Summary
该协议的目标是在胃化过程中基因型海葵奈马托斯特拉静脉曲张,而不牺牲胚胎。
Abstract
这里描述的是基于PCR的协议基因型的胃肠阶段胚胎的蚂蚁阴极内人内马托斯特拉vesisis,而不牺牲动物的生命。在体外受精和脱胶后,酶在室温下发育24小时,达到早至中气期。然后,将胃粒胚胎放在含有海水的培养皿中的甘蔗胶床上。在解剖显微镜下,钨针用于从每个胚胎中手术分离一个腹腔组织片段。手术后胚胎可以愈合并继续发育。基因组DNA从分离的组织片段中提取,并用作位点特异性PCR的模板。基因型可以根据PCR产品的大小或存在/不存在的等位基因特异性PCR产品来确定。手术后胚胎然后根据基因型进行分类。整个基因分型过程的持续时间取决于要筛选的胚胎数量,但它至少需要4~5小时。该方法可用于识别来自基因异质胚胎种群的敲除突变体,并在发育过程中分析表型。
Introduction
仙人掌代表一组不同的动物,包括水母、珊瑚和海葵。它们是二叶虫,由细胞外基质(中细胞体)分离的内皮和内皮组成。Cnidaria是一个姐妹团体,以种像比拉提利亚,传统的动物模型,如果蝇和穆斯属于1。此外,被认为发生在2月2日寒武纪前,Cnidaria-Bilateria发散。因此,对仙人掌和双栖教徒的比较研究对于深入了解他们最近共同祖先的生物学至关重要。最近,比较基因组学显示,仙人掌和双子食者共享许多发育工具包基因,如notch和bHLH,这意味着他们的共同祖先已经拥有这些基因3。然而,这些发育工具包基因在Cnidaria和Bilateria的最后共同祖先中的作用相对而言,还不太了解。为了解决这个问题,研究这些深保守的基因在仙人掌中如何发挥作用是至关重要的。
新兴的仙人掌遗传模型之一是蚂蚁内马托斯特拉的维森斯。其基因组已测序3,各种基因工具,包括形态介导基因敲除,梅甘细胞介导的转基因,CRISPR-Cas9介导基因敲和敲,现在可用于这种动物。此外,内马托斯特拉的发展也相对来说也比较了解。在胚胎生成过程中,胃化发生于阴道4,胚胎发育成自由游泳的平面幼虫。之后,平面图转化为带嘴和圆角触角的环状息肉。息肉然后增长,并达到性成熟。
CRISPR-Cas9介导的靶向诱变现因现在经常用于研究内马托斯特拉维克塞西5、6、7、8、9的基因功能。为了在Nematostella产生敲除突变体,一种含有原点特异性单导RNA和内分酶Cas9蛋白的鸡尾酒首先被注射到未受精或受精的卵子中,以产生通常显示的F0创始人动物马赛克主义。F0动物随后被提升到性成熟,并相互交叉,以产生F1种群,其中一个子集可能是敲除突变体6。或者,性成熟的F0动物可以与野生型动物交叉,以产生F1杂物动物,而F1杂物携带一个敲击等位基因在兴趣点,然后可以交叉彼此产生F2后代,四分之一其中预计将被敲除突变体5。这两种方法都需要一种方法来识别来自基因异质种群的敲除突变体。息触角可用于提取基因组DNA进行基因分型6,7。然而,在研究相关基因的发育功能和突变胚胎未达到息肉阶段的情况下(即,由于与突变相关的幼虫致死性),需要在早期发现敲除突变体。这里描述的是基于PCR的方案基因型个体动物在气态阶段不牺牲动物,这使得识别从基因异质的胚胎种群敲除突变体。整个基因分型过程的持续时间取决于要筛选的胚胎数量,但它至少需要4-5小时。
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Protocol
1. 诱导产卵、体外受精和脱胶
- 在16°C的黑暗中保持海水中每千分之12的盐度(ppt),每天喂食Artemia。
- 在产卵诱导的前一天,将动物置于温控和光控制的培养箱中。对孵化器进行编程,使动物在25°C时暴露在8小时光下。可选:在将一小块牡蛎(<1mm 3)喂给单个动物之前,再将它们放入孵化器,以提高产卵。
- 在16°C下将动物留在孵化器中1小时。
- 将动物从孵化器中取出,放在室温 (RT) 下带光的台面上,以便产卵。生成通常发生在接下来的 1.5–2 小时内。
