Summary
Estes protocolos foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente cortical, a integridade estrutural das suturas da lente do zebrafish em lentes fixas e vivas e para medir a posição do núcleo da lente do zebrafish ao longo do eixo anterior-posterior.
Abstract
O zebrafish é serido excepcionalmente à manipulação genética e à imagem latente in vivo , fazendo lhe um modelo cada vez mais popular para estudos genéticos reversos e para a geração de transgênicos para in vivo Imaging. Estas capacidades únicas fazem o zebrafish uma plataforma ideal para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente da ocular. Nossos resultados recentes que um Aquaporin-Aqp0a, é exigido para a estabilidade da sutura anterior da lente, assim como para o deslocamento do núcleo da lente ao centro da lente com idade conduziu-nos desenvolver as ferramentas seridos especialmente para analisar as propriedades de lentes do zebrafish. Aqui nós esboçam métodos detalhados para a dissecção da lente que pode ser aplicada às lentes larval e adultas, para prepará-las para a análise histológica, immunohistochemistry e imagem latente. Nós focalizamos na análise da integridade da sutura da lente e da morfologia da pilha cortical e comparar dados gerados das lentes dissecadas com os dados obtidos da imagem latente in vivo da morfologia da lente feita possível por uma linha transgénica nova do zebrafish com um geneticamente marcador fluorescente codificado. A análise das lentes dissecadas perpendiculares ao seu eixo óptico permite quantificar a posição relativa do núcleo da lente ao longo do eixo ântero-posterior. O movimento do núcleo da lente de uma posição anterior inicial ao centro é exigido para o sistema ótico normal da lente no zebrafish adulto. Assim, uma medida quantitativa da posição nuclear da lente correlaciona-se diretamente com suas propriedades óticas.
Introduction
O zebrafish é um modelo excelente para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente devido às similaridades anatômicas às lentes de mamíferos, à facilidade relativa da manipulação genética e farmacológica, à velocidade do desenvolvimento embrionário do olho, ao tamanho pequeno e à transparência em estágios iniciais permitindo in vivo Imaging. Os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente zebrafish em estágios embrionários e adultos com foco na integridade sutural, morfologia da membrana cortical in vitro e in vivo, e localização da posição nuclear da lente ao longo do eixo ântero-posterior ex vivo. Estes métodos servem como um ponto de partida para estudos funcionais do desenvolvimento e da fisiologia da lente, assim como telas genéticas reversas para fenótipos da lente no zebrafish.
Morfologia da lente do zebrafish da imagem latente
Aquaporin 0 (AQP0) é a proteína mais abundante da membrana da lente e é crítico para o desenvolvimento da lente e a claridade, devido às funções essenciais múltiplas nos mamíferos. Zebrafish tem dois Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e nós desenvolvemos métodos para analisar a perda de suas funções nas lentes embrionárias e adultas. Nossos estudos revelam que aqp0a-/-mutantes desenvolvem a opacidade polar anterior devido à instabilidade da sutura anterior, e aqp0a/b os mutantes duplos desenvolvem a opacidade nuclear1. AQP0 tem demonstrado desempenhar papéis no transporte de água2, adesão3,4, fixação citoesquelética5 e geração do gradiente de índice de refração6, mas estes estudos foram amplamente realizados em em vitro. O zebrafish fornece uma oportunidade única de estudar como a perda de função, ou a função perturbada de Aqp0a ou Aqp0b afetaria a morfologia e a função em uma lente viva. Para avaliar a morfologia das células da lente e a integridade sutural durante o desenvolvimento, modificamos os métodos imunohistoquímicos in vitro existentes7 para uso em lentes embrionárias e adultas, e geramos transgênicos para monitorar esse processo in vivo .
A análise de immunohistochemical da estrutura da membrana do plasma e da integridade sutural foi executada em embriões fixos inteiros e em lentes adultas. As lentes de zebrafish são extremamente pequenas (o diâmetro da lente é ~ 100 μm nos embriões e até 1 milímetro nos adultos) comparados com seus homólogos mamíferos e tem as suturas de ponto8, que são capturadas infrequëntemente nos Cryosections. Assim, as lentes inteiras são essenciais para analisar a integridade sutural. Para a análise in vivo da formação anterior da sutura, e a imagem latente da arquitetura precisa da pilha da lente, nós geramos transgênicos expressando Mapple especificamente as membranas de rotulagem da lente.
As vantagens da imagem latente viva de transgênicos da membrana da lente incluem: 1) evitando artefatos da fixação, 2) estudando mudanças morfológicas dinâmicas em filmes do tempo-lapso, e 3) permitindo estudos longitudinais em que os eventos mais adiantados podem ser correlacionados com mais tarde Fenótipos. A pigmentação da íris impede normalmente a imagem latente desobstruída da periferia da lente. A adição de 1-phenyl 2-thiourea (PTU) antes do primordia-5 (Prim-5) estágio9 impede o melanogênese e a pigmentação do olho até ao redor 4 dias postfertilização (DPF). No entanto, após 4 DPF, a periferia da lente é obscurecida in vivo, particularmente em estágios mais antigos. Além disso, a densidade da lente própria obscurece a imagem latente de seu pólo do posterior. Portanto, para estudar a morfologia da periferia da lente, ou a sutura posterior, após 4 DPF, as lentes precisam ser excisadas e fixas.
