Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Meeresanemone Nematostella vectensis während der Gastrulation zu genotypisieren, ohne den Embryo zu opfern.
Abstract
Beschrieben ist hier ein PCR-basiertes Protokoll, um den Gastorula-Stadium-Embryo des anthozoischen cnidären Nematostella vectensis zu genotypisieren, ohne das Leben des Tieres zu opfern. Nach In-vitro-Fertilisation und Enthaarung dürfen sich Zygoten für 24 h bei Raumtemperatur entwickeln, um das Früh- bis Mittelgastrulastadium zu erreichen. Die Gastorula-Embryonen werden dann auf einem Agarose-Gelbett in einer Petrischale mit Meerwasser platziert. Unter dem Sezieren des Mikroskops wird eine Wolframnadel verwendet, um ein Aboralgewebefragment von jedem Embryo operativ zu trennen. Embryonen nach der Operation dürfen dann heilen und weiterentwickelt werden. Genomische DNA wird aus dem isolierten Gewebefragment extrahiert und als Vorlage für die ortsspezifische PCR verwendet. Der Genotyp kann anhand der Größe von PCR-Produkten oder des Vorhandenseins/Fehlens von allelespezifischen PCR-Produkten bestimmt werden. Nachderinwerden von Embryonen wird dann nach dem Genotyp sortiert. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gescreenen Embryonen ab, erfordert aber minimal 4–5 h. Diese Methode kann verwendet werden, um Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen zu identifizieren und ermöglicht Analysen von Phänotypen während der Entwicklung.
Introduction
Die Cnidarians repräsentieren eine vielfältige Gruppe von Tieren, die Quallen, Korallen und Seeanemonen umfassen. Es handelt sich um Diploblasten, die aus Ektoderm und Endoderm bestehen und durch eine extrazelluläre Matrix (Mesoglea) getrennt sind. Cnidaria ist eine Schwestergruppe zur Speziiose Bilateria, zu der traditionelle Tiermodelle wie Drosophila und Mus gehören1. Zusätzlich wird angenommen, dass die Divergenz Cnidaria-Bilateria in der vorkambrischen Periode2aufgetreten ist. Als solche sind vergleichende Studien an Cnidarians und Bilaterianern unerlässlich, um Einblicke in die Biologie ihres jüngsten gemeinsamen Vorfahren zu gewinnen. Kürzlich hat die vergleichende Genomik gezeigt, dass Cnidarians und Bilaterianer viele Entwicklungs-Toolkit-Gene wie Kerb und bHLH teilen, was impliziert, dass ihr gemeinsamer Vorfahrbereitsen diese Gene hatte3. Die Rolle dieser Entwicklungs-Toolkit-Gene im letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria ist jedoch vergleichsweise weniger gut verstanden. Um dieses Problem anzugehen, ist es wichtig zu untersuchen, wie diese tief konservierten Gene bei Cnidarians funktionieren.
Eines der aufkommenden cnidarian genetischen Modelle ist die anthozoanE Nematostella vectensis. Sein Genom wurde3sequenziert, und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen, einschließlich Morpholino-vermittelter Genknockdown, Meganuklease-vermittelte Transgenese und CRISPR-Cas9-vermittelte Genknockins und Knockouts, sind jetzt für den Einsatz in diesem Tier verfügbar. Darüber hinaus ist die Nematostella-Entwicklung relativ gut verstanden. Während der Embryogenese tritt die Gastrulation durch Invagination4auf und der Embryo entwickelt sich zu einer freischwimmenden Planulalarve. Die Planula verwandelt sich anschließend in einen sessilen Polypen mit Mund und umlaufenden Tentakeln. Der Polypen wächst dann und erreicht die Geschlechtsreife.
