Summary
このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。
Abstract
ここに記載されているのは、動物の生命を犠牲にすることなく、アントゾアン・クニダリアン・ネマトステラ・ヴェテンシスのガストラ期胚を遺伝子型化するPCRベースのプロトコルである。体外受精および脱ゼリーに続いて、ザイゴットは早期から中型ガストルラ段階に達するために室温で24時間の開発を可能にする。ガストラ胚は、海水を含むペトリ皿のアガロースゲルベッドに置かれる。解剖顕微鏡の下では、タングステン針を使用して、各胚から卵巣組織断片を外科的に分離する。手術後の胚は治癒し、発達を続けることを許される。ゲノムDNAは、単離された組織断片から抽出され、遺伝子座特異的PCRのテンプレートとして使用される。遺伝子型は、PCR産物の大きさまたは対立遺伝子特異的PCR産物の有無に基づいて決定することができる。手術後の胚は、遺伝子型に従ってソートされます。ジェノタイピングプロセス全体の持続時間は、スクリーニングする胚の数に依存しますが、最小に4-5時間を必要とします。この方法は、胚の遺伝的に異種集団からのノックアウト変異体を同定し、発達中の現象型の分析を可能にするために使用することができる。
Introduction
クニダリアンはクラゲ、サンゴ、海のアネモネを含む動物の多様なグループを表します。それらは、細胞外マトリックス(メソグレア)によって分離された外皮および内皮から成るジプロプラストである。クニダリアは、ショウジョウバエやムスなどの伝統的な動物モデルが1に属するビラテリアを見極める姉妹グループです。さらに、クニダリア・ビラテリアの発散は、カンブリア紀前の2年に起こったと考えられている。したがって、クニダリアンと二国間の比較研究は、彼らの最も最近の共通の祖先の生物学に関する洞察を得るために不可欠です。最近、比較ゲノミクスは、クニダリアンと二国間の遺伝子がノッチやbHLHなどの多くの発達ツールキット遺伝子を共有していることを明らかにし、彼らの共通の祖先はすでにこれらの遺伝子3を持っていたことを示唆している。しかし、Cnidariaとバイラテリアの最後の共通祖先におけるこれらの発達ツールキット遺伝子の役割は、比較してあまりよく理解されていない。この問題に対処するためには、これらの深く保存された遺伝子がクニダリアンでどのように機能するかを研究することが重要です。
新しいクニダリアン遺伝モデルの一つは、アントゾアン・ネマトステラ・ベクテンシスである。そのゲノムは3を配列し、モルフォリノ媒介遺伝子ノックダウン、メガヌクレアーゼ媒介トランスジェネシス、CRISPR-Cas9媒介遺伝子ノクチンおよびノックアウトを含む様々な遺伝的ツールがこの動物で使用できるようになりました。また、ネマトステラの開発は比較的よく理解されています。胚発生時には、胃形成は浸変4によって起こり、胚は自由泳ぎプラヌラ幼虫に発達する。その後、プラヌラは口と円周触手を持つセッシルポリープに変身します。ポリープは成長し、性的成熟に達します。
CRISPR-Cas9媒介型標的変異体は、現在、ネマトステラベクテンシス5、6、7、8、9の遺伝子機能を研究するために日常的に使用されている。ネマトステラでノックアウト変異体を生成するために、遺伝子座特異的なシングルガイドRNAとエンドヌクレスリースCas9タンパク質を含むカクテルを最初に未受精または受精卵に注入し、F0の創始者の動物を生成する。モザイク。F0動物は、その後、性的成熟に育てられ、F1集団を生成するために互いに交差し、そのサブセットは、変異体6をノックアウトしてもよい。あるいは、性的に成熟したF0動物は、F1ヘテロジゴウス動物を生成するために野生型の動物と交配することができ、興味のある軌跡でノックアウト対立遺伝子を運ぶF1ヘテロジゴットは、F2子孫、四分の一を生成するために互いに交差することができますそのうちの5はノックアウト変異体であると予想される。