As linhas de zebrafish transgênicas têm sido utilizadas para analisar a estrutura da membrana da lente embrionária in vivo10. O Q01 transgênicas expressa uma proteína fluorescente ciano fundida a uma seqüência da segmentação da membrana, Gap43, conduzida pelo promotor EF1α e por um hexamer do elemento de DF4 pax6 Enhancer ubiquitously em pilhas de fibra da lente11. Q01 tem a expressão extra-lenticular, incluindo as pilhas do amácrinas no retina, que adiciona o sinal do fundo se o interesse preliminar é a lente. Nós desenvolvemos uma linha transgénica nova que expresse um mApple membrana-tethered especificamente na lente, com a finalidade de evitar todo o sinal extra-lenticular.
Localização do núcleo da lente
Nós descobrimos que o núcleo da lente se move de uma posição anterior inicial no zebrafish larval a uma posição central no eixo anterior-posterior em lentes adultas. Esta mudança na posição do núcleo elevado da lente do índice refração é pensada para ser uma exigência para o desenvolvimento normal do sistema ótico da lente do zebrafish1. Nossos métodos permitem a quantificação da centralização nuclear da lente em relação ao raio da lente. Usando este método, nós mostramos que Aqp0a é exigido para a centralização nuclear da lente1, e este método simples pode ser aplicado a outros estudos do desenvolvimento e da fisiologia da lente e de suas propriedades óticas no modelo do zebrafish.
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Protocol
Os protocolos animais utilizados neste estudo aderem à declaração de ARVO para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e visão e foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine.
1. husbandry de zebrafish e eutanásia
- Elevar e manter o zebrafish (cepa AB) condições laboratoriais padrão12. Elevar embriões em meio embrionário (EM)12. Adicionar 0, 3% PTU a EM de 20-24 h pós-fertilização (antes do estágio Prim-5) para prevenir a formação de pigmentos em embriões12 utilizados para a imagem em estágios embrionários9. Levantar larvas de 6-30 dias pós-fertilização (DPF) em uma dieta de rotíferos vivos até 14 DPF, e Artemia ao vivo após 14 DPF12.
Cuidado: PTU é muito tóxico -
Anestesiar peixes usando tricaína até não-responsivo ao toque.
- Prepare o estoque do tricaina combinando 400 MGS do acidethylester 3-amino benzóico, com 2,1 ml de 1 M Tris (pH 9), em 100 ml de DDH2O. ajuste ao pH 7,0 e armazene-O no ° c-20.
Cuidado: A tricaína é tóxica. - Diluir 4,2 mL de estoque de tricaína em 100 mL de água do tanque para anestesiar larvas/adultos ou em em para anestesiar embriões (concentração final de tricaína a 0, 165% p/v).
- Prepare o estoque do tricaina combinando 400 MGS do acidethylester 3-amino benzóico, com 2,1 ml de 1 M Tris (pH 9), em 100 ml de DDH2O. ajuste ao pH 7,0 e armazene-O no ° c-20.
2. fixação de embriões e larvas
Nota: Os protocolos de immunohistochemical foram adaptados dos materiais previamente publicados7.
- Correção de embriões ou larvas dechorionated até 2 semanas pós-fertilização em 4% (v/v) paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado (PBS) durante a noite a 4 ° c em um roqueiro.
Cuidado: A PFA é inflamável e é carcinogénica. - Lave os embriões três vezes por 10 min em PBS, e permeabilizar em PBS com 10% Triton e 1% DMSO (PBS-T) durante a noite a 4 ° c.
Cuidado: DMSO é tóxico, é prejudicial pela ingestão ou absorção da pele, transporta materiais perigosos através da pele, e é combustível. Triton é tóxico, corrosivo e é perigoso para ambientes aquáticos.
3. dissecção das lentes larval e adulto zebrafish
- Anestesiar os peixes de 6 larvas de DPF para a idade adulta com tricaína até não-responsivo ao toque, mas ainda mostrando um batimento cardíaco forte. Meça o comprimento padrão dos peixes como por Schilling (2002) para a encenação13.
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Imediatamente o consumo de olhos usando tesoura de microdissecção e coloque em um prato de dissecção em PBS (Figura 2 mostrado para os olhos adultos).
- Faça um prato personalizado de 35 mm preenchido com silicone para dissecções de lentes. Uma vez que o silicone ajustou, o imposto de consumo um Divot em torno de 2-3 milímetros no diâmetro e 0,5 milímetros profundamente para imobilizar olhos/lentes adultos durante a dissecção.
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Dissecção de lentes zebrafish adultas
- Coloc um olho adulto no lado posterior do Divot do prato acima enchido com o PBS. Imobilize o olho inserindo o fórceps no ângulo de < 45 ° através do disco ótico. Tenha cuidado para não Nick ou comprimir a lente. Faça duas ou três incisões radiais através do retina e do esclera do disco ótico à zona ciliar com tesouras da dissecção.
