Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.
Abstract
يوصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR للنمط الجيني للجنين مرحلة gastrula من الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis دون التضحية بحياة الحيوان. بعد الإخصاب في المختبر وإزالة هلام، يسمح zygotes لتطوير لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula. ثم توضع أجنة غازترولا على سرير جل أغاروز في طبق بيتري يحتوي على مياه البحر. تحت المجهر تشريح، يتم استخدام إبرة التنغستن لفصل جراحيا جزء من الأنسجة الأبال من كل جنين. ثم يسمح للأجنة بعد الجراحة بالشفاء ومواصلة النمو. يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من جزء الأنسجة المعزولة واستخدامه كقالب لPCR خاص بالموقع. ويمكن تحديد النمط الجيني على أساس حجم منتجات PCR أو وجود/عدم وجود منتجات PCR الخاصة بالأليل. ثم يتم فرز الأجنة بعد الجراحة وفقا للنمط الجيني. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة وتمكن من تحليل الأنماط الظاهرية أثناء التنمية.
Introduction
يمثل الكنيداريون مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تشمل قنديل البحر والشعاب المرجانية وشاطئ النعمان البحري. وهي ثنائية الخلايا، تتكون من ectoderm وendoderm التي يتم فصلها بواسطة مصفوفة خارج الخلية (mesoglea). Cnidaria هي مجموعة شقيقة لspeciose Bilateria، والتي نماذج الحيوانات التقليدية مثل دروسوفيلا وموس تنتمي1. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن الاختلاف Cnidaria-Bilateria قد حدث في فترة ما قبل الكمبري2. وعلى هذا النحو، فإن الدراسات المقارنة للسكانيين والبلاتيريين ضرورية للحصول على رؤى في بيولوجيا أسلافهم المشتركين الأحدث. في الآونة الأخيرة، كشفت علم الجينوم المقارن أن cnidarians وbilaterians حصة العديد من الجينات مجموعة أدوات التنمية مثل الشق وbHLH، مما يعني أن أسلافهم المشتركة لديها بالفعل هذه الجينات3. ومع ذلك، فإن دور هذه الجينات مجموعة أدوات التنمية في السلف المشترك الأخير من Cnidaria وBilateria هو أقل فهما بالمقارنة جيدا. ولمعالجة هذه المشكلة، من الأهمية بمكان دراسة كيفية عمل هذه الجينات المحفوظة بعمق في الكنيداريين.
واحدة من النماذج الوراثية cnidarian الناشئة هو الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis. وقد تم تسلسل الجينوم3، ومجموعة متنوعة من الأدوات الوراثية ، بما في ذلك المورفولينول بوساطة الجينات بالضربة القاضية ، وtransgenesuclease بوساطة transgenes ، وكريسبر-Cas9 بوساطة الجينات knockins وخروج المغلوب ، متاحة الآن للاستخدام في هذا الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير نيماتوستيلا مفهوم بشكل جيد نسبيا. أثناء تكوين الجنين، يحدث التطفل عن طريق المهبل4، ويتطور الجنين إلى يرقة بلنبولا السباحة الحرة. وتتحول البلنة في وقت لاحق إلى ورم مسيل مع الفم والمخالب المحيطة. ثم ينمو ورم ويصل إلى النضج الجنسي.