- 如果雄性与雌性位于单独的容器中,则使用转移移液器将雌性容器中的卵子包裹放入含精子的男性容器中,其尖端被切开以扩大开口,使卵子在转移。让卵子受精,将其留在雄性容器中至少15分钟。
- 在培养皿或15 mL管中,将含有3%半胱氨酸(pH 7.4)的海水中的鸡蛋包装去果冻。轻轻搅拌摇床 12 分钟。
- 使用塑料移液器将团块分解,并继续搅拌 2-3 分钟,直到完全脱胶。
- 用新鲜海水更换介质至少5次,去除半胱氨酸。
- 将受精卵放在16°C或RT的玻璃培养皿上。
2. 手术切除胃肠道胚胎的腹腔组织
- 准备一个由10 mM Tris-HCl (pH 8)、50 mM KCl、1 mM EDTA、0.3% Tween20、0.3% NP40 和 1 mg/mL 蛋白酶 K 组成的 DNA 提取缓冲液。通过涡旋和将缓冲液等分到PCR管中进行良好混合。
- 将1%的甘蔗在海水中溶解,倒入培养皿中,覆盖底部。在台面上冷却,使凝胶床。倒入新鲜的海水,以覆盖培养皿中的凝胶床。
- 将24小时受精后(hpf)胚胎(早至中气期)转移到含有甘蔗胶床的培养皿中。
- 将钨针插入针头支架,通过将针头浸入酒精中(70% 或更高)并将其置于火焰中以烧掉酒精进行消毒。
- 在解剖显微镜下(放大倍率为20倍至40倍),使用钨针在角胶床上制造凹陷,去除一块与要操纵的胚胎大小的表面角胶,并将胚胎侧侧置于凹陷上侧朝下,以限制显微手术胚胎的运动。
- 使用钨针手术切除位于口腔口对面的一块腹腔组织。沿着口腔-腹腔轴的胚胎组织的三分之一到四分之一通常就足够了。
- 使用 P20 移液器将分离的腹腔组织(在 <2 mL 中)转移到含有 20 mL DNA 提取缓冲液的 PCR 管中。
- 将手术后胚胎移植到含有至少500 mL的新鲜海水的孔中,在24或96孔的盘子里。
- 根据需要对胚胎数量重复步骤 2.4_2.8。
- 将含有手术后胚胎的孔板置于16°C或RT的培养箱中,直到基因分型完成。
3. 基因组DNA提取和基因分型PCR
- 使用微型离心机(例如,在 2,680 x g处为 10 s)短暂旋转含有 DNA 提取缓冲液的 PCR 管和分离的胚胎组织。
- 为了从单个胚胎中提取基因组DNA,在55°C下孵育PCR管3小时,涡流每30分钟孵化30秒,以确保细胞团块破裂并增强细胞分解。
- 在95°C孵育PCR管5分钟,使蛋白酶K灭活。
- 将gDNA提取物保持在4°C或冰上,并立即进入PCR。
注: 通过将 gDNA 提取物放入 -20°C 冷冻箱,可以在此处暂停该协议。 - 使用提取的gDNA作为模板建立PCR反应,以放大感兴趣的基因组位点。
- 如果兴趣点处的不同等位基因大小不同,以便通过角胶凝胶电泳检测出大小差异,则设计一组引体来放大整个轨迹。
- 或者,使用仅在存在特定等位基因的情况下生成 PCR 产品的等位基因;例如,通过设计与包含插入/删除突变的区域结合的引体。
- 使用典型的 20 mL PCR 反应混合物如下:5 mL gDNA 提取物、8 mL 无核酸酶水、4 mL PCR 缓冲液、0.2 mL 10m dNTP、0.6 mL DMSO、1 mL 10 mM 正向底漆、1 mL 10 mM 反向底漆和0.2 mL的DNA聚合酶(见材料表)。
注:PCR反应中可使用多引力。例如,可以组合一个通用正向引色和两个等位基因特异性反向引色,只要两个反向引色器设计为生成不同尺寸的PCR产品,以便两个等位基因的存在/不存在可以明确由凝胶电泳确定(参见代表性结果部分)。
- 运行阿加玫瑰凝胶电泳,以确定PCR产品的大小和存在/不存在。根据 PCR 产品的预期尺寸调整腺胶电泳(例如,胶胶百分比、V/cm 和持续时间)的状况。
- 使用PCR关于PCR产品的大小和存在/不存在的结果为每个手术后胚胎分配基因型。例如,如果不同的等位基因需要生成不同大小的PCR产品,请使用大小信息为每个胚胎分配基因型。如果使用等位基因特异性引基,则应使用PCR产物是否存在/不存在的数据为每个胚胎分配基因型。
- 根据基因型对胚胎进行分类。