- Descasque para trás o retina e o esclera como pétalas da flor e inverta o olho, lado da córnea acima. Imobilizar a lente indiretamente através da manipulação do esclera e da córnea com o lado liso da tesoura, ao puxar afastado o retina e os tecidos Unidos com fórceps. Aparar cuidadosamente o excesso de tecido da lente.
Nota: É vital dissecar cuidadosamente para obter lentes consistentemente saudáveis.
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Dissecção de lentes de zebrafish larval
- Coloque um lado posterior do olho larval para cima na parte plana do prato de silicone preenchido com PBS e usar uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais através da retina e esclera enquanto imobilizar o olho com outra agulha de tungstênio ou fórceps.
Nota: Tenha cuidado para não danificar a lente.- Afie a ponta de um comprimento de 2 cm de 0,1 milímetros de fio de tungstênio eletroeletricamente suspendendo a ponta do fio em 10% (w/v) NaOH e aplicando uma corrente alternada de baixa tensão14. Prenda a agulha em uma pipeta de Pasteur derretendo a extremidade de vidro usando um queimador de Bunsen.
Nota: Ferramentas de dissecção finas alternativas também podem ser usadas.
Cuidado: NaOH é corrosivo.
- Afie a ponta de um comprimento de 2 cm de 0,1 milímetros de fio de tungstênio eletroeletricamente suspendendo a ponta do fio em 10% (w/v) NaOH e aplicando uma corrente alternada de baixa tensão14. Prenda a agulha em uma pipeta de Pasteur derretendo a extremidade de vidro usando um queimador de Bunsen.
- Delicadamente retire a lente do olho dissociado com um lado sem corte da agulha, e puxe cuidadosamente o tecido anexado.
- Coloque um lado posterior do olho larval para cima na parte plana do prato de silicone preenchido com PBS e usar uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais através da retina e esclera enquanto imobilizar o olho com outra agulha de tungstênio ou fórceps.
4. fixação de lentes dissecadas
- Corrija imediatamente as lentes dissecadas em 1,5% (v/v) de PFA em PBS por 24 h à temperatura ambiente (RT). Lave as lentes três vezes em PBS por 10 min cada.
- Lentes permeabilize para a análise de montagem inteira ou cryoprotect para criseccionamento (ver secção 8).
- Lentes permeabilize em PBS-T durante a noite a 4 ° c.
5. lente imunoistoquímica
- Membranas de rótulo de embrião fixo/larval ou lentes adultas por incubação em Phalloidin-Alexa fluor 546 (1:200) e núcleos celulares com DAPI (1:1000 de 5 mg/ml de estoque) em PBS-T durante a noite a 4 ° c.
Cuidado: DAPI é uma pele e irritação ocular. - Lave três vezes com PBS-T por 10 min cada. Limpar o tecido por incubação em 30%, 50% e 70% glicerol em PBS-T (v/v) por pelo menos 1 h em RT cada, ou durante a noite a 4 ° c.
- Monte os peixes em 70% de glicerol em PBS-T (v/v) em pratos de micropoços de fundo de vidro de 35 mm com os olhos lisos e retos contra o deslizamento de cobertura possível. Para os peixes mais jovens, uma ligeira inclinação ântero-lateral pode ajudar a orientar a sutura da lente para ser paralela à lamínula.
6. análise de suturas de lentes anteriores zebrafish usando uma linha transgênica in vivo
- Gere linhas TG (βB1cry: mAppleCAAX) usando o kit Tol215. O sistema Tol2 do elemento transponíveis15 permite a integração estável do constructo onde o Mapple é conduzido por 300 BP do promotor humano βb1-crystallin16 amarrado à membrana pela seqüência de CAAX tendo por resultado a expressão especificamente em membranas de células de fibra de lente.
Nota: Esta construção (ID: 122451) está disponível para compra.- Na manhã da injeção, prepare a mistura de injeção e mantenha o gelo. Para atingir um volume final de 10 μL de contendo RNase-e DNase-Free H2O, adicionar: 1,5 μL de Huβb1Cry: mAppleCAAX DNA construção em 50 ng/μl-[0.375-0.75 PG/injeção final], 1,5 μL de Tol2 transposase mRNA em 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 PG/ injeção final] e 1 μL de indicador vermelho de fenol a 1% p/v [1 X10-5% (p/v)/injeção final].
- Injete 50-100 pL de mistura de injecção em embriões de fase de 1 célula12.
- Meça a eficiência da transogênese em embriões injetados em F0 medindo a frequência de embriões com lentes mApple positivas em 3 DPF.
Nota: Espere ter > 80% de eficiência de transogênese usando este método. Os mosaicos de F0 permitem a análise detalhada de morfologias da membrana de pilhas individuais. Diferentes níveis de mosaicismo permite uma imagem das morfologias de grupos de células simples ou pequenos, enquanto a expressão de lente mais global permite a análise de estruturas multicelulares como suturas de lente in vivo. - Outcross F0 mosaico de peixes para gerar linhas estáveis, que rotulam todas as membranas celulares de fibra. Os fundadores da F0 com o transgene integrado ao germline gerarão descendentes com integrações estáveis que podem ser mantidas como linhas transgênicas.
7. análise de suturas de lentes anteriores zebrafish usando uma linha transgênica in vivo
- Anestesiar 3 DPF ou mosaico adulto ou peixe transgênico estável e montar em 1% de agarose de baixo derretimento (LMA) com tricaína com o olho liso contra o deslizamento de cobertura de pratos de micropoços de fundo de vidro.