CRISPR-Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese wird jetzt routinemäßig verwendet, um die Genfunktion in Nematostella vectensis5,6,7,8,9zu untersuchen. Zur Erzeugung von Knockout-Mutanten in Nematostellawird ein Cocktail mit lokusspezifischen Ein-Guide-RNAs und dem Endonuklease-Cas9-Protein zunächst in unbefruchtete oder befruchtete Eier injiziert, um F0-Gründertiere zu produzieren, die typischerweise Mosaik. F0-Tiere werden anschließend zur Geschlechtsreife erhoben und miteinander gekreuzt, um eine F1-Population zu erzeugen, von denen eine Teilmenge Knockout-Mutanten6sein kann. Alternativ können geschlechtsreife F0-Tiere mit Wildtieren gekreuzt werden, um F1-Heterozygoten zu erzeugen, und F1-Heterozygoten, die ein Knockout-Allel im Ort des Interesses tragen, können dann miteinander gekreuzt werden, um F2-Nachkommen zu produzieren, ein Viertel von denen erwartet werden, knockout mutants5sein. Beide Ansätze erfordern eine Methode zur Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population. Polyp Tentakel können verwendet werden, um genomische DNA für genotypisieren6,7zu extrahieren. In Fällen, in denen die Entwicklungsfunktion des Gens untersucht wird und mutierte Embryonen das Polypenstadium nicht erreichen (d. h. aufgrund der mit der Mutation verbundenen Larventoalität), müssen Knockout-Mutanten früh in der Ontogenidentifizierten identifiziert werden. Hier wird ein PCR-basiertes Protokoll beschrieben, um einzelne Tiere im Gastrulastadium zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern, was die Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen ermöglicht. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gesiebenden Embryonen ab, erfordert aber minimal 4-5 h.
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Protocol
1. Induktion von Laichen, In-vitro-Fertilisation und Entgeleeung
- Halten Sie Nematostella vectensis im Meerwasser mit einem Salzgehalt von 12 Teilen pro Tausend (ppt) in der Dunkelheit bei 16 °C, Fütterung Artemia täglich.
- Am Tag vor der Laichinduktion die Tiere in einen temperatur- und lichtgesteuerten Inkubator geben. Programmieren Sie den Inkubator so, dass die Tiere bei 25 °C 8 h Licht ausgesetzt sind. Optional: Füttern Sie einzelne Tiere einkleines Stück Austern (<1 mm 3), bevor Sie sie in den Brutkasten legen, um das Laichen zu verbessern.
- Lassen Sie die Tiere im Brutkasten für 1 h bei 16 °C.
- Entfernen Sie die Tiere aus dem Brutkasten und lassen Sie sie auf einer Tischplatte mit Licht bei Raumtemperatur (RT), um das Laichen zu ermöglichen. Das Laichen erfolgt in der Regel innerhalb der nächsten 1,5-2 h.
- Wenn Männchen und Weibchen in getrennten Behältern sind, legen Sie Eipakete aus dem weiblichen Behälter in einen Sperma-haltigen männlichen Behälter, indem Sie eine Transferpipette verwenden, deren Spitze geschnitten wird, um die Öffnung zu vergrößern, damit die Eier nicht durch mechanische Beanspruchung während der verlegen. Lassen Sie die Befruchtung der Eier zu, indem Sie sie mindestens 15 min im männlichen Behälter lassen.
- Entgelee die Ei-Pakete in Meerwasser mit 3% Cystein (pH 7.4) auf einer Petrischale oder in einem 15 ml Rohr. Rühren Sie 12 min lang sanft auf einem Shaker.
- Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um Klumpen aufzubrechen und weiter für weitere 2-3 min zu agitieren, bis sie vollständig entgelt werden.
- Entfernen Sie Cystein, indem Sie die Medien durch frisches Meerwasser für mindestens 5x ersetzen.
- Bewahren Sie die befruchteten Eier auf einer glasigen Petrischale bei 16 °C oder RT auf.
2. Chirurgische Entfernung eines Aboralgewebes aus einem Gastorula-Embryo
- Bereiten Sie einen DNA-Extraktionspuffer vor, der aus 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 und 1 mg/mL-Proteinase K besteht. Verwenden Sie 20 ml des Extraktionspuffers pro Embryo. Mischen Sie gut durch Wirbeln und aliquot den Puffer in PCR-Röhren.
