalloidin (איור 3 א,ב), ונוכחות של תת-תחומים בקרומים של תאים רחבים (איור 4a' חיצים לבנים) שזוהו בעבר בעדשות מ מין30 גלוי. עם זאת, תיוג חלש של ממברנות תא סיבים צרים תוצאות חוסר יכולת לראות את ההתכנסות המרשימה של תאים בתפר הקדמי (איור 4a,B חץ) לראות עדשות קבועות המסומנות עם Phalloidin (איור 3a,b חיצים).

מעניין, פרוסות אופטיות שצולמו על המשווה העדשה גם לחשוף דפוס תוויות שונות, עם הפרעות ברורות לנפח התאים בaqp0a/b כפול מוטציות לעומת WT (איור 4c-F). סביר להניח שבגלל שהתוויות הטרנסגניים מדבקות תאי סיבים רחבים ביעילות רבה יותר מאשר phalloidin. הצלחנו להשיג z-התחזיות דרך הקוטב האחורי כדי לנתח את השלמות של תפר האחורי עם שימוש של תיקון Z, אשר הגביר את כוח הלייזר עם עומק לתוך רקמות. ניתוח ברור של התפר האחורי (איור 4G,H) בדגים ללא פגע היה מוגבל ל 5 dpf הראשון, ולאחר מכן העדשה היה צפוף מדי, וכתוצאה מכך אובדן של אות בחלק האחורי של העדשה.

קבוע בגזור עדשות למבוגרים עם התווית phalloidin חשף פירוט הבולט בארכיטקטורה מסודרת מאוד של שורות תא סיבים מתכנס לטופס התפרים הקדמי (איור 5A, חץ) ו מורפולוגיה של קליפת המוח (איור 5a-H), בשל תיוג חזק מאוד של ממברנות תא סיבים צרים על ידי phalloidin. מקסימום Z-התחזיות של הקוטב הקדמי חשף אובדן של תפר קדמי צר ב aqp0a/b עדשות מוטציה כפולה (איור 5b, חץ), לעומת WT (איור 5b, חץ), אשר ניכר כמסה של ממברנות וגרעיני התא באופטי פרוסות 30 יקרומטר מהעמוד הקדמי (איור 5d). בפרוסות אופטיות עמוקות יותר, תיוג phalloidin לא נכלל בקליפת העדשה העמוקה יותר והגרעין (איור 5E,F). הארגון הכללי של שורות תא סיבים בקליפת הגוף החיצוני הושפע במידה מסוימת על ידי חוסר תפר קדמי צר ב aqp0a/b עדשות מוטציה כפולה, מה שהופך אותו בלתי אפשרי למקם עדשות בדיוק בניצב למישור הדמיה (איור 5f ) לעומת עדשות WT (איור 5e). עם זאת, תמונות בעוצמה גבוהה של שורות תא סיבים שצולמו במישור המשוונית חשף כי תאים בקליפת המוח החיצוני עדיין יצרו שורות מסודרת, גלוי בשל תיוג חזק של סיבים צרים תא (איור 5G,H). זה היה בלתי אפשרי להבחין בממברנות של תאי סיבים בודדים עקב שילוב של דחיסה הדוקה שלהם, ואות חלש. מאז עדשות אלה היו גזור, הם יכולים להיות מותקן עם הצד האחורי מול המטרה, המאפשר z-התחזיות של התפרים האחורי, אשר הראו שום הבדלים בין גנוטיפים כמו האחורי הסיבים בתאי התאים הקימו תפרים הדוק (איור 5I,J חצים).

Z-התחזיות של עדשות של לחיות מורדם יציב מבוגר Tg (βB1cry: מפלט) דגים לחשוף מורפולוגיה קרום המוח בקליפה הקדמית (איור 6a,a '), כמו גם את היקף ההתכנסות התא בקוטב הקדמי ( איור 6B). זה היה קשה יותר לטעון את הדג עם תפרים עדשה בניצב למישור הדמיה, לעומת עדשות לגזור קבוע. קווים יציבים הנושאים את המאפל המהירה ביותר בגרעין העדשה (איור 6C,D). פרוסות אופטיות על המשווה חשף אות חזק המציין דחיסה נרחב של הגרעין כאשר התמונה עם אותו כוח לייזר כמו קליפת המוח הקדמי (איור 6c). מעניין, הרזולוציה התאית של קליפת המוח החיצונית הייתה ניכרת אצל מבוגרים, בניגוד לעוברים. זה סביר בגלל הקשתית חוסמת אות ברור מן הפריפריה העדשה. זה יכול להיות אפשרי להשיג אות חזקה יותר בקליפת הבית על ידי התרחבות של התלמיד לפני הדמיה. עם כוח לייזר מופחת, ניתן היה להבחין בין כמה שכבות תאים בגרעין העדשה (איור 6D). העדשה הבוגרת מאוד צפופה, וזה היה בלתי אפשרי להשיג אות מהעמוד האחורי בvivo.