- Dissolva 1 g de LMA em 100 mL de EM (sem azul de metileno) para fazer 1% de LMA. Armazene a longo prazo como estoques de 15 mL em 4 ° c. Microondas para dissolver o estoque e armazenar em 42 ° c até que cada tubo seja usado.
- Cubra os peixes até 6 DPF com em com tricaina, ou com água do tanque com tricaina para adultos quando LMA é ajustado.
- Misturar 5 mL de EM sem azul de metileno ou água do tanque com 250 μL de estoque de tricaína e 7 μL de PTU se a imagem PTU tratada peixe.
8. cryosectioning da lente e immunohistochemistry
- Cryoprotect embriões fixos ou lentes adultas, colocando em 10% sacarose em PBS (w/v), 20% sacarose para 1 h em RT cada (ou durante a noite a 4 ° c) e durante a noite em 30% sacarose a 4 ° c.
- Incorporar tecido em OCT em moldes de base, e depois congelar em mandris com OCT. Crisosecção a 12-14 μm e recolher em lâminas de microscópio Superfrost/Plus. Seções quentes na corrediça por 10 minutos em um aquecedor da corrediça pré-aquecido a ~ 35 ° c.
- Lave as secções três vezes com PBS durante 10 min cada. Seções da etiqueta com Phalloidin-Alexa farinha 546 (1:200) com DAPI (1:1000) ou WGA-Alexa farinha 594 (1:200), seguido por três lavagens de PBS. Monte com o meio de montagem anti-fade, e o lamela do selo com lustrador de prego.
9. imagem latente
- Adquira imagens com um microscópio confocal. Adquira pilhas z ou fatias ópticas usando um objetivo de imersão em água de 60x N/A 1,2, ou similar, em regiões específicas do pólo de lente anterior ao posterior. Use as seguintes configurações de aquisição: 1,2 disco arejado usando o 561 nm laser, Texas filtro vermelho para Phalloidin-Alexa farinha 546 ou mApple, ou o 405 laser com o filtro UV para DAPI.
- Corrija a potência do laser z-intensity para neutralizar a perda de sinal com profundidade na lente. Isto permite um sinal forte no pólo do posterior de 3 embriões DPF fixos e vivos, e o sinal forte em fatias óticas Equatorial em lentes adultas dos peixes.
- Compile e exiba imagens usando o software de processamento de imagem.
10. medição da localização do núcleo da lente no eixo ântero-posterior
- Oriente lentes recém-excisadas axialmente em PBS em um prato de 35 mm com um fundo de vidro, com pólos e suturas orientados paralelamente ao plano de foco. Procure uma diferença no índice de refração, que geralmente ocorre na interface do córtex da lente e do núcleo da lente para identificar o núcleo da lente.
Nota: As lentes adultas saudáveis do tipo selvagem são extremamente transparentes, tornando difícil ver as suturas da lente e o núcleo, ou para determinar a orientação da lente. Neste caso, um ligeiro Nick com fórceps para a cápsula da lente provoca danos menores, o que faz com que as suturas e núcleo da lente aparente em cerca de 10 min ajudando a orientar a lente para esta medição. No entanto, as lentes se tornam inutilizáveis para aplicações a jusante como eles estão agora danificados. - Tirar imagens de lentes com o núcleo da lente em foco iluminação de campo brilhante com ou sem óptica DIC usando um microscópio de dissecção com uma câmera anexada. Imagem um micrômetro a mesma ampliação para a calibração.
- Clique no botão de visualização ao vivo, ajuste as configurações de exposição para visualizar o núcleo da lente e periferia da lente, e tirar uma imagem clicando no botão snap shot. Salvar como um arquivo TIF.
- Use o software de processamento de imagem para calibrar as imagens da lente adquirida. Selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha de comprimento conhecido na imagem do micrômetro, clique em analisar | escala ajustada. Insira a distância conhecida, as unidades e selecione a calibração "global" e clique em OK.
- Meça a distância do centro do núcleo da lente ao pólo anterior (a-r).
- Use a ferramenta de linha reta no software de processamento de imagem para desenhar uma linha através do centro imaged do núcleo da lente em uma orientação axial. Tome o centro desta linha como o centro do núcleo da lente.
- Desenhe outra linha a partir deste ponto para o pólo anterior da lente e selecione ' medida ' no menu ' analisar ' para medir a distância (a-r), onde a é o raio da lente e r é a distância do centro da lente para o centro da Núcleo.
- Desenhe outra linha do anterior para os pólos posteriores e meça esta distância como o diâmetro da lente (2a). Copie esses comprimentos da janela ' Results ' e transfira para uma planilha ou programa de estatísticas.
Nota: É mais fácil medir precisamente a partir do centro do núcleo para o pólo anterior, do que medir a partir do centro do núcleo da lente para o centro da lente. Esta medida é convertida pela fórmula na etapa 10.3.5 para relatar a distância do centro do núcleo da lente ao centro da lente. Use sempre o núcleo adulto para medições, mesmo que o núcleo embrionário seja evidente. - Divida o diâmetro por 2, para calcular o raio da lente, a.