كريسبر-Cas9 بوساطة الطفرات المستهدفة يستخدم الآن بشكل روتيني لدراسة وظيفة الجينات في نيماتوستيلا vectensis5,6,7,8,9. لتوليد متحولين بالضربة القاضية في Nematostella، يتم حقن كوكتيل يحتوي على locus محددة واحدة دليل RNAs والبروتين Cas9 endonuclease لأول مرة في البيض غير المخصبة أو المخصبة لإنتاج الحيوانات مؤسس F0 التي تظهر عادة الفسيفساء. يتم رفع الحيوانات F0 في وقت لاحق إلى النضج الجنسي وعبرت مع بعضها البعض لإنتاج السكان F1، مجموعة فرعية منها قد تكون متحولة بالضربة القاضية6. بدلا من ذلك، يمكن عبور الحيوانات F0 ناضجة جنسيا مع الحيوانات البرية من نوع لتوليد الحيوانات Heterozygous F1، وF1 heterozygotes التي تحمل أليل بالضربة القاضية في موضع الاهتمام يمكن بعد ذلك أن عبرت مع بعضها البعض لإنتاج ذرية F2، ربع منها من المتوقع أن تكون متحولة بالضربة القاضية5. ويتطلب كلا النهجين طريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من السكان غير المتجانسين وراثيا. يمكن استخدام مخالب البولي لاستخراج الحمض النووي الجينيللكتابة الجينية 6،7. ومع ذلك، في الحالات التي يتم فيها التحقيق في الوظيفة التنموية لجين الاهتمام ولا تصل الأجنة المتحولة إلى مرحلة البول (أي بسبب فتك اليرقات المرتبطة بالطفرة)، يجب تحديد المتحولين بالضربة القاضية في وقت مبكر من الأنطوجيني. يوصف هنا هو بروتوكول يستند إلى PCR للالحيوانات الفردية النمط الجيني في مرحلة gastrula دون التضحية الحيوان، والتي تمكن من تحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحريض التفريخ، والإخصاب في المختبر، وإزالة هلام
- الحفاظ على vectensis Nematostella في مياه البحر مع ملوحة من 12 أجزاء في الألف (ppt) في الظلام في 16 درجة مئوية، وتغذية Artemia يوميا.
- في اليوم السابق للتفريخ التعريفي، ضع الحيوانات في حاضنة تعمل بدرجة الحرارة والضوء. برنامج الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات إلى 8 ح من الضوء في 25 درجة مئوية. اختياري: إطعام قطعة صغيرة (<1 مم3)من المحار للالحيوانات الفردية قبل وضعها في الحاضنة لتعزيز التفريخ.
- ترك الحيوانات في الحاضنة لمدة 1 ساعة في 16 درجة مئوية.
- إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على سطح مقاعد البدلاء مع الضوء في درجة حرارة الغرفة (RT) للسماح تفرخ. عادة ما يحدث التفريخ في غضون 1.5-2 ساعة التالية.
- إذا كان الذكور والإناث في حاويات منفصلة، ضع حزم البيض من حاوية الإناث في حاوية الذكور التي تحتوي على الحيوانات المنوية باستخدام ماصة نقل الذي يتم قطع طرفه لتوسيع الفتحة بحيث لا تتلف البيض من الإجهاد الميكانيكي أثناء نقل. السماح بتخصيب البيض بتركهم في حاوية الذكور لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- دي جيلي حزم البيض في مياه البحر التي تحتوي على 3٪ سيستين (درجة الحموضة 7.4) على طبق بيتري أو في أنبوب 15 مل. يهيّج بلطف على شاكر لمدّة 12 دقيقة.
- استخدام ماصة بلاستيكية لتفريق كتل والاستمرار في التحريض لمدة 2-3 دقيقة أخرى حتى تماما دي jellied.
- إزالة السيستين عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع مياه البحر العذبة لمدة 5X على الأقل.
- احتفظ بالبيض المخصبة على طبق بيتري زجاجي عند درجة حرارة 16 درجة مئوية أو RT.
2. الاستئصال الجراحي للأنسجة الأبالمنة من جنين غازيولا
- إعداد مخزن استخراج الحمض النووي يتكون من 10 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8)، 50 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.3٪ توين20، 0.3٪ NP40، و 1 ملغ / مل بروتيناز ك. استخدام 20 مل من المخزن المؤقت استخراج لكل جنين. يُمزج جيداً عن طريق التَحَمِل ويُخلط العازل في أنابيب PCR.
- إذابة 1٪ أغاروز في مياه البحر وصب في طبق بيتري لتغطية الجزء السفلي. تبرد على سطح المقعد لجعل سرير هلام. صب مياه البحر الطازجة لتغطية السرير هلام في طبق بيتري.
- نقل 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) الأجنة (مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula) في طبق بيتري الذي يحتوي على سرير هلام أغاروز.
- إدراج إبرة التنغستن في حامل إبرة وتعقيم عن طريق غمس طرف إبرة في الكحول (70٪ أو أعلى) ووضعها في اللهب لحرق الكحول.
- تحت المجهر تشريح (في 20x إلى 40x التكبير)، واستخدام إبرة التنغستن لجعل الاكتئاب على سرير أجاروز عن طريق إزالة قطعة من الأجاروز السطحية حول حجم الجنين ليتم التلاعب بها، ووضع الجنين على الاكتئاب مع الجانبية الجانب التي تواجه أسفل من أجل تقييد حركة الجنين للجراحة الدقيقة.
- استخدام إبرة التنغستن لاستئصال جراحيا قطعة من الأنسجة الأبوالية تقع قبالة فتح blastoporal عن طريق الفم. عادة ما يكون الأوفيرال من ثلث إلى ربع الأنسجة الجنينية على طول المحور الفموي - الأبوالي كافياً.
- استخدم ماصة P20 لنقل الأنسجة الأبوالية المعزولة (بالداخل و2 مل) إلى أنبوب PCR يحتوي على 20 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي.
- نقل الجنين بعد الجراحة إلى بئر تحتوي على ما لا يقل عن 500 مل من مياه البحر العذبة في لوحة 24-أو 96 جيدا.
- كرر الخطوات 2.4-2.8 لعدد الأجنة حسب الحاجة.
- ضع لوحة البئر التي تحتوي على أجنة ما بعد الجراحة في حاضنة عند درجة حرارة 16 درجة مئوية أو RT حتى يتم الانتهاء من الكتابة الجينية.
3- استخراج الحمض النووي الجيني والنمط الجيني من الـ PCR
- تدور لفترة وجيزة أسفل أنابيب PCR التي تحتوي على المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي والأنسجة الجنينية المعزولة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (على سبيل المثال في 2680 × ز لمدة 10 ق).
- لاستخراج الحمض النووي الجيني من الأجنة المفردة، احتضان أنابيب PCR في 55 درجة مئوية لمدة 3 ح. دوامة لمدة 30 s كل 30 دقيقة لضمان تفكك كتل الخلايا وتعزيز تحليل الخلايا.
- احتضان أنابيب PCR في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل proteinase K.
- احتفظ بمستخلصات gDNA عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الجليد، ثم انتقل على الفور إلى PCR.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا عن طريق وضع مستخلصات gDNA في فريزر -20 درجة مئوية. - إعداد رد فعل PCR باستخدام gDNA المستخرجة كقالب لتضخيم موضع الفائدة الجينومية.
- إذا كانت الأليلات مختلفة في موضع الاهتمام تختلف في الحجم بحيث يمكن الكشف عن الفرق حجم من قبل الكهربائي هلام أغاروز، وتصميم مجموعة واحدة من التمهيديات لتضخيم المكان بأكمله.
- بدلا من ذلك، استخدم التمهيديات الخاصة بالأليل التي تولد منتجات PCR فقط في وجود أليل محددة؛ على سبيل المثال، من خلال تصميم التمهيدي الذي يربط إلى منطقة تحتوي على الطفرات الإدراج / الحذف.
- استخدام مزيج نموذجي من تفاعل PCR 20 مل على النحو التالي: 5 مل من مستخلصات gDNA، 8 مل من المياه الخالية من النوكليس، 4 مل من المخزن المؤقت PCR، 0.2 مل من 10 mM dNTPs، 0.6 مل من DMSO، 1 مل من 10 مل التمهيدي إلى الأمام، 1 مل من 10 مل التمهيدي العكسي ، و 0.2 مل من بوليميراز الحمض النووي (انظر جدولالمواد).
ملاحظة: يمكن استخدام العديد من المواد التمهيدية في رد فعل PCR. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين التمهيدي العالمي إلى الأمام واثنين من التمهيديات العكسية الخاصة بآليل، طالما تم تصميم التمهيديين العكسيين لتوليد منتجات PCR من أحجام متميزة بحيث يمكن أن يكون وجود / غياب الأليلات اثنين لا لبس فيه يحددها الكهربائي هلام (انظر قسم النتائج التمثيلية).
- تشغيل الأوجاروز جل الكهربائي لتحديد حجم ووجود / غياب منتجات PCR. ضبط حالة الأوغاروس جل الكهربائي (على سبيل المثال، نسبة هلام أغاروز، V / سم، والمدة) اعتمادا على الحجم المتوقع من منتجات PCR.
- استخدم نتائج PCR فيما يتعلق بحجم ووجود/غياب منتجات PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين ما بعد الجراحة. على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع أن تولد الأليلات المختلفة منتجات PCR من أحجام مختلفة، استخدم معلومات الحجم لتعيين النمط الجيني لكل جنين. وفي حالة استخدام المواد التمهيدية الخاصة بالأليل، ينبغي استخدام البيانات المتعلقة بوجود/عدم وجود منتجات الـ PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين.
- فرز الأجنة وفقا للنمط الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
جينوم نيماتوسلا لديه موضع واحد أن ترميز بروتين السلائف لGLWamide neuropeptide. وقد تم الإبلاغ عن ثلاثة أليليس متحولة بالضربة القاضية في هذا المكان(glw-a,glw-b,وglw-c) سابقا5. أربعة ذكور heterozygous تحمل أليل البرية من نوع (+) وخروج المغلوب أليل GLW-cفي موقع GLWamide (النمط الجيني: +/glw-c)عبرت مع أنثى heterozygous تحمل أليل البرية وخروج المغلوب مختلفة allele glw-a في نفس المكان (النمط الجيني: +/glw-a)لتوليد ذرية. هناك أربعة أنماط جينية ممكنة في الذرية: glw-a/glw-c، +/glw-c، glw-a/+، و +/+. من بين جميع الذرية، تم اختيار ثمانية أجنة عشوائياً لهذا الاختبار الجيني التمثيلي. لثنائية PCR، تم تصميم واحد التمهيدي إلى الأمام العالميواثنين من التمهيديات عكس allele محددة 5. التمهيدي العكسي المحدد لglw-a يربط إلى منطقة تحتوي على طفرات الإدراج، والحجم المتوقع للمنتج PCR هو 151 نقطة أساس. يرتبط التمهيدي العكسي المحدد للglw-c بمنطقة تحتوي على كل من طفرات الإدراج والحذف، والحجم المتوقع لمنتج PCR هو 389 نقطة أساس. ولا يمكن لأي من التمهيدي العكسي أن يرتبط بتسلسل النوع البري، وبالتالي لن يتم توليد أي منتجات من طراز PCR من الأجنة البرية. ويبين الشكل 1 نتيجة تمثيلية لـ PCR. الأجنة 1 و 2 تظهر الفرقة PCR واحد يتفق مع الحجم المتوقع من glw-a. تظهر الأجنة 3 و6 شريطين PCR تتوافقان مع الأحجام المتوقعة للألليس glw-aوglw-c . الأجنة 4 و7 و8 تظهر نطاق PCR واحد يتفق مع الحجم المتوقع من glw-c. الجنين 5 لا يظهر العصابات، مما يشير إلى عدم وجود الربط التمهيدي.
ولاستبعاد إمكانية فشل استخراج الجدنا، تم تشغيل PCR آخر باستخدام التمهيدي العكسي الذي يمكن أن يرتبط بتسلسل من النوع البري، والذي أظهر منتج PCR من الحجم المتوقع (1290 bp; الشكل2). وتجدر الإشارة إلى أنه في الشكل 2، أظهرت إحدى العينات (المشار إليها من قبل *) عدم وجود منتجات PCR، مما يشير إلى فشل في استخراج gDNA.
استناداً إلى النتائج المذكورة أعلاه، يتم تفسير النمط الجيني لكل جنين على النحو التالي: الجنين 1: +/glw-a،الجنين 2: +/glw-a، الجنين 3: glw -a/glw-c،الجنين 4: +/glw-c، الجنين 5: +/+، الجنين 6: glw-a/glw-c،الجنين 7: +/glw-c،والجنين 8: +/glw-c.
الشكل 1: النتائج التمثيلية لاختبار PCR للنماذج الجينية. 1-8 تمثل نتائج PCR النمط الجيني من الأجنة عينات عشوائيا بين ذرية F1 تقاطع متحولة heterozygous بين واحد +/glw-أنثى و +/glw-جالذكور. تم استخراج gDNA من جزء من الأنسجة الجنينية واستخدامها كقالب PCR. تم استهداف موضع GLWamide لتضخيم PCR، واستخدمت واحدة التمهيدي العالمي إلى الأمام واثنينمنالتمهيديات العكسية الخاصة بآليل (جدول المواد). التمهيدي العكسي محددة لGLW-a يولد 151 نقطة في الثانية PCR الفرقة (1، 2، 3، 6)، في حين أن التمهيدي العكسي محددة لGLW -c يولد 389 bp PCR الفرقة (3، 4، 6، 7، 8). ولا يمكن لأي من التمهيدي العكسي أن يرتبط بتسلسل النوع البري، وبالتالي لن يتم توليد أي منتجات PCR من الأجنة البرية (5). تم تشغيل هلام أجاروز 1.5٪ في 128 V لمدة 25 دقيقة. تم استخدام سلم الحمض النووي 100 نقطة أساس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لـ PCR الخاصة بالموقع لتأكيد وجود الحمض النووي الريبي. وقد استخدمت عشرة مستخلصات gDNA التي فشلت في توليد منتجات PCR في تجارب PCR الخاصة بـ glw متحولة الأليل، بما في ذلك الجنين 5 من الشكل 1 ('5')، كقوالب PCR لتجربة PCR المعروضة. تم استخدام التمهيديات العالمية إلى الأمام وعكس GLWamide-locus محددة لتوليد منتج PCR 1290 bp من الأليل البرية. وأظهرت تسعة من كل عشرة مقتطفات من الحمض النووي (باستثناء تلك المشار إليها*) نطاق PCR من الحجم المتوقع، بما في ذلك الجنين 5 من الشكل 1 ('5'). وهذا يشير إلى أن الفشل في توليد منتجات PCR من الجنين 5 لم يكن بسبب عدم وجود قالب gDNA كافية. تم تشغيل هلام أجاروز 1.5٪ في 128 V لمدة 25 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR إلى النمط الجيني لجنين النعمان البحر واحد دون التضحية الحيوان. بعد التفريخ وإزالة هلام، يسمح للبيض المخصبة أن تتطور إلى gastrulae. تتم إزالة المنطقة الأبالة لكل جنين غازيولا جراحيا، ويستخدم الأنسجة الأبوروفال المعزولة لاستخراج الحمض النووي الجيني اللاحقة، في حين أن الأجنة المتبقية بعد الجراحة تلتئم وتواصل التطور. ثم يتم استخدام مقتطفات gDNA لإجراء فحص PCR لتحديد النمط الجيني لكل جنين. هذه الطريقة تستفيد من قدرة النصفين الفمويين من جنين النعمان البحري على تنظيم وتطوير10و11 وغالبية الأجنة (>90%). عادة البقاء على قيد الحياة الجراحة وتطوير عادة في ظل ظروف الثقافة المناسبة. كمية الأنسجة المطلوبة لهذا الاختبار النمط الجيني هو أقل من نصف جنين gastrula كامل، والنتائج السلبية الناجمة عن فشل استخراج gDNA نادرة (<5٪). وبالنظر إلى أن كمية صغيرة فقط من الأنسجة ضرورية، فمن المرجح أن يكون من الممكن استخدام الأجنة مرحلة ما قبل gastrula لهذا الاختبار الجيني. على الرغم من أن هذا لم يتم اختباره بعد. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة بكفاءة طالما أن الحيوان لم يصل إلى مرحلة السباحة النشطة (أي قبل مرحلة البلانولا السباحة الحرة). وطريقة الكتابة الجينية هذه مفيدة بشكل خاص في الحالات التي تتطلب إجراء تحليلات النمط الظاهري أثناء التنمية.
أحد قيود هذا البروتوكول هو أن عدد الأجنة القادرة على فحص قد يكون محدوداً. على وجه الخصوص، يمكن أن تستغرق الإزالة الجراحية للأنسجة الأبالية دقيقة إلى دقيقتين لكل جنين، وخاصة بالنسبة للجنين غير البادئ. يجب أن يكون الباحث من ذوي الخبرة قادراً على إكمال الاختبار الجيني الكامل لما لا يقل عن 80 جنينًا يوميًا، ولكن الدراسات التي تشمل مئات أو آلاف الأجنة من المرجح أن تستغرق وقتاً طويلاً بحيث لا يمكن إكمالها في يوم واحد.
كما يحتاج الباحثون إلى أن يضعوا في اعتبارهم أن النمط الظاهري الذي لوحظ في المتحولين بعد الجراحة قد يكون مختلفاً عن ذلك في المتحولين السليمين، على سبيل المثال، بسبب تأثير الضربة القاضية الجينية على الشفاء و/أو التنظيم الجنيني في الغاز. وينبغي اختبار هذه الإمكانية من خلال فحص ما إذا كان النمط الظاهري الموجود في المسوخ بعد الجراحة يمكن ملاحظته بالفعل في المتحولين سليمة.
وهناك عدة نُهُج بديلة للطريقة الموصوفة للكتابة الجينية. أولاً، يمكن إجراء تلطيخ المناعة مع جسم مضاد ضد البروتين الذي يتم فقدان تعبيره في المتحولين بالضربة القاضية لتحديد الأفراد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثياً من الحيوانات النامية. ثانياً، يمكن استخدام التهجين في الموقع لهذا الغرض، إذا كان يمكن تصميم الريبوبروبين بحيث لا يتهجن إلى mRNAs متحولة. على سبيل المثال، إذا كانت الأليلات المتحولة لحيواني بالضربة القاضية تحمل طفرات حذف كبيرة في نفس المنطقة من الجين، يمكن تصميم الريبوبروبين لتهجين إلى منطقة الجين المحذوف في المتحولين بالضربة القاضية. في كلتا الحالتين، من المتوقع أن تظهر المتحولين بالضربة القاضية أي وضع العلامات، في حين أن الأفراد heterozygous والبرية من نوع يجب أن تظهر وضع العلامات. ومع ذلك، فإن الحيوانات تحتاج إلى التضحية بسبب تثبيت الأنسجة المطلوبة للتلطيخ. وأخيرا، يمكن رفع المتحولين بالضربة القاضية إلى النضج الجنسي وعبرت مع بعضها البعض لتوليد ذرية، وكلها ينبغي أن تكون متحولة بالضربة القاضية، ويمكن إجراء تحليلات للالنمط الظاهري التنموي باستخدام هذا السلف6. ويتطلب هذا الأسلوب أن تكون الحيوانات بالضربة القاضية قابلة للحياة وقادرة على التكاثر، وبالتالي فهي محدودة في تطبيقها على الجينات غير الأساسية.
على الرغم من أن بروتوكول النماذج الجينية الموصوفة مصمم لأجنة النعمان البحرية، فمن الممكن استخدام هذه الطريقة مع الكنيداريين الآخرين التي يمكن الوصول إليها من المعلومات الجينية والأجنة (على سبيل المثال، الشعاب المرجانية12 وقنديل البحر13)،طالما الأجنة قادرة على الشفاء والتنظيم عند الإزالة الجراحية. وقد تم الإبلاغ عن تجارب تعديل الجينات بنجاح كريسبر بوساطة بالفعل في الشعاب المرجانية14 وكذلك قنديل البحر الهيدروزان15،16. وستكون التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول الجيني لمن هم في النعمان غير البحرية مهمة لدراسة الأساس الجيني لتطورهم. وهذا بدوره سيكون أساسياً في اكتساب رؤى آلية في تطور التنمية الكنادرية المتنوعة بشكل ملحوظ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم على النسخة السابقة من المخطوطة، التي حسنت المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة أركنساس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G.
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
