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Biology

Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Ces protocoles ont été élaborés pour analyser la morphologie des lentilles corticales, l’intégrité structurale des sutures de lentilles poisson zèbre dans les lentilles fixes et vivantes et pour mesurer la position du noyau de lentille de zébrafish le long de l’axe antérieur-postérieur.

Abstract

Le zébrafish est particulièrement adapté à la manipulation génétique et à l’imagerie in vivo , ce qui en fait un modèle de plus en plus populaire pour les études génétiques inverses et pour la production de transgénics pour l’imagerie in vivo . Ces capacités uniques font du poisson zèbre une plate-forme idéale pour étudier le développement de lentilles oculaires et la physiologie. Nos récentes découvertes qu’un aquaporin-0, Aqp0a, est nécessaire pour la stabilité de la suture de lentille antérieure, ainsi que pour le déplacement du noyau de l’objectif au centre de lentilles avec l’âge nous a conduit à développer des outils particulièrement adaptés à l’analyse des propriétés des lentilles poisson zèbre. Ici, nous décrions des méthodes détaillées pour la dissection lentille qui peut être appliquée à la fois larvaire et lentilles adultes, pour les préparer pour l’analyse histologique, immunohistochimie et l’imagerie. Nous nous concentrons sur l’analyse de l’intégrité des suture des lentilles et la morphologie des cellules corticales et comparons les données générées à partir de lentilles disséqué avec des données obtenues à partir de l’imagerie in vivo de la morphologie des lentilles rendue possible par une nouvelle lignée de zébrafish transgénique avec un génétiquement marqueur fluorescent codé. L’analyse des lentilles disséqué perpendiculaires à leur axe optique permet de quantifier la position relative du noyau de l’objectif le long de l’axe antérieur-postérieur. Le mouvement du noyau d’objectif d’une position antérieure initiale au centre est exigé pour l’optique normale de lentille dans le zebrafish adulte. Ainsi, une mesure quantitative de la position nucléaire de lentille est directement corrélée avec ses propriétés optiques.

Introduction

Le poisson zèbre est un excellent modèle pour étudier le développement de lentilles et la physiologie en raison des similitudes anatomiques aux lentilles mammaliennes, la facilité relative de manipulation génétique et pharmacologique, la vitesse du développement des yeux embryonnaires, la petite taille et la transparence à des stades précoces permettant l’imagerie in vivo . Les méthodes décrites ici ont été développées pour analyser la morphologie des lentilles de zébrafish aux stades embryonnaires et adultes, en se concentrant sur l’intégrité suturale, la morphologie membranaire corticale in vitro et in vivo, et l’emplacement de la position nucléaire de l’objectif le long de la l’axe antérieur-postérieur ex vivo. Ces méthodes servent de point de départ pour les études fonctionnelles du développement de lentilles et de la physiologie, ainsi que des écrans génétiques inverses pour les phénotypes de lentilles dans le zébrafish.

Imagerie de la morphologie des lentilles poisson zèbre

Aquaporin 0 (AQP0) est la protéine la plus abondante de membrane de lentille et est critique pour le développement de lentille et la clarté, en raison de multiples fonctions essentielles chez les mammifères. Zebrafish ont deux Aqp0s (Aqp0a et Aqp0b) et nous avons développé des méthodes pour analyser la perte de leurs fonctions dans les lentilles embryonnaires et adultes. Nos études révèlent que les mutants aqp0a-/-développent l’opacité polaire antérieure en raison de l’instabilité de la suture antérieure, et que les mutants doubles aqp0a/b développent l’opacité nucléaire1. AQP0 a été montré à jouer des rôles dans le transport de l’eau2, l’adhérence3,4, l’ancrage cytosquelettique5 et la génération du gradient de l’indice de réfraction6, mais ces études ont été largement réalisées dans et non vitro. Le zébrafish offre une occasion unique d’étudier comment la perte de fonction, ou la fonction perturbée de Aqp0a ou Aqp0b affecterait la morphologie et la fonction dans un objectif vivant. Pour évaluer la morphologie des cellules de lentilles et l’intégrité de la suturie pendant le développement, nous avons modifié les méthodes immunohistochimiques in vitro existantes7 pour les lentilles embryonnaires et adultes et avons généré des transgéniques pour surveiller ce processus in vivo .

L’analyse immunohistochimique de la structure membranaire plasmatique et l’intégrité suturale ont été effectuées dans des embryons fixes entiers et des lentilles adultes. Les lentilles zebrafish sont extrêmement petites (le diamètre de l’objectif est ~ 100 μm dans les embryons et jusqu’à 1 mm chez les adultes) par rapport à leurs homologues mammifères et ont des sutures ponctuelles8, qui sont rarement capturées dans les Cryosections. Ainsi, les lentilles entières sont essentielles pour l’analyse de l’intégrité suturale. Pour l’analyse in vivo de la formation de suture antérieure et l’imagerie de l’architecture de cellules de lentilles précises, nous avons généré des transgéniques exprimant spécifiquement des membranes d’objectif de Mapple.

Les avantages de l’imagerie en direct des transgéniques membranaires de l’objectif comprennent: 1) éviter les artefacts de fixation, 2) étudier les changements morphologiques dynamiques dans les films Time-lapse, et 3) permettre des études longitudinales dans lesquelles des événements antérieurs peuvent être corrélés avec plus tard Phénotypes. La pigmentation de l’iris empêche normalement l’imagerie claire de la périphérie de l’objectif. L’addition de 1-phényl 2-thiourea (PTU) avant l’étape9 du primordia-5 (Prim-5) prévient la mélanogenèse et la pigmentation oculaire jusqu’à environ 4 jours après la fécondation (DPF). Cependant, après 4 DPF, la périphérie de la lentille est obscurcie in vivo, enparticulier à des stades plus anciens. En outre, la densité de la lentille elle-même obscurcit l’imagerie de son pôle postérieur. Par conséquent, pour étudier la morphologie de la périphérie de la lentille, ou la suture postérieure, après 4 DPF, les lentilles doivent être excisées et fixées.