- Calcule r/a, como
, que é a localização normalizada do núcleo da lente em relação ao raio da lente.
Nota: para um núcleo posicionado mais próximo do pólo anterior, r/a será > 0,0, enquanto um núcleo centralmente localizado terá um r/a de 0,0.
- Faça um gráfico do log da medida do núcleo axial normalizado em função do comprimento padrão para determinar alterações na localização do núcleo da lente durante o desenvolvimento do zebrafish.
, que é a localização normalizada do núcleo da lente em relação ao raio da lente.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A anatomia ocular adulta do zebrafish assemelha-se pròxima àquela dos mamíferos (Figura 1a). Apesar de algumas diferenças entre os olhos de zebrafish e de mamíferos, tais como ter uma zona ciliar em vez de um corpo ciliar17, diferenças em propriedades óticas18, e diferenças na morfogênese durante o desenvolvimento embrionário19, o o olho de zebrafish é um modelo excelente para estudar o desenvolvimento do olho e compreender a doença ophthalmic20,21,22. Um epitélio simples alinha o pólo anterior da lente, que no Equador sofre um processo de longa duração de proliferação, alongamento e diferenciação em células de fibra, constituindo a maior parte da lente. As células de fibras maduras (Figura 1b, azul claro) primeiro se diferenciam no embrião, são desprovidas de organelas e nunca são substituídas. Diferenciando as pontas da pilha de fibra encontram-se nos pólos para dar forma às suturas anteriores e posteriores. Estas células são então internalizadas por células de fibra recém-diferenciadas. Como todas as lentes de vertebrados, a lente zebrafish, portanto, tem um gradiente de desenvolvimento com as células mais antigas localizadas no centro do núcleo da lente. As formas do placode da lente do zebrafish em 16 h postfertilização (HPF), que alongam para dar forma às fibras de lente preliminares em 18 HPF, e as fibras secundárias formam a zona da transição em 28-36 HPF. A sutura posterior é visível em 48 HPF, o que é antes que a sutura anterior se torne visível10.
O desenvolvimento preciso e a manutenção da arquitetura regular da lente são essenciais para sua óptica. Aqui nós descrevemos métodos para a análise da morfologia da pilha da lente do zebrafish in vitro e in vivo, incluindo vantagens e limitações, que nós desenvolvemos para analisar fenótipos resultando dos mutantes da perda-função de dois zebrafish Aqp0s, Aqp0a e Aqp0b1. Para avaliação da morfologia da lente adulta in vitro, as lentes foram dissecadas (Figura 2) e imediatamente fixas. A avaliação embrionária foi realizada em embriões fixos inteiros (Figura 3) e comparada aos embriões transgênicos vivos (Figura 4). As lentes adultas dissecadas e fixas (Figura 5) foram comparadas com as lentes adultas transgênicas imaginadas ao vivo (Figura 6). As diferenças na detecção e visualização de partes específicas da lente usando esses métodos são resumidas (tabela 1).
Phalloidin foi encontrado para ser superior para etiquetar membranas da pilha de fibra da lente no zebrafish comparado à aglutinina do germe do trigo (WGA). WGA é uma lectina que se liga a N-acetil-D-glucosamina e ácido siálico, e WGA conjugada a fluoróforos é tipicamente utilizado para rotular as membranas celulares de fibra de lente em humanos23, bovinos24, ovina25, rato26, Rat27 e zebrafish28,29. Aqui usamos faloidina em lentes zebrafish inteiras (Figura 3, Figura 5).
Larvas de zebrafish embrionárias e larvais até 7 DPF são pequenas e permeáveis o suficiente para permitir a penetração de faloidina no córtex exterior da lente. Por 3 DPF o núcleo da lente é compacto e desprovido de organelas, as suturas anteriores formam-se no pólo anterior (Figura 3a,B), e a phalloidina é excluída do núcleo da lente em um plano óptico Equatorial (Figura 3C,D). A phalloidina é provavelmente excluída do núcleo devido à alta compactação das membranas celulares de fibra, consistente com estudos anteriores28. No entanto, o córtex exterior é visualizado em grande detalhe com esta coloração (Figura 3C-F). Na seção transversal, as pilhas da fibra tomam em uma forma sextavada aplaçado, com lados largos mais longos, e uns lados estreitos mais curtos. O Phalloidin etiqueta fortemente as membranas de pilha estreitas e largas da fibra (Figura 3E-F) destacando a compactação das pilhas corticais da fibra entre lados largos. Esta organização é em grande parte não afetada em aqp0a/b mutantes duplos (Figura 3B, D, F e H).