הצגנו כי הגרעין עדשה דג זברה נע בציר אופטי מעמדה קדמית ראשונית בעדשות זחל לעמדה מרכזית במבוגרים1. תנועות אלה מודגשות בסעיפים עדשה צירית, כמו phalloidin ו WGA אינם נכללים גרעין העדשה (איור 7A-C). הצגנו כי Aqp0a נדרש עבור תהליך זה ריכוז1, אבל מנגנון זה עשוי להיות מושפע חלבונים אחרים. לוקליזציה של מרכז גרעין העדשה ביחס למיקומה לאורך הציר האחורי הקדמי נמדד על ידי הצבת עדשות שלם באוריינטציה שלהם והדמיה תחת התאורה DIC, ובכך הדגשת הבדלים קלים ב שבירה (איור 7E). התפרים בדרך כלל יש מדד השבירה שונים מאשר קליפת הסביבה, כך ניתן להשתמש כמדריך לאוריינטציה. עדשות זחל צעיר יש תפרים ברורים יותר (התפרים האחורי של עדשות צעירות מאוד), גרעיני העדשה, אשר יש מדד השבירה שונים, הם בהחלט אסימטריים, מה שהופך אותו קל יותר האוריינט עדשות בשלבים אלה. המרחק היחסי של מרכז גרעין העדשה ממרכז העדשה (r) הוא מנורמל לרדיוס העדשה (a). הדבר משמש לאחר מכן בגרף ביחס להתפתחות הדגים, ומידת האורך הסטנדרטית משמשת13. ב WT, גרעין העדשה מתחיל קרוב יותר לקוטב Equation 2 העדשה הקדמי, ולאחר מכן מרכז Equation 3 בבגרות (איור 7f).

Figure 1
איור 1 : העין מבוגרים דג בוגרים העדשה דיאגרמה. הקדמי הוא נלקח כאשר האור נכנס לעין, אשר הדגים הוא למעשה לרוחב. (A) את העדשה דג זברה יחד עם אור מיקוד קרנית על הרשתית. בבעלי חיים ימיים, הקרנית ממלאת תפקיד קטין בשבירה קלה, אך במקום זאת, לעדשה יש מדד השבירה גבוה יותר18. העדשה מפרידה את החדר הקדמי מלא הומור מימית וחדר אחורי מלא הומור ויטראז '. (ב) העדשה של דג דג זברה היא יותר כדורית מאשר עדשות מהיונקים. סיבי תא סיבים נפגשים בנקודה או בתפרים הטבור8 על הקטבים הקדמי והאחורי. הבחנה תאים סיבים בקליפת העדשה יש גרעינים ואורגלים, בעוד תאי סיבים בוגרים בגרעין העדשה (כחול בהיר) הם נטולי אורגלים וגרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.    