Des lignées de zébrafish transgéniques ont été utilisées pour analyser la structure membranaire des lentilles embryonnaires in vivo10. Le transgénique Q01 exprime une protéine fluorescente cyan fusionnée à une séquence de ciblage membranaire, Gap43, entraînée par le promoteur EF1α et un hexamère de l’élément Df4 Pax6 Enhancer façon ubiquitaire dans les cellules de fibre optique11. Q01 a l’expression extra-lenticulaire, y compris les cellules d’amacrines dans la rétine, qui ajoute le signal d’arrière-plan si l’intérêt principal est l’objectif. Nous avons développé une nouvelle ligne transgénique qui exprime une mApple membranaire spécifiquement dans la lentille, dans le but d’éviter tout signal extra-lenticulaire.

Localisation du noyau de l’objectif

Nous avons découvert que le noyau de l’objectif se déplace d’un emplacement antérieur initial dans le zébrafish larvaire à un emplacement central dans l’axe antérieur-postérieur dans les lentilles adultes. Ce changement dans la position du noyau de lentille de l’indice de réfraction élevé est considéré comme une exigence pour le développement normal de l’optique de lentille de zébrafish1. Nos méthodes permettent de quantifier la centralisation nucléaire de l’objectif par rapport au rayon de l’objectif. En utilisant cette méthode, nous avons montré que Aqp0a est nécessaire pour la centralisation de la lentille nucléaire1, et cette méthode simple peut être appliquée à d’autres études sur le développement et la physiologie de l’objectif et ses propriétés optiques dans le modèle de zébrafish.

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Protocol

Les protocoles animaux utilisés dans cette étude adhèrent à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie à Irvine.

1. l’élevage et l’euthanasie du zébrafish

  1. Élever et maintenir le zébrafish (souche AB) dans des conditions de laboratoire normales12. Élever des embryons dans le milieu embryonnaire (EM)12. Ajouter 0,003% de PTU à l’EM à partir de 20-24 h après la fertilisation (avant le stade Prim-5) pour empêcher la formation de pigments dans les embryons12 utilisés pour l’imagerie aux stades embryonnaires9. Élever les larves à partir de 6-30 jours après la fertilisation (DPF) sur un régime de rotifères vivants jusqu’à 14 DPF, et Artemia vivants après 14 DPF12.
    Attention: La PTU est très toxique
  2. Anesthésier les poissons à l’aide de tricaïne jusqu’à ce qu’ils ne réagissent pas au toucher.
    1. Préparer le stock de tricaïne en combinant 400 mg d’acidéthylester 3-amino benzoïque, avec 2,1 mL de tris 1 M (pH 9), dans 100 mL de ddH2O. ajuster au pH 7,0 et conserver à-20 ° c.
      Attention: La tricaïne est toxique.
    2. Diluer 4,2 mL de stock de tricaïne dans 100 mL d’eau du réservoir pour anesthésier les larves/adultes ou l’EM pour anesthésier les embryons (concentration finale de tricaïne à 0,0165% p/v).

2. fixation des embryons et des larves

Remarque: Les protocoles immunohistochimiques ont été adaptés à partir de documents publiés antérieurement7.

  1. Fixer des embryons ou des larves déchorionés jusqu’à 2 semaines après la fécondation dans 4% (v/v) de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant la nuit à 4 ° c sur un rocker.
    Attention: L’PFA est combustible et est cancérogène.
  2. Laver les embryons trois fois pendant 10 min dans le PBS, et perméabilize dans le PBS avec 10% de Triton et 1% de DMSO (PBS-T) pendant la nuit à 4 ° c.
    Attention: DMSO est toxique, est nocif par ingestion ou absorption cutanée, transporte des matières dangereuses par la peau, et est combustible. Le Triton est toxique, corrosif et dangereux pour les milieux aquatiques.