どちらのアプローチも、遺伝的に異種集団からノックアウト変異体を同定する方法を必要とする。ポリープ触手は、ジェノタイピング6、7のためのゲノムDNAを抽出するために使用することができます。しかし、対象遺伝子の発達機能が調査され、変異胚がポリープ段階に達しない場合(すなわち、変異に関連する幼虫致死性のために)、ノックアウト変異体を早期に同定する必要がある。ここで説明するPCRベースのプロトコルは、動物を犠牲にすることなく、ガストラ段階で個々の動物を遺伝子型化するプロトコルであり、これは胚の遺伝的に異種集団からのノックアウト変異体の同定を可能にする。ジェノタイピングプロセス全体の持続時間は、スクリーニングする胚の数に依存しますが、最小限に4〜5時間を必要とします。
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Protocol
1. 産卵、体外受精、脱ゼリーの誘導
- 16 °Cで暗闇の中で1000(ppt)あたり12部のサリン度で海水中のネマトステラベクテン症を維持し、毎日アルテミアを供給します。
- 産卵の前日に、動物を温度と光制御のインキュベーターに入れます。動物が25°Cで8時間の光にさらされるようにインキュベーターをプログラムします。オプション:産卵を強化するためにインキュベーターに入れる前に、個々の動物にカキの小片(<1 mm 3)を供給します。
- 16°Cで1時間のインキュベーターに動物を残します。
- インキュベーターから動物を取り出し、室温(RT)で光でベンチトップに残して産卵を許可します。スポーンは通常、次の1.5-2時間以内に発生します。
- オスとメスが別々の容器に入っている場合は、卵が機械的ストレスによって損傷を受けないように先端を切断して開口部を拡大する転写ピペットを使用して、メスの容器から精子を含むオスの容器に卵のパッケージを置きます。転送。卵を少なくとも15分間オスの容器に入れて受精させなさい。
- ペトリ皿または15mLチューブに3%システイン(pH 7.4)を含む海水中の卵パッケージを脱ゼリー。シェーカーで12分間ゆっくりと攪拌します。
- プラスチック製のピペットを使用して塊を分割し、完全に脱ゼリーされるまで別の2-3分間攪拌し続けます。
- 少なくとも5倍の新鮮な海水でメディアを交換することにより、システインを削除します。
- 受精卵をガラスペトリ皿の上に16 °C または RT で保管します。
2. 胃胚からの腹部組織の外科的除去
- 10 mMトリス-HCl(pH8)、50mM KCl、1mM EDTA、0.3%Tween20、0.3%NP40、および1mg/mLタンパク質数K.からなるDNA抽出バッファーを胚当たり20mL使用する。ボルテックスでよく混ぜ、バッファをPCRチューブにアリコートします。
- 海水に1%アガロゼを溶かし、底を覆うためにペトリ皿に注ぎます。ベンチトップで冷やしてゲルベッドを作ります。ペトリ皿のゲルベッドをカバーするために新鮮な海水を注ぎます。
- 24時間の受精後(hpf)胚(早期から中ガストルラ段階)をアガロースゲルベッドを含むペトリ皿に移す。
- タングステン針を針ホルダーに挿入し、アルコール(70%以上)に針の先端を浸し、アルコールを燃やすために炎に入れて殺菌します。
- 解剖顕微鏡(20倍~40倍の倍率)の下で、タングステン針を使用して、操作する胚の大きさに関する表面アガロースを取り除き、胚を横にしてうつ病の上に置くことによって、アガロースベッドにうつ病を作ります。マイクロ手術のための胚の動きを制限するために下向きに側面。
- タングステン針を使用して、口腔の表開きに反対側に位置する卵巣組織の一部を外科的に切除する。経口側軸に沿った胚組織の3分の1から4分の1の卵巣で十分である。
- P20ピペットを使用して、単離された側組織(<2 mL)を20mLのDNA抽出バッファーを含むPCRチューブに移します。
- 手術後の胚を、24-または96ウェルプレートに少なくとも500mLの新鮮な海水を含む井戸に移す。
- 必要に応じて胚の数に対して手順 2.4 ~ 2.8 を繰り返します。
- 手術後の胚を含むウェルプレートを、ジェノタイピングが完了するまで16°CまたはRTのインキュベーターに置きます。
3. ゲノムDNA抽出とジェノタイピングPCR
- DNA抽出バッファーを含むPCRチューブと、ミニ遠心分離機を用いて単離された胚組織を簡単にスピンダウンします(例えば、10sの場合は2,680 x g)。
- 単一胚からゲノムDNAを抽出するには、PCRチューブを30分毎に30時間30°Cで55°Cでインキュベートし、細胞塊の分裂を確実にし、細胞分解を増強します。
- PCRチューブを95°Cで5分間インキュベートし、プロテインナーゼKを不活性化します。
- gDNA抽出物を4°Cまたは氷の上に保管し、直ちにPCRに進みます。
注:プロトコルは、-20 °C冷凍庫にgDNA抽出物を置くことによって、ここで一時停止することができます。 - 抽出されたgDNAをテンプレートとして使用してPCR反応を設定し、目的のゲノム遺伝子座を増幅する。
- 目的の軌跡で異なるアレルがサイズが異なる場合は、アガロースゲル電気泳動によってサイズの違いを検出できるように、遺伝子座全体を増幅するプライマーの単一のセットを設計します。
- あるいは、特定の対立遺伝子の存在下でのみPCR製品を生成する対立遺伝子特異的プライマーを使用する。たとえば、挿入/欠失変異を含む領域に結合するプライマーを設計します。
- 一般的な20mL PCR反応ミックスを使用する:gDNA抽出物5mL、ヌクレルレスフリー水8mL、PCLバッファー4mL、10mM dNTP0.2mL、DMSO0.6mL、1mMフォワードプライマーの1mL、1mLの1mLのリバースプライマー、およびDNAポリメラーゼの0.2 mL(材料の表を参照)。
注:PCR反応に複数のプライマーを使用できます。例えば、1つのユニバーサルフォワードプライマーと2つの対立遺伝子特異的リバースプライマーを組み合わせることができますが、2つの逆プライマーが異なるサイズのPCR製品を生成するように設計されている限り、2つの対立遺伝子の有無が明確に可能になります。ゲル電気泳動によって決定される(代表的な結果セクションを参照)。
- アガロースゲル電気泳動を実行して、PCR製品のサイズと有無を判断します。PCR製品の期待サイズに応じて、アガロースゲル電気泳動の状態(例えば、アガロースゲルのパーセンテージ、V/cm、持続時間)の状態を調整します。
- PCR製品のサイズと有無に関するPCRの結果を使用して、手術後の各胚に遺伝子型を割り当てます。たとえば、異なる対立遺伝子が異なるサイズの PCR 製品を生成することが予想される場合は、サイズ情報を使用して各胚に遺伝子型を割り当てます。対立遺伝子特異的プライマーを使用する場合、PCR産物の有無に関するデータを使用して、各胚に遺伝子型を割り当てる必要があります。
- 遺伝子型に従って胚を並べ替えます。
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Representative Results
ネマトステラゲノムは、神経ペプチドGLWamideの前駆体タンパク質をコードする単一の遺伝子座を有する。この遺伝子座で3つのノックアウト変異体ア列(glw-a、glw-b、およびglw-c)は、以前に5が報告されている。野生型対立遺伝子を運ぶ4人のヘテロザイゴウス雄(+)とGLWamide遺伝子座(遺伝子型:+/glw-c)でノックアウト対立遺伝子glw -cは、野生型の対立遺伝子と異なるノックアウトを運ぶヘテロジゴウスメスと交配された。同じ遺伝子座でアレルglw-a (遺伝子型: +/glw-a)子孫を生成する。子孫には、glw -a/glw -c、+/glw -c、glw-a/+、および +/+の 4 つの可能なジェノタイプがあります。すべての子孫のうち、8つの胚がこの代表的な遺伝子型決定アッセイのためにランダムに選択された。ジェノタイピング PCR の場合、1 つのユニバーサル フォワード プライマーと 2 つの対立遺伝子特異的リバース プライマーが5を設計されました。glw-aに特異的な逆プライマーは挿入変異を含む領域に結合し、PCR産物の期待サイズは151 bpである。glw-cに特異的なリバースプライマーは、挿入および欠失変異の両方を含む領域に結合し、PCR産物の期待サイズは389 bpです。どちらのリバースプライマーも野生型配列に結合できないため、野生型胚からPCR産物は生成されません。図1は、PCRアッセイの代表的な結果を示す。胚1および2は、glw-aの期待されるサイズと一致する単一のPCRバンドを示す。胚3および6は、対減glw-aおよびglw-cの期待されるサイズに対応する2つのPCRバンドを示す。胚4、7、および8は、glw-cの期待されるサイズと一致する単一のPCRバンドを示す。胚5はバンドを示さない、プライマー結合の欠如を示唆する。
gDNA抽出失敗の可能性を排除するために、別のPCRは、予想されるサイズ(1290 bp;)のPCR産物を示した野生型配列に結合することができる逆プライマーを使用して実行された。図2)なお、図2では、サンプルの1つ(*で示す)はPCR産物を示さなかったため、gDNA抽出の失敗を示唆した。
上記の結果に基づいて、各胚の遺伝子型は次のように解釈されます: 胚 1: +/glw-a,胚 2: +/glw-a,胚 3: glw-a/glw-c,胚 4: +/glw-c,胚 5: +/+, 胚 6: glw-a/glw-c,胚 7: +/glw-c,胚 8: +/glw-c.
図1:ジェノタイピングPCRアッセイの代表的な結果。1-8は、F1ヘテロジゴス変異体クロスの子孫の間でランダムにサンプリングされた胚から採取された胚のジェノタイピングPCR結果を表し、1つの+/glw-女性と+/glw-cオスの間にある。 gDNAを胚組織断片から抽出し、PCRテンプレートとして用いた。GLWamide遺伝子座はPCR増幅を対象とし、1つのユニバーサルフォワードプライマーと2つの対立遺伝子特異的リバースプライマーを使用しました(材料表)。glw-aに固有のリバースプライマーは151 bp PCRバンド(1、2、3、6)を生成し、glw-cに固有のリバースプライマーは389 bp PCRバンド(3、4、6、7、8)を生成します。 いずれの逆プライマーも野生型配列に結合できないため、野生型胚からPCR産物は生成されない(5)。1.5%のアガロースゲルを128Vで25分間走らせた。100 bp DNAはしごを使用した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:遺伝子座特異的PCRの代表的な結果は、gDNAの存在を確認した。glw変異対立遺伝子特異的PCR実験でPCR産物を生成できなかった10個のgDNA抽出物(図1('5')から胚5を含む、PCR実験用のPCRテンプレートとして使用した。 ユニバーサルフォワードおよびリバースGLWamide-locus特異的プライマーを使用して、野生型対立遺伝子から1290 bp PCR産物を生成した。10個のDNA抽出物のうち9個(示されたもの*を除く)は、図1('5')から胚5を含む期待サイズのPCRバンドを示した。 これは、胚5からPCR産物を生成できなかったことは、十分なgDNAテンプレートの欠如によるものではないことを示唆している。1.5%のアガロースゲルを128Vで25分間1kbDNAラダーを使用した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、動物を犠牲にすることなく単一の海アネモネ胚を遺伝子型化するPCRベースのプロトコルを説明する。産卵および脱ゼリーに続いて、受精卵はガストラーに発達することを許される。各ガストラ胚の卵巣領域は外科的に除去され、その後のゲノムDNA抽出に単離された卵巣組織が使用され、残りの手術後の胚は治癒し、発達を続ける。次に、gDNA抽出物をPCRアッセイに使用して、各胚の遺伝子型を決定します。この方法は、10、11、および胚の大部分を調節し、開発する海アネモネ胚の経口半分の能力を利用する(>90%)通常、手術を生き残り、適切な培養条件下で正常に発症する。この遺伝子入力アッセイに必要な組織量は、ガストルラ胚全体の半分未満であり、gDNA抽出失敗による陰性の結果はまれです(<5%)。少量の組織のみが必要であることを考えると、この遺伝子型付けアッセイに前ガストラステージ胚を使用する可能性が高い。しかし、これはまだテストされていません。この方法は、動物がアクティブな水泳の段階に達していない限り効率的に行うことができる(すなわち、自由泳ぐプラヌラステージの前)。このジェノタイピング法は、開発中に表現型解析の性能を必要とする場合に特に有利である。
このプロトコルの1つの制限は、スクリーニング可能な胚の数が制限されてもよいことである。特に、卵巣組織の外科的除去は、特に初心者のために、胚当たり1〜2分を要しう場合がある。経験豊富な研究者は、1日に少なくとも80個の胚の遺伝子入力アッセイ全体を完了できるはずですが、数百または数千の胚を含む研究は、1日で完了するには時間がかかりすぎる可能性があります。
研究者はまた、手術後変異体で観察される表現型が、例えば、遺伝子ノックアウトがガストラーの治癒および/または胚調節に及ぼす影響のために、無傷の変異体の表現型と異なる可能性があることに留意する必要があります。この可能性は、手術後変異体に見られる表現型が実際に無傷の変異体で観察可能であるかどうかを調べることによってテストされるべきである。
ジェノタイピングの記述方法には、いくつかの代替方法があります。第一に、ノックアウト変異体で発現が失われたタンパク質に対する抗体を用いた免疫染色は、現像動物の遺伝的に異種集団からノックアウト変異体を同定するために行うことができる。第二に、この目的のためにハイブリダイブ化を用いることができ、リボプローブが変異型mRNAにハイブリダイズしないように設計できる場合。例えば、ノックアウト動物の変異体が遺伝子の同じ領域に大きな欠失変異を運ぶ場合、リボプローブはノックアウト変異体で削除された遺伝子の領域にハイブリダイズするように設計することができる。いずれの場合も、ノックアウト変異体は標識を示さないと予想され、ヘテロジゴウスおよび野生型の個体は標識を示す必要があります。しかし、動物は染色に必要な組織固定のために犠牲にする必要があります。最後に、ノックアウト変異体は、性的成熟に上げられ、子孫を生成するために互いに交差し、そのすべてがノックアウト変異体であるべきであり、発達表現型の分析は、この子孫6を使用して行うことができる。この方法は、ノックアウト動物が生存可能であり、生殖可能であり、したがって、非本質的な遺伝子への応用に限定される必要があります。
記載されたゲノム入力プロトコルは、海アネモネ胚のために設計されていますが、ゲノム情報と胚の両方がアクセス可能な他のクニダリアン(例えば、サンゴ12とクラゲ13)とこの方法を使用することが可能です。胚は外科的除去時に治癒および調節することができる。CRISPR媒介遺伝子改変実験の成功は、サンゴ14およびヒドロゾンクラゲ15、16で既に報告されている。このゲノム入力プロトコルの非海アネモネクニダリアンへの将来の応用は、その発達の遺伝的基礎の研究にとって重要である。これは、今度は、非常に多様なクニダリアン開発の進化に機械的な洞察を得るための鍵となります。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
私たちは、原稿を改善した原稿の以前のバージョンに関するコメントのための匿名のレビュー担当者に感謝します。この研究はアーカンソー大学の資金によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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