- 1% Agarose im Meerwasser auflösen und in eine Petrischale gießen, um den Boden zu bedecken. Kühlen Sie auf einer Tischplatte, um ein Gelbett zu machen. Gießen Sie frisches Meerwasser, um das Gelbett in der Petrischale zu bedecken.
- 24 h Embryon nach der Befruchtung (hpf) (Früh- bis Mittelgastrulastadium) in die Petrischale mit einem Agarose-Gelbett übertragen.
- Legen Sie eine Wolframnadel in einen Nadelhalter und sterilisieren, indem Sie die Nadelspitze in Alkohol (70% oder höher) tauchen und in Flammen setzen, um den Alkohol abzubrennen.
- Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop (bei 20x bis 40x Vergrößerung) die Wolframnadel, um eine Depression auf dem Agarosebett zu machen, indem Sie ein Stück Oberflächenagarose von der Größe eines zu manipulierenden Embryos entfernen, und legen Sie den Embryo mit seiner seitlichen nach unten gerichtet, um die Bewegung des Embryos für die Mikrochirurgie einzuschränken.
- Verwenden Sie die Wolframnadel, um ein Stück Aboralgewebe gegenüber der oralen blastoporalen Öffnung chirurgisch zu verbrauchen. Ein aborales Drittel bis ein Viertel des embryonalen Gewebes entlang der oral-aboralen Achse ist in der Regel ausreichend.
- Verwenden Sie eine P20-Pipette, um das isolierte Abbruchgewebe (in <2 ml) in ein PCR-Rohr mit 20 ml DNA-Extraktionspuffer zu übertragen.
- Übertragen Sie den embryonalen Embryo nach der Operation in einen Brunnen, der mindestens 500 ml Süßwasser in einer 24- oder 96-Well-Platte enthält.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4–2.8 für die Anzahl der Embryonen nach Bedarf.
- Legen Sie die Brunnenplatte mit post-surgery embryos in einem Inkubator bei 16 °C oder RT, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist.
3. Genomische DNA-Extraktion und Genotypisierung PCR
- Drehen Sie die PCR-Röhren, die den DNA-Extraktionspuffer und isolierte embryonale Gewebe enthalten, kurz mit einer Minizentrifuge (z.B. bei 2.680 x g für 10 s) herunter.
- Um genomische DNA aus einzelnen Embryonen zu extrahieren, inkubieren Sie die PCR-Röhren bei 55 °C für 3 h. Wirbel für 30 s alle 30 min, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu gewährleisten und die Zelllyse zu verbessern.
- Inkubieren Sie die PCR-Röhren bei 95 °C für 5 min, um die Proteinase K zu inaktivieren.
- GDNA-Extrakte bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren und sofort zur PCR übergehen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, indem gDNA-Extrakte in einem -20 °C-Gefrierschrank platziert werden. - Richten Sie eine PCR-Reaktion mit extrahierter gDNA als Vorlage ein, um den genomischen Ort von Interesse zu verstärken.
- Wenn sich verschiedene Allele am Ort des Interesses in der Größe unterscheiden, so dass der Größenunterschied durch Agarose-Gel-Elektrophorese erkannt werden kann, entwerfen Sie einen einzigen Satz von Primern, um den gesamten Ort zu verstärken.
- Alternativ können Sie allelespezifische Primer verwenden, die PCR-Produkte nur in Gegenwart des spezifischen Alleels erzeugen; z. B. durch Entwerfen des Primers, der an einen Bereich bindet, der Einfüge-/Löschmutationen enthält.
- Verwenden Sie einen typischen 20 ml PCR-Reaktionsmix wie folgt: 5 ml gDNA-Extrakte, 8 ml nukleasefreies Wasser, 4 ml PCR-Puffer, 0,2 ml 10mM dNTPs, 0,6 ml DMSO, 1 ml 10 ml Vorwärtsgrundierung, 1 ml 10 ml Reverse Primer und 0,2 ml DNA-Polymerase (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Mehrere Primer können in einer PCR-Reaktion verwendet werden. So können beispielsweise ein universeller Vorwärtsprimer und zwei allelespezifische Reverse Primer kombiniert werden, sofern die beiden Reverse Primer so konzipiert sind, dass pcR-Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt werden, so dass das Vorhandensein/Fehlen der beiden Allele eindeutig sein kann. Gelelektrophorese bestimmt (siehe Abschnitt repräsentative Ergebnisse).