Figure 2
איור 2 : העדשה של דג Zebrafish. (א) העיניים מקטושות מדגים מורדם וממוקמות בצד האחורי (ב). (ג) העיניים הן מקיבוע באמצעות מלקחיים דרך הדיסק האופטי (od) ושניים עד שלושה חתכים רדיאליים נעשים ברשתית ומsclera מהדיסק האופטי אל הזוננפלד. (ד) מקפלים את המדפים החוצה כדי לחשוף את העדשה. (E) לסובב את העין כדי להתמודד עם קרנית, לשתק את העדשה בעקיפין דרך הקרנית ולמשוך משם את sclera-רשתית. (ו) לקצץ את האזור שנותר ברשתית ובאיזור סיליקארי מהעדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : מורפולוגיה של עדשות עובריים ב מבחנה. העוברים קבוע וחדיר מתויג עם phalloidin (אדום) ו גרעיני התא עם DAPI (כחול) לחשוף מורפולוגיה ממברנה ושלמות תפר על המוטות. Z-התחזיות לגלות כי WT ו aqp0/b עדשות מוטציה כפול התערוכה הסדר רגיל מאוד תא סיבים כי להיפגש תפר קדמי צר מאוד (חיצים) ב 3 Dpf (a, b). פרוסות אופטיות שצולמו על המשווה לחשוף שורות הדוק של תאי סיבים משושה ארוז בקליפת המוח החיצוני בשני גנוסוגים (C-F). שניהם, צדדים צרים ורחבים של קרום התא סיבים מתויג כפי שמוצג (E). התפרים אחוריים (חיצים) הם הקימו והדוק בשני גנוסוגים (G, H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : מורפולוגיה של עדשות עובריים ב vivo. הדמיה חיה של מורדם 3 dpf פסיפס F0 מוזרק Tg (βB1cry: מפלט) עדשות לחשוף את התפרים הקדמי (חיצים) ב z-תחזיות (A, B). (א) תת-תחומים ממברנות ניכרים כדקדפי (חיצים לבנים) בקרומים של תאי סיבים רחבים. ממברנות תא סיבים צרים גם ברור (חיצים שחורים). עדשות WT לחשוף בחוזקה העדשה ארוז בתאי סיבים קליפת המוח (ג, E), לעומת הקליפה שיבשה של aqp0a/b מוטציות כפולות- עם תאים נפוחים ברור (D, F). ממוקד על תפרים אחוריים (g, h) (חיצים) אינו חושף הבדל בין גנוסוגים (g, h). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : מורפולוגיה של עדשות למבוגרים בתוך מבחנה. עדשות מפוסרות, קבועות וחדירות מדגים מעל 23 מילימטר באורך סטנדרטי היו מתויג עם phalloidin (אדום) ו DAPI (כחול). 150 יקרומטר Z-הקרנה בקוטב הקדמי לחשוף הסדר קפדנית של טיפים תא סיבים מתכנסים תפר צר (חץ) ב WT (א), אבל לא aqp0a/b כפול מוטציות (חץ), אשר במקום זאת יש מסה של ממברנות גרעינים (ב). פרוסה אופטית נלקחה 42 יקרומטר מן הקוטב הקדמי לחשוף תאים הורה מתכנס במרכז WT (ג), אבל מסה של גרעינים שבו תפר צריך להיות עדשות מוטציה (D). פרוסות אופטיות דרך המשווה של העדשה, ב 130 יקרומטר מן הקוטב הקדמי לחשוף שורות ארוזות היטב של תאים סיבים ב WT (E, G) ו מוטציות (F, H). התפרים אחוריים (חיצים) הם הקימו והדוק בשני גנוסוגים (I, J). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 מורפולוגיה של עדשות למבוגרים בvivo. הדמיה חיה של מבוגר מורדם יציב Tg (βB1cry: מפלט) WT עדשות. Z-התחזיות בקליפת המוח הקדמי לחשוף מורפולוגיה קורטיקלית (a, a "), ו תפר קדמי (חץ), עם תאים מתכנס לנקודה בפרוסה אופטית אחת (B, חץ). קליפת המוח יכול להיות מדמיין כוח לייזר גבוה יותר בפרוסה אופטית דרך המשווה (C), לעומת טופס האות חזק יותר את העדשה הגרעין (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: מרכז הגרעין של העדשה. העוברים והקפאה (א) ועדשות (ב, ג) היו מסודרים באופן מסודר ומתויג עם phalloidin-546 (אדום ב , ב), dapi (כחול ב , ב) או WGA-594 (אדום ב C). הגרעין של העדשה נטול גרעינים תאים, והוא ממוקם קרוב יותר (a) עדשה ב 3 dpf (a), ובעוד 1 עדשות הישן (ב), לעומת להיות מרכזי ממוקם עדשות למבוגרים (C). לגזור עדשות מתוך חודש דג זברה הישן של 4.1 מילימטר אורך סטנדרטי היו מכוונים שווה (D), או axially (E). הלוקליזציה היחסי של גרעין העדשה בציר חושבה באמצעות האסטרטגיה הבאה: (ה) המרחק של המרכז (*) של גרעין העדשה (קו מנוקד לבן) נמדד לקוטב הקדמי, כמו זה מעשי יותר מאשר מדידת ה מרחק (r) למרכז העדשה (פלוס). הדבר היה מנורמל לרדיוס העדשה (a), שנחקרה למדוד את קוטר העדשה (ant.-pos.). היומן של הלוקליזציה של גרעין הציר המנורמל היה בגרף כפונקציה של פיתוח דגי הזברפיש, שנמדד לפי אורך התקן (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תכונה העובר IHC Tg עדשת מבוגרים שלמה של IHC Tg למבוגרים
חיות N Y N Y
תפר קדמי Y קצת Y קצת
תפר אחורי Y Y Y N
פרטים סלולריים בקורטיקלית קצת Y Y קדמי במקצת
פירוט הגרעין של העדשה N Y (יציב) N Y (יציב)
תווית משנית נוגדנים-Y לחיות רק עם Tg נוגדנים-Y לחיות רק עם Tg
תווית של סיבים רחבים/צרים שני רחב בעיקר צרות רחב