3. dissection des lentilles de larves et de zebrafish adultes

  1. Anesthésier les poissons de 6 DPF larves à l’âge adulte avec tricaïne jusqu’à ne pas répondre au toucher, mais toujours montrant un battement de coeur fort. Mesurer la longueur standard du poisson selon le Schilling (2002) pour la mise en scène13.
  2. Immédiatement les yeux d’accise utilisant des ciseaux de micro-dissection et placez dans un plat de dissection dans le PBS (figure 2 montrée pour les yeux adultes).
    1. Faites un plat de 35 mm personnalisé rempli de silicone pour les dissections d’objectif. Une fois que le silicone a fixé, accise un Divot autour 2-3 mm de diamètre et 0,5 mm de profondeur pour immobiliser les yeux adultes/lentilles pendant la dissection.
  3. Dissection des lentilles poisson zèbre adultes
    1. Placez un oeil adulte dans le plat Divot côté postérieur vers le haut rempli de PBS. Immobilisez l’œil en insérant des pinces à < angle de 45 ° à travers le disque optique. Veillez à ne pas Nick ou comprimer la lentille. Faire deux ou trois incisions radiales à travers la rétine et la sclérotique du disque optique à la zone ciliaire avec des ciseaux de dissection.
    2. Peler la rétine et la sclérotique comme des pétales de fleurs et inverser l’œil, côté cornée vers le haut. Immobilisez la lentille indirectement par la manipulation de la sclérotique et de la cornée avec le côté plat des ciseaux, tout en tirant loin la rétine et les tissus attachés avec forceps. Coupez délicatement l’excès de tissu de la lentille.
      Remarque: Il est vital de disséquer soigneusement pour obtenir des lentilles constamment saines.
  4. Dissection des lentilles de zébrafish larvaire
    1. Placez un côté larvaire postérieur vers le haut sur la partie plate du plat en silicone rempli de PBS et utilisez une aiguille de tungstène aiguisée pour faire des coupes radiales à travers la rétine et la sclérotique tout en immobilisant l’œil avec une autre aiguille de tungstène ou forceps.
      Remarque: Veillez à ne pas endommager la lentille.
      1. Aiguisez l’embout d’une longueur de 2 cm de 0,1 mm de fil de tungstène électrolytiquement en suspendant la pointe du fil en NaOH à 10% (p/v) et en appliquant un courant alternatif à basse tension14. Fixez l’aiguille dans une pipette Pasteur en fondant l’extrémité du verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.
        Remarque: D’autres outils de dissection fine peuvent également être utilisés.
        Attention: Le NaOH est corrosif.
    2. Retirez délicatement la lentille de l’œil dissocié avec un côté émoussé de l’aiguille, et tirez délicatement sur le tissu attaché.

4. fixation des lentilles disséqué

  1. Fixer immédiatement les lentilles disséqué dans 1,5% (v/v) PFA en PBS pendant 24 h à température ambiante (RT). Laver les lentilles trois fois en PBS pendant 10 min chacune.
  2. Lentilles perméabilize pour l’analyse de montage entier ou cryoprotect pour cryosectionnement (voir rubrique 8).
    1. Lentilles perméabilize en PBS-T pendant la nuit à 4 ° c.

5. immunohistochimie de l’objectif

  1. Membranes d’étiquetage d’embryons fixes ou de lentilles adultes par incubation en phalloidine-Alexa Fluor 546 (1:200) et noyaux cellulaires avec DAPI (1:1000 de 5 mg/ml stock) en PBS-T pendant la nuit à 4 ° c.
    Attention: DAPI est un irritant pour la peau et les yeux.
  2. Laver trois fois avec PBS-T pendant 10 min chacun. Tissus clairs par incubation dans 30%, 50% et 70% de glycérol dans le PBS-T (v/v) pendant au moins 1 h à RT chacun, ou pendant la nuit à 4 ° c.
  3. Montez les poissons en 70% de glycérol dans le PBS-T (v/v) sur les plats de micropuits de fond de verre 35 mm avec les yeux comme plat et droit contre le glissement de couverture que possible. Pour les poissons plus jeunes, une légère inclinaison latérale antérieure peut aider à orienter la suture de l’objectif pour être parallèle à la lèvre.

6. analyse des sutures de lentilles antérieures zebrafish à l’aide d’une ligne transgénique in vivo

  1. Générez des lignes TG (βB1cry: mAppleCAAX) à l’aide du kit Tol215. Le système d’éléments transposables Tol215 permet une intégration stable de la construction où Mapple est entraînée par 300 BP du promoteur humain βb1-crystallin16 attaché à la membrane par la séquence CAAX entraînant l’expression spécifiquement dans les membranes des cellules de fibre optique.
    Remarque: Cette construction (ID: 122451) est disponible à l’achat.
    1. Le matin de l’injection, préparer le mélange d’injection et garder sur la glace. Pour atteindre un volume final de 10 μL contenant de la RNase et de la DNase H2O, ajouter: 1,5 μl de HUβb1Cry: construction de l’ADN mAppleCAAX à 50 ng/μl-[Tol2-0,75 PG/injection finale], 1,5 μl d’ARNm de transposase à 300 ng/μl (kit Tol2)15 [15-30 PG/ injection finale] et 1 μL d’indicateur rouge de phénol à 1% p/v [1 x10-5% (p/v)/injection finale].
    2. Injecter 50-100 pL de mélange d’injection dans des embryons de stade à 1 cellule12.
  2. Mesurez l’efficacité de la transgenèse dans les embryons injectés F0 en mesurant la fréquence des embryons avec des lentilles positives mApple à 3 DPF.
    Remarque: Attendez-vous à avoir une efficacité de transgenèse de > 80% à l’aide de cette méthode. Les mosaïques F0 permettent une analyse détaillée des morphologies membranaires des cellules individuelles. Les différents niveaux de mosaïcisme permettent d’image les morphologies de groupes simples ou petits de cellules, tandis que l’expression plus globale de lentille permet l’analyse des structures multicellulaires comme les sutures de lentille in vivo.
  3. Outcross F0 mosaïque de poissons pour générer des lignes stables, qui Étiquettez toutes les membranes de cellules de fibre. Les fondateurs F0 avec le transgène intégré dans le germinale généreront des descendants avec des intégrations stables qui peuvent être maintenues comme lignes transgéniques.

7. analyse des sutures de lentilles antérieures zebrafish à l’aide d’une ligne transgénique in vivo

  1. Anesthésier 3 DPF ou une mosaïque adulte ou des poissons transgéniques stables et monter dans 1% d’d’agarose à faible fonte (LMA) avec tricaïne avec l’oeil à plat contre le glissement de couvercle des plats de micropuits de fond de verre.
    1. Dissoudre 1 g de LMA dans 100 mL d’EM (sans bleu de méthylène) pour faire 1% de LMA. Stocker à long terme comme 15 mL de stocks à 4 ° c. Micro-ondes pour dissoudre le stock et conserver à 42 ° c jusqu’à ce que chaque tube soit utilisé.
  2. Couvrir le poisson jusqu’à 6 DPF avec l’EM avec tricaïne, ou avec de l’eau de réservoir avec tricaïne pour les adultes quand LMA est fixée.
    1. Mélanger 5 mL d’EM sans le bleu de méthylène ou l’eau du réservoir avec 250 μL de stock de tricaïne et 7 μL de PTU en cas d’imagerie du poisson traité par le PTU.

8. cryosectionnement et immunohistochimie des lentilles

  1. Cryoprotect des embryons fixes ou des lentilles adultes en plaçant 10% de saccharose dans le PBS (w/v), 20% de saccharose pendant 1 h à RT chacun (ou pendant la nuit à 4 ° c) et la nuit dans 30% de saccharose à 4 ° c.
  2. Incorporer le tissu en PTOM dans les moules de base, puis congeler sur les mandrins avec l’OCT. Cryosection à 12-14 μm et recueillir sur un SuperFrost/plus lames de microscope. Sections chaudes sur la glissière pendant 10 min sur un chauffe-lames préchauffé à ~ 35 ° c.
  3. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 10 min chacune. Sections d’étiquettes avec Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) avec DAPI (1:1000) ou WGA-Alexa Flour 594 (1:200), suivie de trois lavages PBS. Monture avec support de montage anti-fondu, et joint de lamelle avec vernis à ongles.

9. l’imagerie

  1. Acquérir des images avec un microscope confocale. Acquérir des piles z ou des tranches optiques à l’aide d’un objectif d’immersion en eau de 60X N/A 1,2, ou similaire, à des régions spécifiques du pôle d’objectif antérieur à postérieur. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants: 1,2 Airy Disc à l’aide du laser 561 nm, Texas Red Filter pour Phalloidin-Alexa Flour 546 ou mApple, ou le laser 405 avec le filtre UV pour DAPI.
  2. Correction de la puissance du laser d’intensité z pour contrer la perte de signal avec la profondeur dans la lentille. Cela permet un signal fort au pôle postérieur des embryons fixes et vivants de 3 DPF, et un signal fort dans les tranches optiques équatoriales dans les lentilles de poissons adultes.
  3. Compilez et visualisez des images à l’aide d’un logiciel de traitement d’image.

10. mesure de la localisation du noyau de l’objectif dans l’axe antérieur-postérieur

  1. Orienter les lentilles fraîchement excisées axialement dans le PBS dans un plat de 35 mm avec un fond de lamelle, avec des poteaux et des sutures orientés parallèlement au plan de mise au point. Recherchez une différence dans l’indice de réfraction, qui se produit généralement à l’interface du cortex de l’objectif et du noyau de l’objectif pour identifier le noyau de l’objectif.
    Remarque: Les lentilles adultes saines de type sauvage sont extrêmement transparentes, ce qui rend difficile de voir les sutures et le noyau de l’objectif, ou de déterminer l’orientation de l’objectif. Dans ce cas, un léger Pseudo avec forceps à la capsule de lentille provoque des dommages mineurs, ce qui rend les sutures et le noyau de l’objectif apparent dans environ 10 min aidant à orienter la lentille pour cette mesure. Cependant, les lentilles deviennent inutilisables pour les applications en aval car elles sont maintenant endommagées.
  2. Prenez des images de lentilles avec le noyau de lentille en focus sous un éclairage de champ lumineux avec ou sans optique DIC à l’aide d’un microscope de dissection avec une caméra attachée. Image un micromètre sous le même grossissement pour l’étalonnage.
    1. Cliquez sur le bouton d’affichage en direct, réglez les paramètres d’exposition pour visualiser le noyau de l’objectif et la périphérie de l’objectif, et prenez une image en cliquant sur le bouton Snap Shot. Enregistrer en tant que fichier TIF.
    2. Utilisez le logiciel de traitement d’image pour calibrer les images de lentilles acquises. Sélectionnez l’outil linéaire et tracez une ligne de longueur connue sur l’image du micromètre, cliquez sur analyser | l’échelle définie. Entrez la distance connue, les unités et sélectionnez l’étalonnage «global», puis cliquez sur OK.
  3. Mesurez la distance du centre du noyau de l’objectif au pôle antérieur (a-r).
    1. Utilisez l’outil linéaire dans le logiciel de traitement d’image pour tracer une ligne à travers le centre imagé du noyau de l’objectif dans une orientation axiale. Prenez le centre de cette ligne comme centre du noyau de l’objectif.
    2. Dessinez une autre ligne à partir de ce point vers le pôle antérieur de l’objectif et sélectionnez «mesure» dans le menu «analyser» pour mesurer la distance (a-r), où a est le rayon de la lentille et r est la distance du centre de la lentille au centre de la noyau.
    3. Tracer une autre ligne de l’avant vers les pôles postérieurs et mesurer cette distance comme le diamètre de l’objectif (2A). Copiez ces longueurs dans la fenêtre «résultats» et transférez-les dans un tableur ou un programme de statistiques.
      Remarque: Il est plus facile de mesurer précisément du centre du noyau au pôle antérieur, que de mesurer à partir du centre du noyau de l’objectif au centre de la lentille. Cette mesure est convertie par la formule de l’étape 10.3.5 pour signaler la distance du centre du noyau de l’objectif au centre de la lentille. Utilisez toujours le noyau adulte pour les mesures, même si le noyau embryonnaire est évident.
    4. Diviser le diamètre par 2, pour calculer le rayon de l’objectif, a.
    5. Calculer r/a, comme Equation 1 , qui est la localisation normalisée du noyau de l’objectif par rapport au rayon de l’objectif.
      Remarque: pour un noyau placé plus près du pôle antérieur, r/a sera > 0.0, tandis qu’un noyau Localisé centralement aura un r/a de 0,0.
  4. Tracer le journal de la mesure normalisée du noyau axial en fonction de la longueur standard pour déterminer les changements dans la localisation du noyau de l’objectif pendant le développement du zébrafish.

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Representative Results

L’anatomie des yeux de la zébrafish adulte ressemble étroitement à celle des mammifères (figure 1a). Malgré certaines différences entre les yeux de zébrafish et de mammifères, comme la présence d’une zone ciliaire au lieu d’un corps ciliaire17, les différences dans les propriétés optiques18, et les différences de morphogenèse au cours du développement embryonnaire19, la poisson zèbre Eye est un excellent modèle pour étudier le développement des yeux et la compréhension de la maladie ophtalmique20,21,22. Un simple épithélium aligne le pôle antérieur de la lentille, qui à l’Équateur subit un processus de prolifération, d’allongement et de différenciation dans les cellules de fibres, constituant la majeure partie de la lentille. Les cellules de fibres matures (figure 1b, bleu clair) se différencient d’abord dans l’embryon, sont dénuées d’organites et ne sont jamais remplacées. Différencier les pointes de cellules de fibre se rencontrent aux pôles pour former les sutures antérieures et postérieures. Ces cellules sont ensuite internalisées par des cellules de fibres nouvellement différenciées. Comme toutes les lentilles vertébrés, la lentille de zébrafish a donc un gradient de développement avec les cellules les plus anciennes situées au centre du noyau de l’objectif. Le placode de lentille de zébrafish se forme à 16 h après la fertilisation (HPF), qui s’allonge pour former les fibres de lentille primaires à 18 HPF, et les fibres secondaires forment la zone de transition à 28-36 HPF. La suture postérieure est visible à 48 HPF, qui est avant que la suture antérieure ne devienne visible10.

Le développement et l’entretien précis de l’architecture de lentille régulière est essentiel pour son optique. Nous décrivons ici les méthodes d’analyse de la morphologie des cellules de lentilles de zébrafish in vitro et in vivo, y compris les avantages et les limitations, que nous avons développé pour analyser les phénotypes résultant de mutants de la perte de fonction de deux Aqp0s poisson zèbre, Aqp0a et Aqp0b1. Pour l’évaluation de la morphologie des lentilles chez les adultes in vitro, les lentilles ont été disséqué (figure 2) et immédiatement fixées. L’évaluation embryonnaire a été réalisée dans des embryons fixes entiers (figure 3) et comparée aux embryons transgéniques vivants (figure 4). Les lentilles adultes disséqué et fixe (figure 5) ont été comparées aux lentilles adultes transgéniques imagées en direct (figure 6). Les différences de détection et de visualisation de certaines parties de l’objectif à l’aide de ces méthodes sont résumées (tableau 1).

On a trouvé que la phalloidine était supérieure pour l’étiquetage des membranes de cellules de fibre optique dans le zébrafish par rapport à l’agglutinine de germe de blé (WGA). Le WGA est une lectine qui se lie à la N-acétyl-D-glucosamine et à l’acide sialique, et le WGA conjugué aux fluorophores est typiquement utilisé pour étiqueter les membranes cellulaires de la fibre optique chez l’homme23, le bœuf24, l’ovin25, la souris26, le rat27 et poisson zèbre28,29. Ici, nous utilisons la phalloidine sur des lentilles poisson zèbre entières (figure 3, figure 5).

Les larves de poisson zèbre embryonnaire et larvaire jusqu’à 7 DPF sont petites et perméables pour permettre la pénétration de la phalloidine dans le cortex externe de la lentille. Par 3 DPF, le noyau de l’objectif est compact et dépourvu d’organites, les sutures antérieures se forment au pôle antérieur (figure 3A,B), et la phalloidine est exclue du noyau de l’objectif dans un plan optique équatorial (figure 3C,D). La phalloidine est probablement exclue du noyau en raison du compactage élevé des membranes cellulaires de fibres, conformément aux études antérieures28. Cependant, le cortex externe est visualisé en détail avec cette coloration (figure 3C-F). Dans la section transversale, les cellules de fibres prennent une forme hexagonale aplatie, avec des côtés plus larges et des côtés étroits plus courts. La phalloidine marque fortement les membranes des cellules à fibres étroites et larges (figure 3e-F) soulignant le compactage des cellules de fibres corticales entre les larges côtés. Cette organisation n’est pas affectée en grande partie aux mutants doubles aqp0a/b (figures 3b, D, F et H).

L’expression mosaïque du transgène (Mapple attaché à la membrane cellulaire par le motif CAAX conduit par une région promoteur de 300 BP du promoteur cristalline humain βb1) exprime fortement dans les lentilles commençant à 2 DPF. Le transgène est intégré au hasard dans le génome, ce qui entraîne une expression hétérogène de mApple. Nous montrons des exemples d’une lentille 3 DPF avec une forte expression dans le cortex (figure 4) et l’expression dans les parties du noyau (figure 4D). Le marqueur de membrane n’est pas limité par la perméabilité comme la phalloidine, ainsi il étiquette le noyau de lentille. Les mosaïques (figure 4) générées par des injections d’ADN qui ne sont exprimées que dans un petit sous-ensemble de cellules sont utiles pour analyser les morphologies cellulaires individuelles par rapport aux lignées stables, qui étiquetent chaque cellule qui exprime la cristalline βb1 (figure 6). Dans les mosaïques TG (βB1cry: mAppleCAAX), la morphologie de la suture antérieure peut être visualisée dans les projections z prises au pôle antérieur (figure 4a,B). Il est à noter que la morphologie des membranes cellulaires diffère des lentilles fixes étiquetées avec la phalloidine (figure 3A,B) et la présence de sous-domaines dans les membranes cellulaires larges (figure 4a'flèches blanches) précédemment identifiées dans les lentilles d’autres l’espèce30 est visible. Cependant, l’étiquetage plus faible des membranes de cellules de fibres étroites entraîne une incapacité à voir la convergence frappante des cellules à la suture antérieure (figure 4a, flècheB ) observée dans les lentilles fixes étiquetées avec la phalloidine (figure 3A,b flèches).

Fait intéressant, les tranches optiques prises à l’Équateur de lentille révèlent également un modèle d’étiquetage différent, avec des perturbations évidentes au volume cellulaire dans les mutants doubles aqp0a/b par rapport à WT (figure 4C-F). C’est probablement parce que les étiquettes transgéniques larges membranes cellulaires de fibres plus efficacement que la phalloidine. Nous avons pu obtenir des projections z par le poteau postérieur pour analyser l’intégrité de la suture postérieure avec l’utilisation de la correction Z, qui a augmenté la puissance laser avec la profondeur dans le tissu. Une analyse claire de la suture postérieure (figure 4G,H) dans le poisson intact a été limitée aux 5 premiers DPF, et après que la lentille était trop dense, entraînant une perte de signal dans la partie postérieure de la lentille.

Les lentilles adultes disséqué marquées avec la phalloidine ont révélé des détails saisissants dans l’architecture hautement ordonnée des rangées de cellules de fibres convergentes pour former des sutures antérieures (figure 5A, flèche) et la morphologie du cortex (Figure 5C-H), en raison de l’étiquetage très fort des membranes de cellules de fibres étroites par la phalloidine. Les projections Z maximales du pôle antérieur ont révélé la perte d’une suture antérieure serrée dans les lentilles mutantes doubles aqp0a/b (figure 5B, flèche), comparativement à la WT (figure 5A, flèche), qui est évidente comme une masse de membranes et de noyaux cellulaires en optique tranches de 30 μm du pôle antérieur (figure 5D). Dans les tranches optiques plus profondes, l’étiquetage de la phalloidine a été exclu du cortex et du noyau de lentille plus profonds (figure 5e,F). L’organisation globale des rangées de cellules de fibres dans le cortex externe a été quelque peu affectée par l’absence d’une suture antérieure serrée dans les lentilles mutantes doubles aqp0a/b , rendant impossible la position des lentilles exactement perpendiculaires au plan d’imagerie (figure 5F ) par rapport aux lentilles WT (figure 5e). Cependant, les images de haute puissance des rangées de cellules de fibres prises dans le plan équatorial ont révélé que les cellules du cortex externe formaient encore des rangées ordonnées, visibles en raison de l’étiquetage étroit des cellules de fibres étroites (figure 5G,H). Il était impossible de discerner les membranes larges de cellules de fibre individuelles dues à une combinaison de leur compactage serré, et signal faible. Puisque ces lentilles ont été disséqué, ils pourraient être montés avec le côté postérieur faisant face à l’objectif, permettant des projections z des sutures postérieures, qui n’ont montré aucune différence entre les génotypes comme extrémités de cellules de fibre postérieures formées des sutures serrées (figure flèches 5I,j ).

Les projections Z des lentilles de poissons vivants anesthésiés adultes stables TG (βB1cry: mAppleCAAX) révèlent une morphologie membranaire corticale dans le cortex antérieur (figure 6A,a'), ainsi que l’étendue de la convergence des cellules au pôle antérieur ( Figure 6B). Il était plus difficile de monter le poisson avec des sutures de lentille perpendiculaires au plan d’imagerie, par rapport aux lentilles fixes disséqué. Les lignes stables portant le transgène expriment le Mapple dans le noyau de l’objectif (figure 6C,D). Des tranches optiques à l’Équateur ont révélé un signal fort indiquant un compactage important du noyau lorsqu’il est imagé avec la même puissance laser que le cortex antérieur (figure 6C). Fait intéressant, aucune résolution cellulaire du cortex externe n’était évidente chez les adultes, contrairement aux embryons. Cela est probablement dû à l’iris bloquant un signal clair de la périphérie de la lentille. Il peut être possible d’obtenir un signal corticale de lentille plus fort par dilatation de l’élève avant l’imagerie. Avec une puissance laser réduite, il était possible de distinguer certaines couches cellulaires dans le noyau de l’objectif (Figure 6d). La lentille poisson zèbre adulte est très dense, et il était impossible d’obtenir le signal du pôle postérieur in vivo.

Nous avons montré que le noyau de lentille poisson zèbre se déplace dans l’axe optique d’une position antérieure initiale dans les lentilles larvaires à une position centrale chez les adultes1. Ces mouvements sont mis en évidence dans les sections de lentilles axiales, car la phalloidine et la WGA sont exclues du noyau de l’objectif (figure 7A-C). Nous avons montré que Aqp0a est nécessaire pour ce processus de centralisation1, mais ce mécanisme est susceptible d’être affecté par d’autres protéines. La localisation du centre du noyau de l’objectif par rapport à sa position le long de l’axe antérieur-postérieur a été mesurée en plaçant des lentilles entières disséqué dans leur orientation axiale et imagerie sous illumination DIC, mettant ainsi en évidence de légères différences dans Propriétés réfractives (figure 7e). Les sutures ont généralement un indice de réfraction différent que le cortex environnant, donc peut être utilisé comme un guide pour l’orientation. Les jeunes lentilles larvaires ont des sutures plus évidentes (sutures postérieures dans les lentilles très jeunes), et les noyaux de lentilles, qui ont un indice de réfraction différent, sont évidemment asymétriques, ce qui rend plus facile d’orienter les lentilles à ces stades. La distance relative du centre du noyau de l’objectif à partir du centre de la lentille (r) est normalisée au rayon de l’objectif (a). Ceci est ensuite représenté par rapport au développement du zébrafish, pour lequel la mesure de longueur standard est utilisée13. En WT, le noyau de l’objectif commence plus près du pôle Equation 2 de l’objectif antérieur, puis Equation 3 se centralise à l’âge adulte (figure 7F).

Figure 1
Figure 1 : Oeil adulte zebrafish et diagramme de lentille. L’antérieur est pris comme où la lumière pénètre dans l’œil, qui dans le zébrafish est en fait latérale. (A) la lentille de zébrafish ainsi que la lumière de focalisation de la cornée sur la rétine. Chez les animaux aquatiques, la cornée joue un rôle mineur dans la réfraction légère, mais au lieu de cela, la lentille a un indice réfringente plus élevé18. L’objectif sépare la chambre antérieure remplie d’humour aqueux et de chambre postérieure remplie d’humour vitreux. (B) la lentille de zébrafish est plus sphérique que les lentilles mammaliennes. Les pointes de cellules de fibre se rencontrent au point ou aux sutures ombilicales8 aux pôles antérieurs et postérieurs. Différencier les cellules de fibre dans le cortex de lentille ont des noyaux et des organites, tandis que les cellules de fibre matures dans le noyau de lentille (bleu clair) sont dépourvus des organites et des noyaux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.    

Figure 2
La figure 2 : Dissection de lentilles zebrafish. (A) les yeux sont disséqué à partir de poissons anesthésiés et placés côté postérieur vers le haut (B). (C) les yeux sont immobilisés par des forceps via le disque optique (OD) et deux à trois incisions radiales sont faites dans la rétine et la sclérotique du disque optique aux zonules. (D) Pliez les volets pour révéler la lentille. (E) tournez l’œil pour faire face à la cornée, immobilisez la lentille indirectement par la cornée et tirez la sclérotique-rétine. (F) Coupez la rétine restante et la zone ciliaire/zonules de la lentille. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Morphologie des lentilles embryonnaires in vitro. Les embryons fixes et perméabilisés marqués avec la phalloidine (rouge) et les noyaux cellulaires avec le DAPI (bleu) révèlent la morphologie membranaire et l’intégrité des suture aux pôles. Les projections Z révèlent que les lentilles à double mutant WT et aqp0/b présentent un arrangement très régulier de cellules de fibres qui se rencontrent à une suture antérieure très serrée (flèches) à 3 DPF (a, b). Les tranches optiques prises à l’Équateur révèlent des rangées serrées de cellules de fibres hexagonales emballées dans le cortex externe dans les deux génotypes (C-F). Les deux côtés, étroits et larges des membranes de cellules de fibre sont étiquetés comme indiqué dans (E). Les sutures postérieures (flèches) sont formées et serrées dans les deux génotypes (G, H). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Morphologie des lentilles embryonnaires in vivo. L’imagerie en direct des lentilles ( βB1cry: mAppleCAAX) de la mosaïque F0 injecté par l’anesthésié 3 DPF A révélé des sutures antérieures (flèches) dans les projections z (A, B). (a') Les sous-domaines membranaires sont évidents comme punctums (flèches blanches) dans les membranes cellulaires à fibres larges. Les membranes des cellules à fibres étroites sont également évidentes (flèches noires). Les lentilles WT révèlent des cellules de fibres corticales de lentille hermétiquement emballées (C, E), comparées au cortex perturbé des mutants doubles aqp0a/b - avec des cellules enflées évidentes (D, F). La focalisation sur les sutures postérieures (g, h) (flèches) ne révèle aucune différence entre les génotypes (g, h). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Morphologie des lentilles adultes in vitro. Des lentilles excisées, fixes et perméabilisées provenant de poissons de plus de 23 mm de longueur standard ont été étiquetées avec de la phalloidine (rouge) et du DAPI (bleu). 150 μm la projection Z au pôle antérieur révèle un arrangement strict des pointes de cellules de fibre convergeant à une suture serrée (flèche) dans le WT (a), mais pas les mutants doubles aqp0a/b (Arrow), qui ont plutôt une masse de membranes et de noyaux (b). Une tranche optique prise 42 μm du pôle antérieur révèle des cellules ordonnées convergeant dans le centre en WT (C), mais une masse de noyaux où la suture doit être dans des lentilles mutantes (D). Des tranches optiques à travers l’Équateur de la lentille, à 130 μm du pôle antérieur révèlent des rangées de cellules de fibres fortement emballées dans le WT (E, G) et les mutants (F, H). Les sutures postérieures (flèches) sont formées et serrées dans les deux génotypes (I, j). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 Morphologie des lentilles adultes in vivo. Imagerie en direct des lentilles WT stables adultes anesthésiés TG (βB1cry: mAppleCAAX) . Les projections Z au cortex antérieur révèlent la morphologie corticale (a, a') et la suture antérieure (flèche), les cellules convergeant en un point dans une seule tranche optique (B, Arrow). Le cortex peut être visualisé à une puissance laser plus élevée dans une tranche optique à travers l’Équateur (C), par rapport à la forme de signal plus fort le noyau de lentille (D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7: Centralisation du noyau de l’objectif zebrafish. Les embryons fixes et cryoprotégés (a) et les lentilles (b, C) ont été axialement Cryo-sectionnés et étiquetés avec phalloidin-546 (rouge dans a, b), DAPI (bleu en a, b) ou WGA-594 (rouge en C). Le noyau de l’objectif est dépourvu de noyaux cellulaires, et est placé plus près de la lentille antérieure (a) à 3 DPF (a), et dans les lentilles de 1 mois (B), par rapport à être placé centralement dans les lentilles adultes (C). Les lentilles disséqué d’un poisson zèbre âgé de 1 mois de 4,1 mm de longueur standard ont été orientées equatorialement (D), ou axialement (E). La localisation relative du noyau de l’objectif dans l’axe a été calculée à l’aide de la stratégie suivante: (E) la distance du Centre (*) du noyau de l’objectif (ligne pointillée blanche) a été mesurée au pôle antérieur, ce qui est plus pratique que la mesure de la distance (r) au centre de la lentille (plus). Ceci a été normalisé au rayon de l’objectif (a), qui a été mesuré de façon intiale comme le diamètre de l’objectif axial (ant.-pos.). Le log de la localisation du noyau axial normalisé a été représenté en fonction du développement du zébrafish, mesuré par la longueur standard (F). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

caractéristique Embryon IHC TG embryon Lentille adulte IHC entière TG Adult
vivre n Y n Y
Suture antérieure Y un peu Y un peu
Suture postérieure Y Y Y n
Détail cellulaire cortical un peu Y Y Antérieur un peu
Détail du noyau de l’objectif n Y (stable) n Y (stable)
Étiquette secondaire Y-anticorps Vivre uniquement avec TG Y-anticorps Vivre uniquement avec TG
Étiquette de fibre large/étroite les deux large Principalement étroit large

Tableau 1: Résumé de la comparaison des méthodes in vivo versus in vitro pour l’analyse de la morphologie des lentilles chez le zébrafish. Y = Oui, N = non

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Discussion

L’analyse de la morphologie des lentilles poisson zèbre est la première étape dans la compréhension des phénotypes chez les mutants, ou les effets des interventions pharmacologiques visant à étudier la biologie de la lentille oculaire. Nous décrions des méthodes pour analyser les sutures de lentilles, la morphologie des cellules en fibres corticales et les aspects du noyau de l’objectif. Ces approches sont une combinaison de in vitro et in vivo (comparé dans le tableau 1). Les méthodes in vitro permettent un plus grand détail de la morphologie des cellules corticales externes, ainsi que l’accès à la suture postérieure dans les lentilles adultes.

L’analyse in vivo est possible avec l’utilisation de marqueurs transgéniques. Le transgène que nous introduisons ici est spécifique à la membrane de lentille, par rapport à la ligne existante de Q01 poisson zèbre, qui tout en étiquettant les membranes d’objectif également étiquettes d’autres types de cellules dans l’oeil, y compris les cellules d’amacrines, compliquant l’interprétation11 . Le signal in vivo est limité par l’épithélium pigmenté de l’œil, qui se forme au cours de la deuxième journée d’embryogenèse, de sorte que les embryons doivent être traités en PTU pour analyse à cette étape et aux stades ultérieurs. Chez l’adulte, l’iris obscurcit l’analyse claire du cortex cristallin, mais permet une analyse in vivo du cortex de l’objectif antérieur. L’imagerie en direct des lentilles de poisson permet des études longitudinales de la morphologie des lentilles chez le même animal. Cela peut être un outil extrêmement utile pour étudier les effets sur les processus dynamiques, tels que la perturbation du volume cellulaire en réponse à des perturbations osmotiques ou pharmacologiques. Une constatation inattendue est que nous pouvons clairement visualiser les sous-domaines membranaires dans les membranes de cellules de fibres larges dans le transgénique larvaire vivant, mais pas dans les lentilles fixes. Cela met en évidence la différence d’étiquetage par le transgène et la phalloidine, ainsi que le fait que ces sous-domaines peuvent être affectés par le processus de fixation.

L’analyse des mécanismes moléculaires de la centralisation des noyaux de lentilles à l’aide des méthodes que nous décrivons peut révéler des mécanismes essentiels au développement des propriétés optiques de l’objectif. Bien que, à ce jour, l’asymétrie du noyau de lentille axiale n’ait été rapportée que dans le zébrafish, en étudiant ce processus, nous sommes susceptibles d’obtenir des informations sur les mécanismes nécessaires pour le développement de lentilles optiques chez d’autres espèces. À l’avenir, les animaux transgéniques peuvent être utilisés en combinaison avec d’autres applications-telles que les études de surexpression, avec l’utilisation d’un marqueur de transgenèse verte. Ceux-ci pourraient être utilisés pour étudier les effets d’une surexformulation d’une protéine spécifique dans la lentille, ou pour le sauvetage des phénotypes dans les mutants existants.

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Disclosures

Nous n’avons aucune information.

Acknowledgments

Nous aimerions souligner notre source de financement: NIH R01 EY05661 à J.-c., ines-c. H. pour avoir aidé à générer les mutants doubles aqp0a/b et l’élevage de zébrafish, le Dr Daniel Dranow pour les discussions menant à la génération des transgéniques, le Dr Bruce Les laboratoires de Blumberg et de Dr Ken Cho pour l’utilisation de leurs microscopes dissécants, et le Dr Megan Smith pour l’aide à l’analyse statistique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

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References

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Biologie numéro 147 zebrafish lentille suture de lentille noyau de lentille AQP0 MIP imagerie en direct développement de lentilles transgéniques
Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale
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Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

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