- Führen Sie agarose GelElektrophorese, um die Größe und Präsenz / Abwesenheit von PCR-Produkten zu bestimmen. Passen Sie den Zustand der Agarose-Gel-Elektrophorese (z. B. Agarose-Gel-Prozentsatz, V/cm und Dauer) in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der PCR-Produkte an.
- Verwenden Sie die Ergebnisse von PCR in Bezug auf die Größe und Anwesenheit/Abwesenheit von PCR-Produkten, um jedem embryonalen Embryo nach der Operation einen Genotyp zuzuweisen. Wenn z. B. von verschiedenen Allelen erwartet wird, dass pcR-Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt werden, verwenden Sie die Größeninformationen, um den Genotyp für jeden Embryo zuzuweisen. Wenn allelespezifische Primer verwendet werden, sollten die Daten über das Vorhandensein/Fehlen von PCR-Produkten verwendet werden, um jedem Embryo einen Genotyp zuzuweisen.
- Sortieren Sie Embryonen nach Genotyp.
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Representative Results
Das Nematostella-Genom hat einen einzigen Ort, der ein Vorläuferprotein für das Neuropeptid GLWamid kodiert. Drei Knockout-Mutant-Allele an diesem Ort (glw-a, glw-bund glw-c) wurden bereits 5 gemeldet. Vier heterozygote Männchen, die ein Wild-Typ-Allel (+) und Knockout-Allel-Glw -cam GLWamide-Lokus (Genotyp: +/glw-c)trugen, wurden mit einem heterozygoten Weibchen gekreuzt, das ein Wild-Typ-Allel und einen anderen Knockout trug. allele glw-a am selben Ort (Genotyp: +/glw-a), um eine Nachkommenschaft zu erzeugen. Es gibt vier mögliche Genotypen in der Nachkommenschaft: glw-a/glw-c, +/glw-c, glw-a/+ und +/+. Von allen Nachkommen wurden acht Embryonen nach dem Zufallsprinzip für diesen repräsentativen Genotypisierungstest ausgewählt. Für die Genotypisierung der PCR wurden eine universelle Vorwärtsgrundierung und zwei allelespezifische Reverseprimer5entwickelt. Der für glw-a spezifische Reverse primer bindet an einen Bereich, der Insertionsmutationen enthält, und die erwartete Größe des PCR-Produkts beträgt 151 bp. Der für glw-c spezifische Reverse primer bindet an einen Bereich, der sowohl Einfüge- als auch Löschmutationen enthält, und die erwartete Größe des PCR-Produkts beträgt 389 bp. Keiner der Reverse Primer kann an die Wildtyp-Sequenz binden, und daher werden keine PCR-Produkte aus Wilden-Embryos erzeugt. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis des PCR-Assays. Embryonen 1 und 2 zeigen ein einzelnes PCR-Band, das mit der erwarteten Größe von glw-a übereinstimmt. Embryonen 3 und 6 zeigen zwei PCR-Bänder, die den erwarteten Größen für Allele glw-aund glw-centsprechen. Die Embryonen 4, 7 und 8 zeigen ein einzelnes PCR-Band, das mit der erwarteten Größe von glw-c übereinstimmt. Embryo 5 zeigt keine Bänder, was auf den Mangel an Primerbindung hindeutet.
Um einen Ausfall der gDNA-Extraktion auszuschließen, wurde eine andere PCR mit einem Reverse Primer ausgeführt, der an die Wildtyp-Sequenz binden kann, die ein PCR-Produkt von einer erwarteten Größe (1290 bp; Abbildung 2). Es sei darauf hingewiesen, dass in Abbildung 2eine der Proben (angezeigt durch *) keine PCR-Produkte zeigte, was auf einen Fehler bei der gDNA-Extraktion hindeutet.
Basierend auf den obigen Ergebnissen wird der Genotyp jedes Embryos wie folgt interpretiert: Embryo 1: +/glw-a, Embryo 2: +/glw-a, Embryo 3: glw-a/glw-c, Embryo 4: +/glw-c, Embryo 5: +/+, Embryo 6: glw-a/glw-c, Embryo 7: +/glw-c, und Embryo 8: +/glw-c.
Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse eines genotypisierenden PCR-Assays. 1-8 repräsentieren genotypierende PCR-Ergebnisse von zufällig beprobten Embryonen unter den Nachkommen einer heterozygoten Mutanten-Kreuzung von F1 zwischen einem +/glw-weiblichen und +/glw-c-Männchen. gDNA wurde aus einem embryonalen Gewebefragment extrahiert und als PCR-Vorlage verwendet. Der GLWamid-Lokus wurde für die PCR-Verstärkung bestimmt, und es wurden eine universelle Vorwärtsgrundierung und zwei allelespezifische Reverseprimer verwendet (Tabelle der Materialien). Der für glw-a spezifische Reverse primer erzeugt ein 151 bp PCR-Band (1, 2, 3, 6), während der für glw-c spezifische Reverse Primer ein 389 bp PCR-Band (3, 4, 6, 7, 8) erzeugt. Keiner der Reverse primer kann an die Wildtypsequenz binden, und daher werden keine PCR-Produkte aus Wilden-Embryos erzeugt (5). Das 1,5% Agarose-Gel wurde 25 min bei 128 V betrieben. Eine 100 bp DNA-Leiter wurde verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der ortsspezifischen PCR zur Bestätigung des Vorhandenseins von gDNA. Zehn gDNA-Extrakte, die pcR-Produkte in glw mutierten allelespezifischen PCR-Experimenten nicht erzeugten, einschließlich Embryo 5 aus Abbildung 1 ('5'), wurden als PCR-Vorlagen für das gezeigte PCR-Experiment verwendet. Ein universelles Vorwärts- und Rückwärts-GLWamid-locus-spezifische Primer wurden verwendet, um ein 1290 bp PCR-Produkt aus einem Wild-Typ-Allel zu erzeugen. Neun von zehn DNA-Extrakten (mit Ausnahme des angegebenen*) zeigten ein PCR-Band von der erwarteten Größe, einschließlich Embryo 5 aus Abbildung 1 ('5'). Dies deutet darauf hin, dass das Versäumnis, PCR-Produkte aus dem Embryo 5 zu erzeugen, nicht auf das Fehlen einer ausreichenden gDNA-Vorlage zurückzuführen war. Das 1,5% Agarose-Gel wurde bei 128 V für 25 min betrieben. 1 kb DNA-Leiter wurde verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Beschrieben hier ein PCR-basiertes Protokoll, um einen einzelnen Seeanemonen-Embryo zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern. Nach dem Laichen und Entgelten dürfen sich die befruchteten Eier zu Gastrulae entwickeln. Die aborale Region jedes Gastorula-Embryos wird operativ entfernt, und das isolierte Aboralgewebe wird für die nachfolgende genomische DNA-Extraktion verwendet, während die verbleibenden postoperativen Embryonen heilen und die Entwicklung fortsetzen. Die gDNA-Extrakte werden dann für einen PCR-Test verwendet, um den Genotyp jedes Embryos zu bestimmen. Diese Methode nutzt die Fähigkeit der oralen Hälften des Seeanemonen-Embryos,10,11und die Mehrheit der Embryonen zu regulieren und zu entwickeln (>90%) in der Regel die Operation überleben und sich normal unter geeigneten Kulturbedingungen entwickeln. Die für diesen Genotypisierungstest benötigte Gewebemenge beträgt weniger als die Hälfte eines gesamten Gastrula-Embryos, und negative Ergebnisse aufgrund von gDNA-Extraktionsversagen sind selten (<5%). Da nur eine geringe Menge Gewebe erforderlich ist, ist es wahrscheinlich möglich, Embryos im Prägastorenstadium für diesen Genotypisierungstest zu verwenden; obwohl dies noch getestet werden muss. Diese Methode kann effizient durchgeführt werden, solange das Tier noch kein Stadium des aktiven Schwimmens erreicht hat (d.h. vor der Freischwimmplanula). Diese Genotypisierungsmethode ist besonders vorteilhaft in Fällen, in denen die Durchführung von Phänotypanalysen während der Entwicklung erforderlich ist.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die Anzahl der embryonen, die gesiescreent werden können, begrenzt sein kann. Insbesondere die chirurgische Entfernung eines Aboralgewebes kann ein bis zwei Minuten pro Embryo dauern, insbesondere für Uneingeweihte. Ein erfahrener Forscher sollte in der Lage sein, den gesamten Genotypisierungstest für mindestens 80 Embryonen pro Tag abzuschließen, aber Studien mit Hunderten oder Tausenden von Embryonen sind wahrscheinlich zu zeitaufwändig, um sie an einem Tag abzuschließen.
Die Forscher müssen auch darauf achten, dass sich der bei Mutanten nach der Operation beobachtete Phänotyp von dem bei intakten Mutanten unterscheiden kann, zum Beispiel aufgrund der Wirkung von Gen Knockout auf die Heilung und/oder embryonale Regulation in Gastrulae. Diese Möglichkeit sollte getestet werden, indem untersucht wird, ob der Phänotyp, der in post-chirurgischen Mutanten gefunden wird, tatsächlich in intakten Mutanten beobachtbar ist.
Es gibt mehrere alternative Ansätze für die beschriebene Methode der Genotypisierung. Erstens kann eine Immunfärbung mit einem Antikörper gegen ein Protein durchgeführt werden, dessen Expression in Knockout-Mutanten verloren geht, um Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population sich entwickelnder Tiere zu identifizieren. Zweitens kann die In-situ-Hybridisierung zu diesem Zweck verwendet werden, wenn die Riboprobe so konzipiert werden kann, dass sie nicht zu mutierten mRNAs hybridisiert. Wenn beispielsweise die mutierten Allele eines Knockout-Tiers große Deletionsmutationen in derselben Region des Gens aufweisen, kann die Riboprobe so konzipiert werden, dass sie in den Knockout-Mutationen in den Knockout-Mutanten gemildert wird. In beiden Fällen wird erwartet, dass Knockout-Mutationen keine Kennzeichnung aufweisen, während heterozygote und wilde Individuen eine Kennzeichnung aufweisen sollten. Die Tiere müssen jedoch aufgrund der für die Färbung erforderlichen Gewebefixierung geopfert werden. Schließlich können Knockout-Mutationen zur Geschlechtsreife erhoben und miteinander gekreuzt werden, um eine Nachkommenschaft zu erzeugen, die alle Knockout-Mutanten sein sollten, und Analysen des Entwicklungsphänotyps können mit dieser Nachkommenschaft durchgeführt werden6. Diese Methode erfordert, dass die Knockout-Tiere lebensfähig und vermehrbar sind und daher in ihrer Anwendung auf nicht essentielle Gene beschränkt sind.
Obwohl das beschriebene Genotypisierungsprotokoll für Seeanemonen-Embryonen konzipiert ist, ist es möglich, diese Methode mit anderen Cnidarians zu verwenden, bei denen sowohl genomische Informationen als auch Embryonen zugänglich sind (z. B. Korallen12 und Quallen13), solange die Embryonen sind in der Lage, heilungsfähig und regulieren bei chirurgischer Entfernung. Erfolgreiche CRISPR-vermittelte Genmodifikationsexperimente wurden bereits in Korallen14 sowie Hydrozoenquallen15,16berichtet. Zukünftige Anwendungen dieses Genotypisierungsprotokolls auf Nicht-See-Anemone-Cnidarians werden für Studien über die genetische Grundlage ihrer Entwicklung wichtig sein. Dies wiederum wird der Schlüssel sein, um mechanistische Einblicke in die Entwicklung einer bemerkenswert unterschiedlichen cnidarianentwicklung zu gewinnen.
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Disclosures
Der Autor hat nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken anonymen Rezensenten für Kommentare zur früheren Version des Manuskripts, die das Manuskript verbessert hat. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der University of Arkansas unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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