A expressão do mosaico do transgene (mApple tethered à membrana de pilha pelo motivo de CAAX conduzido por uma região do promotor do BP do 300 do promotor do crystallin do βB1 humano) expressa fortemente nas lentes que começam em 2 DPF. O transgene é integrado aleatòria no genoma tendo por resultado a expressão heterogêneo de Mapple. Mostramos exemplos de uma lente de 3 DPF com forte expressão no córtex (Figura 4) e expressão em partes do núcleo (Figura 4D). O marcador da membrana não é limitado pela permeabilidade como o Phalloidin, assim ele etiqueta o núcleo da lente. Mosaicos (Figura 4) gerados por injeções de DNA que só são expressos em um pequeno subconjunto de células são úteis para a análise de morfologias de células individuais em comparação com linhas estáveis, que rotulam cada célula que expressa βB1 cristallin (Figura 6). Nos mosaicos TG (βB1cry: mAppleCAAX) a morfologia da sutura anterior pode ser visualizada em projeções z tomadas no pólo anterior (figura 4a,B). Note-se que a morfologia das membranas celulares difere de lentes fixas rotuladas com faloidina (Figura 3a,B), e presença de subdomínios em membranas de células largas (figura 4a' setas brancas) previamente identificadas em lentes de outros espécie30 é visível. No entanto, a rotulagem mais fraca das membranas de células de fibra estreita resulta em incapacidade de ver a convergência marcante das células na sutura anterior (figura 4a, setaB ) observada em lentes fixas rotuladas com faloidina (Figura 3a,b setas).
Curiosamente, fatias ópticas tomadas no Equador da lente também revelam um padrão de rotulagem diferente, com perturbações óbvias para o volume celular no aqp0a/b mutantes duplos em comparação com WT (Figura 4C-F). Isto é provável porque os rótulos transgênicos largas membranas de células de fibra de forma mais eficaz do que a Phalloidin. Pudemos obter projeções z através do pólo posterior para analisar a integridade da sutura posterior com o uso de Z-Correction, que aumentou a potência do laser com profundidade no tecido. A análise desobstruída da sutura do posterior (Figura 4G,H) no peixe intacto foi limitada aos primeiros 5 DPF, e em seguida que a lente era demasiado densa, tendo por resultado a perda de sinal na parte do posterior da lente.
As lentes adultas dissecadas fixas marcadas com faloidina revelaram o detalhe impressionante na arquitetura altamente requisitada das fileiras da pilha de fibra que convergindo para dar forma a suturas anteriores (Figura 5a, seta) e a morfologia do córtice (Figura 5C-H), devido à rotulagem muito forte de membranas de células estreitas de fibra por Phalloidin. O máximo Z-projeções do pólo anterior revelaram a perda de uma sutura anterior apertada em lentes dobro do mutante de aqp0a/b (Figura 5b, seta), comparada ao WT (Figura 5a, seta), que evidente como uma massa das membranas e dos núcleos da pilha em ótico fatias de 30 μm do pólo anterior (Figura 5D). Em fatias ópticas mais profundas, a rotulagem de faloidina foi excluída do córtice e do núcleo mais profundos da lente (Figura 5E,F). A organização geral das fileiras de células de fibra no córtex exterior foi um pouco afetada pela falta de uma sutura anterior apertada em lentes mutantes duplas aqp0a/b , tornando impossível posicionar as lentes exatamente perpendiculares ao plano de imagem (Figura 5F ) em comparação com as lentes WT (Figura 5E). No entanto, imagens de alta potência de linhas de células de fibra tomadas no plano equatorial revelaram que as células no córtex exterior ainda formaram fileiras ordenadas, visíveis devido à forte rotulagem de células de fibra estreita (Figura 5g,H). Era impossível discernir as membranas largas individuais da pilha de fibra devido a uma combinação de sua compactação apertada, e sinal fraco. Uma vez que essas lentes foram dissecadas, elas poderiam ser montadas com o lado posterior voltado para o objetivo, permitindo projeções z das suturas posteriores, que não mostraram diferenças entre os genótipos, pois as pontas das células de fibra posterior formaram suturas apertadas (Figura 5I, setasJ ).
Z-projeções de lentes de peixes estáveis adultos anestesiados ao vivo TG (βB1cry: mAppleCAAX) revelam morfologia da membrana cortical no córtex anterior (Figura 6a,a '), bem como a extensão da convergência celular no pólo anterior ( Figura 6B). Foi mais difícil montar o peixe com suturas de lente perpendiculares ao plano de imagem, em comparação com as lentes dissecadas fixas. Linhas estáveis que transportam o transgene expressam o mApple no núcleo da lente (Figura 6C,D). As fatias ópticas no Equador revelaram um forte sinal indicando extensa compactação do núcleo quando imaged com a mesma potência do laser que o córtex anterior (Figura 6C). Curiosamente, nenhuma resolução celular do córtex exterior era evidente em adultos, diferentemente dos embriões. Isto é provavelmente devido à íris bloqueando um sinal claro da periferia da lente. Pode ser possível obter um sinal cortical mais forte da lente pela dilatação da pupila antes da imagem latente. Com a redução da potência do laser, foi possível distinguir algumas camadas celulares no núcleo da lente (Figura 6D). A lente do zebrafish adulto é muito densa, e era impossível obter o sinal do pólo do posterior in vivo.
Nós mostramos que o núcleo da lente do zebrafish se move no eixo ótico de uma posição anterior inicial nas lentes larval a uma posição central nos adultos1. Estes movimentos são destacados em seções da lente axial, porque o faloidina e o WGA são excluídos do núcleo da lente (Figura 7A-C). Nós mostramos que Aqp0a é exigido para este processo1da centralização, mas este mecanismo é provável ser afetado por outras proteínas. A localização do centro do núcleo da lente em relação à sua posição ao longo do eixo ântero-posterior foi medida colocando lentes inteiras dissecadas em sua orientação axial e imagem iluminação DIC, destacando-se pequenas diferenças na Propriedades refrativas (Figura 7E). As suturas têm geralmente um índice refração diferente do que o córtice circunvizinho, assim que pode ser usado como um guia para a orientação. As lentes larvais novas têm umas suturas mais óbvias (suturas do posterior em lentes muito novas), e os núcleos da lente, que têm um índice refração diferente, são obviamente assimétricos, fazendo o mais fácil orientar lentes nestes estágios. A distância relativa do centro do núcleo da lente do centro da lente (r) é normalizada para o raio da lente (a). Isto é então grafado com relação ao desenvolvimento do zebrafish, para que a medida padrão do comprimento é usada13. No WT, o núcleo da lente começa mais perto do pólo 
da lente anterior e, em seguida 
, centraliza-se na idade adulta (Figura 7F).
Figura 1 : Olho adulto de zebrafish e diagrama da lente. Anterior é tomado como onde a luz entra no olho, que no zebrafish é realmente lateral. (A) a lente zebrafish juntamente com a luz de foco da córnea na retina. Em animais aquáticos, a córnea desempenha um papel menor na refração da luz, mas em vez disso, a lente tem um maior índice de refracção18. A lente separa a câmara anterior preenchida com humor aquoso e câmara posterior preenchida com humor vítreo. (B) a lente zebrafish é mais esférica do que as lentes de mamíferos. As pontas da pilha de fibra encontram-se no ponto ou nas suturas8 do cordão umbilical nos pólos anteriores e posteriores. Diferenciando as células de fibra no córtex da lente têm núcleos e organelas, enquanto as células de fibra madura no núcleo da lente (azul claro) são desprovidos de organelas e núcleos. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Dissecção da lente de zebrafish. A) os olhos são dissecados a partir de peixe anestesiado e colocados no lado posterior (B). (C) os olhos são imobilizados por fórceps através do disco óptico (OD) e duas a três incisões radiais são feitas em retina e esclera do disco óptico para as zonules. (D) Dobre as abas para fora para revelar a lente. (E) Gire o olho para enfrentar a córnea para cima, imobilizar a lente indiretamente através da córnea e afastar a esclera-retina. (F) aparar a retina remanescente e zona ciliar/zonules da lente. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Morfologia da lente embrionária in vitro. Embriões fixos e permeabilizados rotulados com faloidina (vermelho) e núcleos celulares com DAPI (azul) revelam morfologia da membrana e integridade de sutura nos pólos. Z-projeções revelam que as lentes Double Mutant do WT e do aqp0/b exibem o arranjo muito regular da pilha de fibra que se encontram em uma sutura anterior muito apertada (setas) em 3 DPF (a, b). As fatias óticas tomadas no Equador revelam fileiras apertadas de células de fibra hexagonal embaladas no córtex externo em ambos os genótipos (C-F). Ambos, os lados estreitos e largos de membranas de pilha da fibra são etiquetados como mostrado dentro (E). As suturas posteriores (setas) são formadas e apertadas em ambos os genótipos (G, H). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Morfologia da lente embrionária in vivo. Imagens ao vivo de lentes anestesiadas 3 DPF de mosaico F0 injetadas TG (βB1cry: mAppleCAAX) revelam suturas anteriores (setas) em projeções z (A, B). (a ') Subdomínios de membrana são evidentes como puncta (setas brancas) em membranas de células de fibra largas. Membranas de células de fibra estreitas também são evidentes (setas pretas). As lentes WT revelam células de fibra cortical de lente firmemente embaladas (C, E), comparadas ao córtex interrompido de mutantes duplos aqp0a/b - com células inchadas evidentes (D, F). A focagem nas suturas posteriores (g, h) (setas) não revela diferença entre os genótipos (g, h). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Morfologia da lente adulta in vitro. As lentes excisadas, fixas e permeabilizadas de peixes com mais de 23 mm de comprimento padrão foram marcadas com faloidina (vermelho) e DAPI (azul). 150 μm Z-projeção no pólo anterior revelam o arranjo estrito das pontas da pilha de fibra que convergindo em uma sutura apertada (seta) no WT (a), mas não nos mutantes dobro de aqp0a/b (seta), que têm preferivelmente uma massa das membranas e dos núcleos (b). Uma fatia óptica tomada 42 μm do pólo anterior revela células ordenadas convergindo no centro em WT (C), mas uma massa de núcleos onde a sutura deve estar em lentes mutantes (D). As fatias ópticas através do Equador da lente, em 130 μm do pólo anterior revelam fileiras firmemente embaladas de células de fibra em WT (e, G) e mutantes (F, H). As suturas posteriores (setas) são formadas e apertadas em ambos os genótipos (I, J). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 Morfologia da lente adulta in vivo. Imagem latente viva de lentes estáveis anestesiadas adultas do WT do TG (βB1cry: mAppleCAAX) . As projeções Z no córtex anterior revelam morfologia cortical (a, a ') e sutura anterior (seta), com células convergentes para um ponto em uma única fatia óptica (B, seta). O córtex pode ser visualizado em maior potência do laser em uma fatia óptica através do Equador (C), em comparação com a forma de sinal mais forte do núcleo da lente (D). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Centralização do núcleo da lente zebrafish. Os embriões fixos e crioprotegidos (a) e as lentes (B, c) foram crio-seccionados axialmente e rotulados com phalloidin-546 (vermelho em a, b), DAPI (azul em a, b) ou WGA-594 (vermelho em c). O núcleo da lente é desprovido de núcleos celulares, e é colocado mais perto da lente anterior (a) em 3 DPF (a), e em lentes de 1 mês de idade (B), comparado a ser centralmente colocado em lentes adultas (C). As lentes dissecadas de um zebrafish velho de 1 mês do comprimento padrão de 4,1 milímetros foram orientadas equatorialmente (D), ou axialmente (E). A localização relativa do núcleo da lente no eixo foi calculada utilizando-se a seguinte estratégia: (E) a distância do centro (*) do núcleo da lente (linha pontilhada branca) foi medida para o pólo anterior, pois isso mais prático do que medir a distância (r) para o centro da lente (mais). Isso foi normalizado para o raio da lente (a), que foi medido de forma íntima como o diâmetro da lente axial (Ant.-pos.). O log da localização do núcleo axial normalizado foi grafado em função do desenvolvimento do zebrafish, medido pelo comprimento padrão (F). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Recurso | Embrião de IHC | Embrião TG | Lente inteira do adulto de IHC | TG Adult |
| Viver | N | Y | N | Y |
| Sutura anterior | Y | Algo | Y | Algo |
| Sutura posterior | Y | Y | Y | N |
| Detalhe celular cortical | Algo | Y | Y | Anterior um pouco |
| Detalhe do núcleo da lente | N | Y (estável) | N | Y (estável) |
| Rótulo secundário | Y-anticorpos | Viver apenas com apenas TG | Y-anticorpos | Viver apenas com apenas TG |
| Etiqueta larga/estreita da fibra | Ambos | Ampla | Na maior parte estreito | Ampla |
Tabela 1: Resumo da comparação dos métodos in vivo vs in vitro para análise da morfologia da lente em zebrafish. Y = Sim, N = não
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Discussion
A análise da morfologia da lente zebrafish é o passo inicial na compreensão de fenótipos em mutantes, ou os efeitos de intervenções farmacológicas destinadas a estudar a biologia da lente ocular. Nós esboçam métodos para analisar suturas da lente, morfologia cortical da pilha da fibra e aspectos do núcleo da lente. Estas abordagens são uma combinação de in vitro e in vivo (em comparação com a tabela 1). Os métodos in vitro permitem maior detalhamento da morfologia das células corticais externas, bem como o acesso à sutura posterior em lentes adultas.
A análise in vivo é possível com o uso de marcadores transgênicos. O transgene que apresentamos aqui é específico da membrana da lente, em comparação com a linha Q01 zebrafish existente, que, enquanto a rotulagem das membranas da lente também rótulos outros tipos de células no olho, incluindo as células de amacrina, complicando a interpretação11 . O sinal in vivo é limitado pelo Epitélio pigmentado do olho, que se forma durante o segundo dia de embriogênese, de modo que os embriões precisam ser PTU tratados para análise neste e estágios subsequentes. Em adultos, a íris obscurece a análise clara do córtex da lente, mas permite a análise in vivo do córtex da lente anterior. A imagem latente viva de lentes dos peixes permite estudos longitudinais da morfologia da lente no mesmo animal. Esta pode ser uma ferramenta extremamente útil para estudar efeitos em processos dinâmicos, como a ruptura do volume celular em resposta a perturbações osmóticas ou farmacológicas. Um achado inesperado é que podemos Visualizar claramente os subdomínios da membrana em membranas de células de fibra ampla nos transgênicos larvais vivos, mas não em lentes fixas. Isso destaca a diferença na rotulagem pelo transgene e Phalloidin, bem como o fato de que esses subdomínios podem ser afetados pelo processo de fixação.
A análise dos mecanismos moleculares da centralização do núcleo da lente usando os métodos que descrevemos pode revelar mecanismos essenciais para o desenvolvimento de propriedades ópticas da lente. Embora, até o momento, a assimetria do núcleo da lente axial só tenha sido relatada em zebrafish, estudando esse processo, é provável que obtenhamos insights sobre os mecanismos necessários para o desenvolvimento de lentes ópticas em outras espécies. No futuro, os animais transgênicos podem ser usados em combinação com outras aplicações-como estudos de superexpressão, com o uso de um marcador de transgênese verde. Estes poderiam ser usados para estudar efeitos de overexpressando uma proteína específica na lente, ou para o salvamento dos fenótipos em Mutants existentes.
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Disclosures
Não temos divulgações.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer a nossa fonte de financiamento: NIH R01 EY05661 para J. E. H, Ines Gehring para ajudar com a geração do aqp0a/b mutantes duplos e husbandry zebrafish, Dr. Daniel Dranow para as discussões que levam à geração dos transgênicos, Dr. Bruce Blumberg e os laboratórios do Dr. Ken Cho para o uso de seus microscópios de dissecação, e Dr. Megan Smith para ajudar com a análise estatística.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21 °C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION - toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
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