טבלה 1: סיכום השוואה של vivo vs בשיטות חוץ גופית לניתוח מורפולוגיה עדשה ב zebrafish. Y = כן, N = לא

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח של מורפולוגיה עדשה דג זברה הוא הצעד הראשון הבנת פנוטיפים המוטציות, או את ההשפעות של התערבויות תרופתי מכוון ללמוד ביולוגיה של העדשה העינית. אנו מתווה שיטות לניתוח תפרים עדשה, מורפולוגיה תא הקליפת סיבים והיבטים של גרעין העדשה. גישות אלה הן שילוב של מבחנה ב - vivo (בהשוואה לטבלה 1). בשיטות החוץ- גופית מאפשרים פירוט רב יותר של המבנה החיצוני של המעטפת הקורטיקלית, כמו גם גישה לתפר האחורי של עדשות למבוגרים.

בניתוח vivo ניתן להשתמש בסמנים טרנסגניים. הטרנסגנים שאנו מציגים כאן היא ממברנה עדשה ספציפית, לעומת קו Q01 דג זברה הקיים, אשר בעוד תוויות ממברנות עדשה גם תוויות סוגים אחרים של תאים בעין, כולל תאים אמקרין מסבך פרשנות11 . באות vivo מוגבל על ידי האפיתל פיגמנט של העין, אשר טפסים במהלך היום השני של embryogenesis, כך העוברים צריכים להיות ptu שטופלו ניתוח בשלבים הבאים. אצל מבוגרים, הקשתית מטשטש ניתוח ברור של קליפת העדשה, אבל מאפשר ניתוח vivo של קליפת העדשה הקדמית. הדמיה חיה של עדשות דגים מאפשרת מחקרים האורך של מורפולוגיה עדשה באותה חיה. זה יכול להיות כלי שימושי ביותר עבור לימוד השפעות על תהליכים דינמיים, כגון הפרעה בנפח התאים בתגובה אוסמוטי או תרופתי רטבאליות. ממצא בלתי צפוי הוא שאנחנו יכולים בבירור להמחיש את תת הקרום הממברנה בקרומים הרחבים של סיבים בזחל חי, אך לא בעדשות קבועות. זה מדגיש את ההבדל בתוויות על ידי הטרנסגנים ו phalloidin, כמו גם את העובדה כי תת תחומים אלה עשויים להיות מושפעים תהליך הקיבעון.

ניתוח של מנגנונים מולקולריים של העדשה הגרעין ריכוז באמצעות שיטות אנו מתארים עשוי לחשוף מנגנונים חיוניים להתפתחות של תכונות אופטיות עדשה. למרות, עד כה, הגרעין עדשה א-סימטרי מדווח רק ב-zebrafish, על ידי לימוד תהליך זה אנו צפויים לקבל תובנות לתוך מנגנונים הנדרשים לפיתוח של עדשות אופטיקה במינים אחרים. בעתיד, ניתן להשתמש בבעלי החיים הטרנסגניים בשילוב עם יישומים אחרים-כגון לימודי יתר, בשימוש בסמן הטרנסגנזה הירוקה. אלה יכולים לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של הבעת היתר חלבון מסוים בעדשה, או להצלת פנוטיפים במוטציות הקיימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. אין לנו כל גילוי

Acknowledgments

היינו רוצים להכיר את מקור המימון שלנו: NIH R01 EY05661 ל-J. E. H, Ines Gehring לסיוע ביצירת המוטנטים aqp0a/b כפול וגידול בדגים, ד ר דניאל נדרנוב לדיונים המובילים ליצירת הטרנסגנאנים, ד ר ברוס בלומברג ומעבדות ד ר קן צ'ו לשימוש הניתוח שלהם מיקרוסקופ, ד ר מייגן סמית לעזרה עם אנליזה סטטיסטית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Tags

ביולוגיה סוגיה 147 Zebrafish עדשה העדשה תפר העדשה הגרעין AQP0 MIP הדמיה חיה פיתוח עדשה טרנסגניים
הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vorontsova, I., Hall, J. E.,… More

Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter