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Biology

Valutazione del nucleo di lenti zebrafish localizzazione e integrità suturale

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Questi protocolli sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti corticali, l'integrità strutturale delle suture delle lenti pesce zebra in lenti fisse e Live e per misurare la posizione del nucleo della lente pesce zebra lungo l'asse anteriore-posteriore.

Abstract

Il pesce zebra è particolarmente adatto alla manipolazione genetica e all'imaging in vivo , rendendolo un modello sempre più diffuso per gli studi genetici inversi e per la generazione di transgeniche per l'imaging in vivo . Queste capacità uniche rendono il pesce zebra una piattaforma ideale per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti oculari. I nostri recenti risultati che un aquaporin-0, Aqp0a, è necessario per la stabilità della sutura dell'obiettivo anteriore, così come per lo spostamento del nucleo della lente al centro dell'obiettivo con l'età ci ha portato a sviluppare strumenti particolarmente adatti ad analizzare le proprietà delle lenti pesce zebra. Qui delineamo metodi dettagliati per la dissezione delle lenti che possono essere applicate sia alle lenti larvale che agli adulti, per prepararle per l'analisi istologica, l'immunoistochimica e l'imaging. Ci concentriamo sull'analisi dell'integrità della sutura dell'obiettivo e della morfologia delle cellule corticali e confrontiamo i dati generati dalle lenti dissezionate con i dati ottenuti dall'imaging in vivo della morfologia delle lenti resa possibile da una nuova linea di pesce zebra transgenica con un geneticamente marcatore fluorescente codificato. L'analisi delle lenti dissezionate perpendicolari al loro asse ottico consente di quantificare la posizione relativa del nucleo dell'obiettivo lungo l'asse anteriore-posteriore. Il movimento del nucleo dell'obiettivo da una posizione anteriore iniziale al centro è necessario per le ottiche lente normali nel pesce zebra adulto. Pertanto, una misura quantitativa della posizione nucleare dell'obiettivo è direttamente correlata alle sue proprietà ottiche.

Introduction

Il pesce zebra è un ottimo modello per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti a causa delle somiglianze anatomiche con le lenti dei mammiferi, la relativa facilità di manipolazione genetica e farmacologica, la velocità di sviluppo embrionale degli occhi, le piccole dimensioni e la trasparenza fasi iniziali che consentono l'imaging in vivo . I metodi qui descritti sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti pesce zebra a stadi embrionali e adulti con particolare attenzione all'integrità suturale, alla morfologia della membrana corticale in vitro e in vivoe alla posizione della posizione nucleare dell'obiettivo lungo la asse anteriore-posteriore ex vivo. Questi metodi fungono da punto di partenza per gli studi funzionali sullo sviluppo e la fisiologia delle lenti, nonché sugli schermi genetici inversi per i fenotipi delle lenti nel pesce zebra.

Imaging morfologia delle lenti pesce zebra

Aquaporin 0 (AQP0) è la proteina di membrana della lente più abbondante ed è fondamentale per entrambi, lo sviluppo della lente e la chiarezza, a causa di molteplici funzioni essenziali nei mammiferi. I zebrafish hanno due Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e abbiamo sviluppato metodi per analizzare la perdita delle loro funzioni sia nelle lenti embrionali che in quelle adulte. I nostri studi rivelano cheaqp0a-/-mutanti sviluppano opacità polare anteriore a causa dell'instabilità della sutura anteriore, e aqp0a/b doppi mutanti sviluppano opacità nucleare1. AQP0 ha dimostrato di svolgere ruoli nel trasporto dell'acqua2, adesione3,4, citoscheletro ancoraggio5 e generazione del gradiente indice di rifrazione6, ma questi studi sono stati in gran parte eseguiti in in vitro. Il pesce zebra fornisce un'opportunità unica per studiare come la perdita di funzione o la funzione perturbata di Aqp0a o Aqp0b influenzerebbero la morfologia e la funzione in una lente vivente. Per valutare la morfologia delle cellule lente e l'integrità suturale durante lo sviluppo, abbiamo modificato i metodi immunoistochimici esistenti in vitro 7 per l'uso in lenti embrionali e adulte, e hanno generato transgenici per monitorare questo processo in vivo .

L'analisi immunoistochimica della struttura della membrana plasmatica e dell'integrità suturale è stata eseguita in embrioni fissi interi e lenti per adulti. Le lenti zebrafish sono estremamente piccole (il diametro della lente è ~ 100 μm in embrioni e fino a 1 mm negli adulti) rispetto ai loro omologhi di mammiferi e hanno punti di sutura8, che sono raramente catturati in criosezioni. Pertanto, le lenti intere sono essenziali per l'analisi dell'integrità suturale. Per l'analisi in vivo della formazione di sutura anteriore e per l'imaging di un'architettura delle cellule lente precisa, abbiamo generato delle transgeniche che esprimono Mapple etichettando specificatamente le membrane delle lenti.

I vantaggi dell'Imaging Live della membrana transgenica delle lenti includono: 1) evitando artefatti di fissazione, 2) studiando cambiamenti morfologici dinamici nei film time-lapse e 3) consentendo studi longitudinali in cui gli eventi precedenti possono essere correlati con i successivi Fenotipi. La pigmentazione dell'iride normalmente previene la chiara Imaging della periferia dell'obiettivo. L'aggiunta di 1-phenyl 2-Thiourea (PTU) prima della Primordia-5 (prim-5) fase9 previene la melanogenesi e la pigmentazione oculare fino a circa 4 giorni dopo la fertilizzazione (DPF). Tuttavia, dopo 4 DPF, la periferia dell'obiettivo è oscurata in vivo, in particolare nelle fasi più vecchie. Inoltre, la densità della lente stessa oscura l'imaging del suo palo posteriore. Pertanto, per studiare la morfologia della periferia della lente, o la sutura posteriore, dopo 4 DPF, le lenti devono essere asportate e fissate.

Le linee pesce zebra transgeniche sono state utilizzate per analizzare la struttura della membrana embrionale della lente in vivo10. L' Q01 transgenici esprime una proteina ciano fluorescente fusa ad una sequenza di targeting per membrana, Gap43, guidata dal promotore EF1α e un ESAMER dell'elemento DF4 PAX6 Enhancer onnipresente nelle cellule della fibra ottica11. Q01 ha un'espressione extra-lenticolare, comprese le cellule amacrine nella retina, che aggiunge il segnale di fondo se l'interesse primario è l'obiettivo. Abbiamo sviluppato una nuova linea transgenica che esprime un mApple legato a membrana specificamente nella lente, con l'obiettivo di evitare qualsiasi segnale extra-lenticolare.

Localizzazione del nucleo dell'obiettivo

Abbiamo scoperto che il nucleo della lente si muove da una posizione anteriore iniziale nel pesce zebra larvale in una posizione centrale nell'asse anteriore-posteriore nelle lenti adulte. Questo cambiamento nella posizione del nucleo dell'obiettivo ad alto indice di rifrazione è pensato per essere un requisito per lo sviluppo normale dell'ottica delle lenti pesce zebra1. I nostri metodi consentono la quantificazione della centralizzazione nucleare dell'obiettivo in relazione al raggio della lente. Utilizzando questo metodo, abbiamo mostrato che Aqp0a è necessario per la centralizzazione nucleare dell'obiettivo1, e questo metodo semplice può essere applicato ad altri studi dello sviluppo e della fisiologia della lente e delle sue proprietà ottiche nel modello pesce zebra.

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Protocol

I protocolli animali utilizzati in questo studio aderiscono alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della California, Irvine.

1. allevamento di zebrafish e eutanasia

  1. Sollevare e mantenere il pesce zebra (ceppo AB) in condizioni di laboratorio standard12. Sollevare embrioni nel mezzo embrionale (EM)12. Aggiungere 0,003% PTU a EM da 20-24 h post fertilization (prima della fase Prim-5) per prevenire la formazione di pigmenti in embrioni12 utilizzati per l'imaging a stadi embrionali9. Sollevare le larve da 6-30 giorni dopo la fertilizzazione (DPF) su una dieta di rotiferi vivi fino a 14 DPF, e l'Artemia vivo dopo 14 DPF12.
    Attenzione: PTU è molto tossico
  2. Anestetizzare il pesce usando la tricaina fino a non rispondere al tatto.
    1. Preparare il brodo di tricaina combinando 400 mg di acidethylester 3-amino benzoico, con 2,1 mL di tris di 1 M (pH 9), in 100 mL di ddH2O. regolare a pH 7,0 e conservare a-20 ° c.
      Attenzione: La tricaina è tossica.
    2. Diluire 4,2 mL di brodo di tricaina in 100 mL di acqua del serbatoio per anestetizzare le larve/gli adulti o in EM per anestetizzare gli embrioni (concentrazione finale di tricaina al 0,0165% p/v).

2. fissazione di embrioni e larve

Nota: I protocolli immunoistochimici sono stati adattati dai materiali precedentemente pubblicati7.

  1. Fissare gli embrioni dechorionati o le larve fino a 2 settimane dopo la fertilizzazione nel 4% (v/v) di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) durante la notte a 4 ° c su un rocker.
    Attenzione: Il PFA è combustibile ed è cancerogeno.
  2. Lavare gli embrioni tre volte per 10 minuti in PBS, e permeabilizzare in PBS con 10% Triton e 1% DMSO (PBS-T) durante la notte a 4 ° c.
    Attenzione: DMSO è tossico, è dannoso per ingestione o assorbimento cutaneo, trasporta materiali pericolosi attraverso la pelle, ed è combustibile. Triton è tossico, corrosivo ed è pericoloso per gli ambienti acquatici.

3. dissezione delle lenti larvale e zebrafish adulte

  1. Anestetizzare i pesci da 6 larve di DPF fino all'età adulta con la tricaina fino a non rispondere al tatto ma mostrando ancora un forte battito cardiaco. Misurare la lunghezza standard del pesce come da Schilling (2002) per la messa in scena13.
  2. Immediatamente accise gli occhi utilizzando le forbici di micro-dissezione e mettere in un piatto di dissezione in PBS (Figura 2 mostrato per gli occhi adulti).
    1. Creare un piatto personalizzato 35 mm riempito con silicone per dissezioni lente. Una volta che il silicone ha impostato, accisa un divot intorno 2-3 mm di diametro e 0,5 mm di profondità per immobilizzare gli occhi adulti/lenti durante la dissezione.
  3. Dissezione di lenti pesce zebra adulte
    1. Posizionare un occhio adulto nel piatto divot lato posteriore fino riempito con PBS. Immobilizzare l'occhio inserendo pinze a < angolo di 45 ° attraverso il disco ottico. Fare attenzione a non Nick o comprimere l'obiettivo. Effettuare due o tre incisioni radiali attraverso la retina e la sclera dal disco ottico alla zona ciliare con forbici di dissezione.
    2. Staccare la retina e sclera come petali di fiori e invertire l'occhio, lato cornea verso l'alto. Immobilizzare la lente indirettamente attraverso la manipolazione della sclera e della cornea con il lato piatto delle forbici, mentre tirando via la retina e i tessuti attaccati con pinze. Tagliare con cautela il tessuto in eccesso dall'obiettivo.
      Nota: È fondamentale sezionare con attenzione per ottenere lenti costantemente sane.
  4. Dissezione delle lenti a pesce zebra larvale
    1. Posizionare un occhio larvale lato posteriore verso l'alto sulla parte piatta del piatto di silicone riempito con PBS e utilizzare un ago di tungsteno affilato per fare tagli radiali attraverso la retina e sclera, mentre immobilizzare l'occhio con un altro ago di tungsteno o pinze.
      Nota: Fare attenzione a non danneggiare l'obiettivo.
      1. Affilare la punta di una lunghezza di 2 cm di 0,1 mm di filo di tungsteno elettrolticamente sospendendo la punta del filo in 10% (w/v) NaOH e applicando una bassa tensione corrente alternata14. Fissare l'ago in una pipetta Pasteur sciogliendo l'estremità in vetro utilizzando un bruciatore Bunsen.
        Nota: Possono essere utilizzati anche strumenti alternativi di dissezione.
        Attenzione: NaOH è corrosivo.
    2. Estrarre delicatamente la lente dall'occhio dissociato con un lato smussata dell'ago e tirare con cautela il tessuto attaccato.

4. fissazione delle lenti Dissected

  1. Fissare immediatamente lenti sezionato in 1,5% (v/v) PFA in PBS per 24 h a temperatura ambiente (RT). Lavare le lenti tre volte in PBS per 10 min ciascuno.
  2. Lenti permeabilize per analisi di montaggio integrale o crioprotezione per criosectioning (vedere paragrafo 8).
    1. Lenti permeabilize in PBS-T per una notte a 4 ° c.

5. immunoistochimica dell'obiettivo

  1. Etichettare le membrane delle lenti fisse embrionali/larvale o adulte per incubazione in Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) e nuclei cellulari con DAPI (1:1000 di 5 mg/ml di brodo) in PBS-T durante la notte a 4 ° c.
    Attenzione: DAPI è un irritante per la pelle e gli occhi.
  2. Lavare tre volte con PBS-T per 10 min ciascuno. Tessuto trasparente per incubazione in 30%, 50% e 70% glicerolo in PBS-T (v/v) per almeno 1 h a RT ciascuno, o durante la notte a 4 ° c.
  3. Montare il pesce in 70% glicerolo in PBS-T (v/v) sul fondo di vetro 35 mm piatti microtitolazione con gli occhi come piatto e dritto contro il coperchio scivolare il più possibile. Per i pesci più giovani, una leggera inclinazione anteriore-laterale può aiutare a orientare la sutura dell'obiettivo in parallelo al vetrino coprioggetti.

6. analisi delle suture lente anteriori zebrafish utilizzando una linea transgenica in vivo

  1. Generare linee TG (βB1cry: mAppleCAAX) utilizzando il kit Tol215. Il sistema di elementi traibili Tol215 consente l'integrazione stabile del costrutto in cui Mapple è guidata da 300 BP del promotore umano βb1-crystallin16 legato alla membrana dalla sequenza CAAX con conseguente espressione in particolare nelle membrane delle cellule delle fibre ottiche.
    Nota: Questo costrutto (ID: 122451) è disponibile per l'acquisto.
    1. La mattina dell'iniezione, preparare la miscela di iniezione e mantenere il ghiaccio. Per raggiungere un volume finale di 10 μL di contenente RNasi-e DNase-Free H2O, aggiungere: 1,5 μl di ogβb1grido: mAppleCAAX DNA costrutto a 50 ng/μl-[0.375-0,75 PG/iniezione finale], 1,5 μl di Tol2 Traacasi mRNA a 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 iniezione finale], e 1 μL di indicatore rosso fenolo all'1% p/v [1 X10-5% (p/v)/iniezione finale].
    2. Iniettare 50-100 pL di miscela di iniezione in embrioni di stadio a 1 cellula12.
  2. Misurare l'efficienza della transgenesi negli embrioni iniettati F0 misurando la frequenza degli embrioni con le lenti positive mApple a 3 DPF.
    Nota: Aspettatevi di avere > 80% di efficienza transgenesi utilizzando questo metodo. I mosaici F0 consentono un'analisi dettagliata delle morfologie delle membrane delle singole cellule. I vari livelli di mosaicismo consentono di immagini le morfologie di singoli o piccoli gruppi di cellule, mentre l'espressione più globale dell'obiettivo consente l'analisi di strutture multicellulari come le suture lente in vivo.
  3. Outcross F0 pesce mosaico per generare linee stabili, che etichettare tutte le membrane delle cellule di fibra. I fondatori di F0 con il transgene integrato nella linea germinale generano prole con integrazioni stabili che possono essere mantenute come linee transgeniche.

7. analisi delle suture lente anteriore zebrafish utilizzando una linea transgenica in vivo

  1. Anestetizzare 3 DPF o mosaico per adulti o pesci transgenici stabili e montare in 1% di agarosio a bassa fusione (LMA) con tricaina con l'occhio piatto contro il coperchio scivolare di piatti microtitolazione fondo di vetro.
    1. Sciogliere 1 g di LMA in 100 mL di EM (senza blu di metilene) per fare l'1% di LMA. Conservare a lungo termine come scorte da 15 mL a 4 ° c. Microonde per sciogliere il brodo e conservare a 42 ° c fino a quando viene utilizzato ogni tubo.
  2. Coprire il pesce fino a 6 DPF con EM con tricaina, o con acqua del serbatoio con tricaina per gli adulti quando LMA è impostato.
    1. Mescolare 5 mL di EM senza blu di metilene o acqua del serbatoio con 250 μL di stock di tricaina e 7 μL di PTU se Imaging PTU trattati con pesce.

8. Criosectioning delle lenti e immunoistochimica

  1. Crioproteggere gli embrioni fissi o le lenti adulte inserendo nel 10% di saccarosio in PBS (w/v), il 20% di saccarosio per 1 h a RT ciascuno (o la notte a 4 ° c) e la notte in saccarosio al 30% a 4 ° c.
  2. Incorporare il tessuto in OCT negli stampi di base, quindi congelare i mandrini con OCT. Criosezione a 12-14 μm e raccogliere su vetrini per microscopio SuperFrost/Plus. Sezioni calde su slitta per 10 minuti su uno scaldabiberon preriscaldato a ~ 35 ° c.
  3. Lavare le sezioni tre volte con PBS per 10 min ciascuno. Etichettare le sezioni con Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) con DAPI (1:1000) o WGA-Alexa Flour 594 (1:200), seguita da tre Lavini PBS. Montare con mezzo di montaggio anti-dissolvenza, e sigillare coprioggetto con smalto per unghie.

9. immagini di imaging

  1. Acquisisci immagini con un microscopio confocale. Acquisire pile z o sezioni ottiche utilizzando un obiettivo di immersione in acqua 60x N/A 1,2, o simile, in regioni specifiche dal palo dell'obiettivo anteriore a quello posteriore. Utilizzare le seguenti impostazioni di acquisizione: 1,2 disco arioso utilizzando il laser 561 Nm, il filtro rosso Texas per Phalloidin-Alexa farina 546 o mApple, o il laser 405 con il filtro UV per DAPI.
  2. Corretta potenza laser a intensità z per contrastare la perdita di segnale con la profondità nell'obiettivo. Questo permette un segnale forte al polo posteriore di embrioni fissi e vivi 3 DPF, e forte segnale in fette ottiche equatoriali in lenti per pesci adulti.
  3. Compila e visualizza le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

10. misurazione della localizzazione del nucleo dell'obiettivo nell'asse anteriore-posteriore

  1. Orientare le lenti appena asportate assialmente in PBS in un piatto da 35 mm con fondo in vetro coprenti, con pali e suture orientati parallelamente al piano di messa a fuoco. Cercare una differenza nell'indice di rifrazione, che di solito si verifica all'interfaccia della corteccia dell'obiettivo e del nucleo dell'obiettivo per identificare il nucleo della lente.
    Nota: Le lenti sane per adulti di tipo selvaggio sono estremamente trasparenti, rendendo difficile vedere le suture e il nucleo dell'obiettivo o determinare l'orientamento dell'obiettivo. In questo caso, un lieve Nick con pinze alla capsula dell'obiettivo provoca danni minori, il che rende evidenti le suture e il nucleo dell'obiettivo in circa 10 minuti, contribuendo a orientare l'obiettivo per questa misura. Tuttavia, le lenti diventano inutilizzabili per le applicazioni a valle in quanto sono ora danneggiate.
  2. Scattare immagini di lenti con il nucleo della lente a fuoco sotto illuminazione di campo luminoso con o senza ottica DIC utilizzando un microscopio di dissezione con una fotocamera allegata. Immagine di un micrometro sotto lo stesso ingrandimento per la calibrazione.
    1. Fare clic sul pulsante Live View, regolare le impostazioni di esposizione per visualizzare il nucleo della lente e la periferia dell'obiettivo e scattare un'immagine facendo clic sul pulsante scatto. Salva come file TIF.
    2. Utilizzare il software di elaborazione immagini per calibrare le immagini delle lenti acquisite. Selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea di lunghezza nota sull'immagine del micrometro, fare clic su analizza | impostare la scala. Immettere la distanza nota, le unità e selezionare la calibrazione "globale" e fare clic su OK.
  3. Misurare la distanza del centro del nucleo dell'obiettivo con il Polo anteriore (a-r).
    1. Utilizzare lo strumento di linea diritta nel software di elaborazione delle immagini per tracciare una linea attraverso il centro immaturato del nucleo dell'obiettivo in un orientamento assiale. Prendi il centro di questa linea come centro del nucleo dell'obiettivo.
    2. Disegna un'altra linea da questo punto al Polo anteriore dell'obiettivo e seleziona ' misura ' nel menu ' analizza ' per misurare la distanza (a-r), dove a è il raggio dell'obiettivo e r è la distanza dal centro dell'obiettivo al centro del nucleo.
    3. Tracciare un'altra linea dalla parte anteriore ai pali posteriori e misurare questa distanza come il diametro della lente (2a). Copiare queste lunghezze dalla finestra "risultati" e trasferirle in un foglio di calcolo o in un programma statistico.
      Nota: È più facile misurare con precisione dal centro del nucleo al palo anteriore, che misurare dal centro del nucleo della lente al centro dell'obiettivo. Questa misura viene convertita dalla formula in Step 10.3.5 per riportare la distanza del centro del nucleo dell'obiettivo al centro dell'obiettivo. Utilizzare sempre il nucleo adulto per le misurazioni, anche se il nucleo embrionale è evidente.
    4. Dividere il diametro per 2, per calcolare il raggio dell'obiettivo, a.
    5. Calcola r/a, come Equation 1 , che è la localizzazione normalizzata del nucleo dell'obiettivo rispetto al raggio dell'obiettivo.
      Nota: per un nucleo posizionato più vicino al palo anteriore, r/a sarà > 0.0, mentre un nucleo localizzato centralmente avrà una r/a di 0,0.
  4. Grafico del registro della misura del nucleo assiale normalizzato come funzione della lunghezza standard per determinare i cambiamenti nella localizzazione del nucleo dell'obiettivo durante lo sviluppo del pesce zebra.

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Representative Results

L'anatomia degli occhi di pesce zebra adulto assomiglia molto a quella dei mammiferi (Figura 1a). Nonostante alcune differenze tra gli occhi di pesce zebra e mammiferi, come avere una zona ciliare invece di un corpo ciliare17, differenze nelle proprietà ottiche18, e differenze nella morfogenesi durante lo sviluppo embrionale19, il pesce zebra Eye è un ottimo modello per studiare lo sviluppo degli occhi e comprendere la malattia oftalmica20,21,22. Un semplice epitelio linee il Polo anteriore della lente, che all'equatore subisce un processo a vita di proliferazione, allungamento, e la differenziazione in cellule di fibra, costituendo la maggior parte della lente. Le fibre mature (Figura 1B, azzurro) si differenziano prima nell'embrione, sono prive di organelli e non vengono mai sostituite. Differenziando le punte delle cellule di fibra si incontrano ai pali per formare le suture anteriori e posteriori. Queste cellule sono poi internalizzate da cellule di fibra appena differenziate. Come tutte le lenti vertebrati, la lente pesce zebra ha così un gradiente di sviluppo con le cellule più vecchie situate al centro del nucleo della lente. Il placode della lente pesce zebra si forma a 16 h dopo la fertilizzazione (HPF), che si allunga per formare le fibre ottiche primarie a 18 HPF, e le fibre secondarie formano la zona di transizione a 28-36 HPF. La sutura posteriore è visibile a 48 HPF, che è prima che la sutura anteriore diventi visibile10.

Lo sviluppo preciso e la manutenzione dell'architettura regolare delle lenti è essenziale per la sua ottica. Qui descriviamo i metodi per l'analisi della morfologia delle cellule lente pesce zebra in vitro e in vivo, compresi sia i vantaggi e le limitazioni, che abbiamo sviluppato per analizzare i fenotipi risultanti da mutanti di funzione di due pesce zebra Aqp0s, Aqp0a e Aqp0b1. Per la valutazione della morfologia delle lenti adulte in vitro, le lenti sono state sezionate (Figura 2) e immediatamente fisse. La valutazione embrionale è stata effettuata in embrioni fissi interi (Figura 3) e rispetto agli embrioni transgenici vivi (Figura 4). Le lenti per adulti dissezionati e fisse (Figura 5) sono state confrontate con le lenti adulte transgeniche immagine dal vivo (Figura 6). Le differenze nel rilevamento e nella visualizzazione di parti specifiche dell'obiettivo utilizzando questi metodi sono riepilogate (tabella 1).

Phalloidin è stato trovato per essere superiore per l'etichettatura delle membrane delle cellule di fibra ottica in pesce zebra rispetto al germe di grano agglutinina (WGA). La WGA è una lectina che si lega alla N-acetil-D-glucosamina e all'acido sialico, e la WGA coniugata ai fluorofori è tipicamente utilizzata per etichettare le membrane cellulari in fibra ottica nell'uomo23, bovino24, ovini25, topo26, ratto27 e pesce zebra28,29. Qui usiamo Phalloidin su lenti pesce zebra intere (Figura 3, Figura 5).

Le larve di pesce zebra embrionale e larvale fino a 7 DPF sono piccole e permeabili abbastanza da consentire la penetrazione di Phalloidin nella corteccia esterna dell'obiettivo. Con 3 DPF il nucleo della lente è compatto e privo di organelli, le suture anteriori si formano al palo anteriore (Figura 3A,B) e la Phalloidin è esclusa dal nucleo della lente in un piano ottico equatoriale (Figura 3C,D). La phalloidina è probabilmente esclusa dal nucleo a causa dell'elevata compattazione delle membrane delle fibre cellulari, coerentemente con gli studi precedenti28. Tuttavia, la corteccia esterna viene visualizzata in grande dettaglio con questa colorazione (Figura 3C-F). Nella sezione trasversale, le cellule delle fibre assumono una forma esagonale appiattita, con lati più larghi e lati stretti più corti. Phalloidin etichetta fortemente sia le membrane delle cellule delle fibre strette e larghe (Figura 3E-F) evidenziando la compattazione delle cellule di fibra corticale tra i lati larghi. Questa organizzazione è in gran parte influenzata in aqp0a/b doppi mutanti (Figura 3B, D, F e H).

L'espressione mosaica del transgene (mApple legata alla membrana cellulare dal motivo CAAX guidato da una regione promoter 300 BP del promotore umano βB1 crystallin) esprime fortemente nelle lenti a partire da 2 DPF. Il transgene è integrato in modo casuale nel genoma con conseguente espressione eterogeneo di mApple. Mostriamo esempi di un obiettivo 3 DPF con forte espressione nella corteccia (Figura 4) ed espressione in parti del nucleo (Figura 4D). Il marcatore della membrana non è limitato dalla permeabilità come la phalloidina, quindi etichetta il nucleo della lente. I mosaici (Figura 4) generati da iniezioni di DNA che si esprimono solo in un piccolo sottoinsieme di cellule sono utili per l'analisi delle singole morfologie cellulari rispetto alle linee stabili, che etichettano ogni cellula che esprime il cristallin βB1 (Figura 6). In TG (βB1cry: mAppleCAAX) mosaici la morfologia della sutura anteriore può essere visualizzata in z-proiezioni prese al Polo anteriore (Figura 4a,B). Si noti che la morfologia delle membrane cellulari differisce dalle lenti fisse etichettate con Phalloidin (Figura 3A,B), e la presenza di sottodomini in ampie membrane cellulari (Figura 4a' frecce bianche) precedentemente identificati in lenti da altri specie30 è visibile. Tuttavia, l'etichettatura più debole delle membrane delle cellule a fibre sottili provoca l'incapacità di vedere la convergenza sorprendente delle cellule nella sutura anteriore (Figura 4a, frecciab ) osservata in lenti fisse etichettate con Phalloidin (Figura 3A,b frecce).

È interessante notare che le fette ottiche scattate all'equatore della lente rivelano anche un diverso modello di etichettatura, con evidenti interruzioni del volume cellulare nei mutanti doppi aqp0a/b rispetto al WT (Figura 4c-F). Questo è probabile perché le etichette transgenici ampie membrane delle cellule di fibra più efficacemente di Phalloidin. Siamo stati in grado di ottenere z-proiezioni attraverso il palo posteriore per analizzare l'integrità della sutura posteriore con l'uso di Z-correzione, che ha aumentato la potenza del laser con profondità nel tessuto. Analisi chiara della sutura posteriore (Figura 4G,H) nel pesce intatto era limitato ai primi 5 DPF, e dopo che la lente era troppo densa, con conseguente perdita di segnale nella parte posteriore della lente.

Le lenti fisse per adulti dissezionati etichettate con Phalloidin hanno rivelato dettagli sorprendenti nell'architettura altamente ordinata di righe di celle in fibra convergenti per formare suture anteriori (Figura 5a, freccia) e morfologia della corteccia (Figura 5C-H), a causa di un'etichettatura molto forte delle membrane delle cellule di fibra stretta da Phalloidin. Le proiezioni Z massime del palo anteriore hanno rivelato la perdita di una sutura anteriore stretta in aqp0a/b doppie lenti mutanti (Figura 5b, freccia), rispetto al WT (Figura 5a, freccia), che si manifesta come una massa di membrane e nuclei cellulari in ottica fettine 30 μm dal palo anteriore (Figura 5d). Nelle fette ottiche più profonde, l'etichettatura di Phalloidin è stata esclusa dalla corteccia e dal nucleo della lente più profonda (Figura 5e,F). L'organizzazione complessiva delle righe di cellule di fibra nella corteccia esterna è stata in qualche modo influenzata dalla mancanza di una sutura anteriore stretta nelle lenti doppie mutanti aqp0a/b , rendendo impossibile posizionare le lenti esattamente perpendicolari al piano di imaging (Figura 5F ) rispetto agli obiettivi WT (Figura 5e). Tuttavia, immagini ad alta potenza di righe di cellule di fibra prese nel piano equatoriale ha rivelato che le cellule nella corteccia esterna ancora formato righe ordinate, visibile a causa di forte etichettatura delle cellule di fibra stretta (Figura 5g,H). Era impossibile discernere le membrane larghe delle singole cellule a fibra a causa di una combinazione della loro compattazione stretta e del segnale debole. Poiché queste lenti sono state sezionate, potevano essere montate con il lato posteriore rivolto verso l'obiettivo, permettendo proiezioni z delle suture posteriori, che non mostravano differenze tra i genotipi come punte delle cellule di fibra posteriori formate suture strette (Figura frecce 5I,J ).

Z-proiezioni di lenti di Live anestetizzato adulto stabile TG (βB1cry: mAppleCAAX) pesci rivelano la morfologia della membrana corticale nella corteccia anteriore (Figura 6a,a'), così come l'estensione della convergenza cellulare al Polo anteriore ( Figura 6B). È stato più difficile montare il pesce con le suture lente perpendicolari al piano di imaging, rispetto alle lenti sezionato fisse. Linee stabili che trasportano il transgene Express mApple nel nucleo della lente (Figura 6C,D). Le fette ottiche all'equatore hanno rivelato un segnale forte che indica un'estesa compattazione del nucleo quando viene immaturato con la stessa potenza laser della corteccia anteriore (Figura 6C). È interessante notare che nessuna risoluzione cellulare della corteccia esterna era evidente negli adulti, a differenza degli embrioni. Ciò è probabilmente dovuto al diaframma che blocca un segnale chiaro dalla periferia dell'obiettivo. Può essere possibile ottenere un segnale corticale lente più forte mediante dilatazione della pupilla prima dell'imaging. Con la ridotta potenza del laser, è stato possibile distinguere alcuni strati cellulari nel nucleo della lente (Figura 6D). La lente pesce zebra adulta è molto densa, ed era impossibile ottenere il segnale dal palo posteriore in vivo.

Abbiamo dimostrato che il nucleo della lente pesce zebra si muove nell'asse ottico da una posizione anteriore iniziale in lenti larvale a una posizione centrale negli adulti1. Questi movimenti sono evidenziati in sezioni di lenti assiali, come Phalloidin e WGA sono esclusi dal nucleo della lente (Figura 7A-C). Abbiamo dimostrato che Aqp0a è necessario per questo processo di centralizzazione1, ma questo meccanismo rischia di essere influenzato da altre proteine. La localizzazione del centro del nucleo dell'obiettivo in relazione alla sua posizione lungo l'asse anteriore-posteriore è stata misurata posizionando le lenti intere dissezionate nell'orientamento assiale e l'imaging sotto l'illuminazione DIC, evidenziando in tal modo lievi differenze nel Proprietà di rifrazione (Figura 7E). Le suture di solito hanno un indice di rifrazione diverso rispetto alla corteccia circostante, quindi può essere utilizzato come guida per l'orientamento. Le giovani lenti larvale hanno suture più evidenti (suture posteriori in lenti molto giovani), e i nuclei delle lenti, che hanno un diverso indice di rifrazione, sono ovviamente asimmetrici, rendendo più facile orientare le lenti in queste fasi. La distanza relativa del centro del nucleo dell'obiettivo dal centro dell'obiettivo (r) viene normalizzata al raggio dell'obiettivo (a). Questo viene poi rappresentato graficamente in relazione allo sviluppo di pesce zebra, per il quale viene utilizzata la misurazione della lunghezza standard13. In WT, il nucleo dell'obiettivo inizia più vicino al palo Equation 2 dell'obiettivo anteriore e quindi si centralizza Equation 3 in età adulta (Figura 7F).

Figure 1
Figura 1 : Zebrafish occhio adulto e diagramma delle lenti. Anteriore è preso come dove la luce entra nell'occhio, che nel pesce zebra è in realtà laterale. A) la lente pesce zebra insieme alla luce di messa a fuoco della cornea sulla retina. Negli animali acquatici, la cornea svolge un ruolo minore nella rifrazione della luce, ma invece, l'obiettivo ha un indice di rifrazione più alto18. La lente separa la camera anteriore riempita con umorismo acquoso e camera posteriore riempita con umorismo vitreo. (B) la lente pesce zebra è più sferica rispetto alle lenti dei mammiferi. Le punte delle cellule in fibra si incontrano a punti o suture ombelicali8 nei pali anteriori e posteriori. Differenziando le cellule delle fibre nella corteccia dell'obiettivo hanno nuclei e organelli, mentre le cellule di fibre mature nel nucleo della lente (azzurro) sono prive di organelli e nuclei. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.    

Figure 2
Figura 2 : Dissezione della lente zebrafish. A) gli occhi sono sezionati da pesci anestetizzati e posizionati sul lato posteriore (B). C) gli occhi sono immobilizzati da pinze attraverso il disco ottico (od) e due o tre incisioni radiali sono fatti in retina e sclera dal disco ottico alle zonules. (D) piegare le alette fuori per rivelare l'obiettivo. (E) ruotare l'occhio per affrontare la cornea verso l'alto, immobilizzare la lente indirettamente attraverso la cornea e tirare via la sclera-retina. (F) tagliare via la retina rimanente e la zona ciliare/zonules dall'obiettivo. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3 : Morfologia delle lenti embrionali in vitro. Gli embrioni fissi e permeabilizzati etichettati con Phalloidin (rosso) e nuclei cellulari con DAPI (blu) rivelano la morfologia della membrana e l'integrità della sutura ai pali. Le proiezioni Z rivelano che le lenti WT e aqp0/b Double Mutant presentano una disposizione delle cellule in fibra molto regolare che si incontrano in una sutura anteriore molto stretta (frecce) a 3 DPF (a, b). Le fette ottiche scattate all'equatore rivelano file stretti di cellule di fibre esagonali confezionate nella corteccia esterna in entrambi i genotipi (C-F). Entrambi, i lati stretti e larghi delle membrane delle fibre cellulari sono etichettati come mostrato in (E). Le suture posteriori (frecce) sono formate e strette in entrambi i genotipi (G, H). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 4
Figura 4 : Morfologia delle lenti embrionali in vivo. L'imaging live delle lenti anestetizzate 3 DPF a mosaico F0 iniettate TG (βB1cry: mAppleCAAX) rivela le suture anteriori (frecce) nelle proiezioni z (a, B). (a') I sottodomini a membrana sono evidenti come punte (frecce bianche) in ampie membrane cellulari a fibra. Sono evidenti anche le membrane delle fibre sottili (frecce nere). Le lenti WT rivelano le cellule della fibra corticale lente ben imballate (C, E), rispetto alla corteccia interrotta di aqp0a/b doppi mutanti- con evidenti cellule gonfie (D, F). La focalizzazione sulle suture posteriori (g, h) (frecce) non rivela alcuna differenza tra i genotipi (g, h). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 5
Figura 5 : Morfologia delle lenti adulte in vitro. Le lenti asportate, fisse e permeabilizzate di pesce oltre 23 mm di lunghezza standard sono state etichettata con Phalloidin (rosso) e DAPI (blu). 150 μm di proiezione Z sul palo anteriore rivelano una rigida disposizione delle punte delle cellule di fibra convergenti in una sutura stretta (freccia) in WT (a), ma non aqp0a/b Double mutanti (freccia), che invece hanno una massa di membrane e nuclei (b). Una fetta ottica presa 42 μm dal palo anteriore rivela celle ordinate convergenti nel centro in WT (C), ma una massa di nuclei dove la sutura deve essere in lenti mutanti (D). Le fette ottiche attraverso l'Equatore dell'obiettivo, a 130 μm dal palo anteriore, rivelano file strettamente imballati di cellule di fibre in WT (e, G) e mutanti (F, H). Le suture posteriori (frecce) sono formate e strette in entrambi I genotipi (I, J). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 6
Figura 6 Morfologia delle lenti adulte in vivo. Imaging dal vivo di lenti oftalmiche per adulti stabili TG (βB1cry: mAppleCAAX) . Le proiezioni Z nella corteccia anteriore rivelano la morfologia corticale (a, a') e la sutura anteriore (freccia), con celle convergenti in un punto in una singola fetta ottica (B, freccia). La corteccia può essere visualizzata a maggiore potenza laser in una fetta ottica attraverso l'equatore (C), rispetto al segnale più forte forma il nucleo della lente (D). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 7
Figura 7: Centralizzazione del nucleo della lente zebrafish. Gli embrioni fissi e crioprotetti (a) e le lenti (b, C) sono stati cRIO-sezionati assialmente ed etichettati con phalloidin-546 (rosso in a , b), DAPI (blu in a , b) o WGA-594 (rosso in C). Il nucleo della lente è privo di nuclei cellulari, ed è posizionato più vicino alla lente anteriore (a) a 3 DPF (a), e in lenti di 1 mese (B), rispetto ad essere posizionati centralmente in lenti adulte (C). Le lenti dissezionate da un pesce zebra di 1 mese di 4,1 mm di lunghezza standard erano orientate equatorialmente (D), o assialmente (E). La localizzazione relativa del nucleo dell'obiettivo nell'asse è stata calcolata utilizzando la seguente strategia: (E) la distanza del centro (*) del nucleo dell'obiettivo (linea bianca punteggiata) è stata misurata al palo anteriore, in quanto questo più pratico che misurare il distanza (r) al centro dell'obiettivo (più). Questo è stato normalizzato al raggio dell'obiettivo (a), che è stato inizializzato come il diametro dell'obiettivo assiale (ant.-pos.). Il registro della localizzazione del nucleo assiale normalizzato è stato rappresentato graficamente in funzione dello sviluppo del pesce zebra, misurato dalla lunghezza standard (F). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

aspetto Embrione IHC TG embrionale Obiettivo intero IHC per adulti TG Adult
vivere N Y N Y
Sutura anteriore Y piuttosto Y piuttosto
Sutura posteriore Y Y Y N
Dettaglio cellulare corticale piuttosto Y Y Anteriore un po'
Dettaglio nucleo lente N Y (stabile) N Y (stabile)
Etichetta secondaria Anticorpi anti-Y Vivere solo con TG Anticorpi anti-Y Vivere solo con TG
Etichetta in fibra larga/stretta entrambi largo Per lo più stretti largo

Tabella 1: Riassunto del confronto dei metodi in vivo vs in vitro per l'analisi della morfologia delle lenti nel pesce zebra. Y = Sì, N = No

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Discussion

L'analisi della morfologia delle lenti pesce zebra è il primo passo nella comprensione dei fenotipi nei mutanti, o degli effetti degli interventi farmacologici finalizzati allo studio della biologia della lente oculare. Delineamo metodi per analizzare le suture lente, la morfologia delle cellule della fibra corticale e gli aspetti del nucleo della lente. Questi approcci sono una combinazione di in vitro e in vivo (rispetto alla tabella 1). I metodi in vitro consentono un maggiore dettaglio della morfologia delle cellule corticali esterne, nonché l'accesso alla sutura posteriore nelle lenti adulte.

L'analisi in vivo è possibile con l'uso di marcatori transgenici. Il transgene che presentiamo qui è specifico della membrana dell'obiettivo, rispetto alla linea Q01 pesce zebra esistente, che, mentre etichettando le membrane delle lenti, etichettano anche altri tipi di cellule nell'occhio, comprese le cellule amacrine, complicando l'interpretazione11 . Il segnale in vivo è limitato dall'epitelio pigmentato dell'occhio, che si forma durante il secondo giorno di embriogenesi, quindi gli embrioni devono essere trattati con PTU per l'analisi in questa e nelle fasi successive. Negli adulti, l'iride oscura l'analisi chiara della corteccia dell'obiettivo, ma consente l'analisi in vivo della corteccia dell'obiettivo anteriore. L'imaging live delle lenti a pesci consente studi longitudinali della morfologia delle lenti nello stesso animale. Questo può essere uno strumento estremamente utile per studiare gli effetti sui processi dinamici, come la rottura del volume cellulare in risposta a perturbazioni osmotiche o farmacologici. Una scoperta inaspettata è che possiamo chiaramente visualizzare i sottodomini della membrana in ampie membrane cellulari in fibra di carbonio, ma non in lenti fisse. Ciò evidenzia la differenza nell'etichettatura da parte del transgene e della phalloidina, nonché il fatto che questi sottodomini possono essere influenzati dal processo di fissazione.

L'analisi dei meccanismi molecolari della centralizzazione del nucleo della lente utilizzando i metodi che descriviamo può rivelare meccanismi essenziali per lo sviluppo delle proprietà ottiche delle lenti. Sebbene, fino ad oggi, l'asimmetria del nucleo dell'obiettivo assiale sia stata riportata solo nel pesce zebra, studiando questo processo, è probabile che si ottenano approfondimenti sui meccanismi necessari per lo sviluppo dell'ottica delle lenti in altre specie. In futuro, gli animali transgenici possono essere utilizzati in combinazione con altre applicazioni-come gli studi di iperespressione, con l'uso di un marcatore di transgenesi verde. Questi potrebbero essere usati per studiare gli effetti della sovraespressione di una proteina specifica nell'obiettivo o per il salvataggio dei fenotipi nei mutanti esistenti.

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Disclosures

Non abbiamo divulgazioni.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere la nostra fonte di finanziamento: NIH R01 EY05661 a J. E. H, Ines Gehring per aver assistito alla generazione del aqp0a/b doppio mutanti e allevamento di pesce zebra, Dr Daniel dranow per le discussioni che portano alla generazione dei transgenici, il dottor Bruce I laboratori di Blumberg e Dr Ken Cho per l'uso dei loro microscopi dissezione, e il dottor Megan Smith per l'aiuto con l'analisi statistica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

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Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

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