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Representative Results
涅马托斯特拉基因组有一个单一的位点,编码神经肽GLW酰胺的前体蛋白。三个敲除突变的均位位基因在这个位子(glw-a,glw-b,和glw-c)之前已经报告5。四个携带野生型等位基因 ( + ) 和敲除等位基因的雄性在GLW 酰胺位位 ( 基因型 : + / glw- c) 与携带野生型等位基因和不同敲除的杂音雌叉同一位位点(基因型:+/glw-a)的等位基因glw -a)生成后代。后代中有四种可能的基因型:glw -a/glw-c,[/glw-c],glw -a/+和[/]。在所有的后代中,有8个胚胎被随机选择用于这种具有代表性的基因分型测定。对于基因分型PCR,设计了一个通用正向引基和两个等位基因特异性反向引基5。反引基特定于glw-a结合到包含插入突变的区域,PCR 产品的预期大小为 151 bp。特定于glw-c的反向引基结合到包含插入和删除突变的区域,PCR 产品的预期大小为 389 bp。两种反向引基剂都不能结合到野生型序列中,因此不会从野生型胚胎中产生PCR产物。图 1显示了 PCR 测定的代表性结果。胚胎1和2显示一个PCR带符合glw-a的预期大小。胚胎 3 和 6 显示两个 PCR 波段,对应于等位子glw-a和glw-c的预期大小 。胚胎4、7和8显示一个与glw-c的预期尺寸一致的PCR带。胚胎5没有带,表明缺乏引结结合。
为了排除gDNA提取失败的可能性,另一个PCR使用反向引基,可以结合野生类型序列,显示一个预期大小的PCR产物(1290 bp;图 2.需要注意的是,在图2中,其中一个样本(由*表示)没有显示PCR产物,这表明gDNA提取失败。
根据上述结果,每个胚胎的基因型被解释为:胚胎1:+/glw-a,胚胎2:+/glw-a,胚胎3:glw-a/glw-c,胚胎4:+/glw-c,胚胎5:[/],胚胎6:glw-a/glw-c,胚胎7:+/glw-c,胚胎8:+/glw-c .
图1:基因分型PCR测定的代表性结果。1-8 表示从 F1 异体突变体交叉的后代之间的随机采样胚胎的基基因分型 PCR 结果 -一个 +/glw- 一个雌性和+/glw-c雄性。gDNA从胚胎组织片段中提取,用作PCR模板。GLW酰胺位点用于PCR扩增,使用一种通用正向引物和两个等位基因特异性反向引物(材料表)。特定于glw-a的反向底漆产生 151 bp PCR 频段(1、2、3、6),而特定于glw-c的反向底漆生成 389 bp PCR 频段(3、4、6、7、8)。两种反向引基剂都不能结合到野生型序列,因此不会从野生型胚胎(5)生成PCR产物。1.5% 的甘蔗凝胶在128 V下运行25分钟。使用了100bpDNA梯子。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:代表性结果,以确认存在gDNA。在glw突变等位基因特异性PCR实验中未能生成PCR产物的10种gDNA提取物,包括图1('5')中的胚胎5,被用作图所示PCR实验的PCR模板。 通用正向和反向GLW酰胺-洛位基特引基,用于从野生型等位基因生成1290 bp PCR产物。十分之九的DNA提取物(除所示的dna片段外)显示了预期大小的PCR带,包括图1('5')中的胚胎5。 这表明,未能从胚胎5生成PCR产品不是由于缺乏足够的gDNA模板。1.5%的甘蔗凝胶在128 V下运行25分钟1 kb DNA阶梯。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里描述了一种基于PCR的协议,用于基因型单个海合明胚胎,而不牺牲动物。产卵和脱硫后,受精卵可以发育成胃卵。每个胃肠道胚胎的腹腔区域被手术切除,分离的腹腔组织用于后续基因组DNA提取,而剩余的手术后胚胎愈合并继续发育。然后,gDNA提取物用于PCR测定,以确定每个胚胎的基因型。该方法利用海葵胚胎的口腔半部分调节和发育10,11和大多数胚胎的能力(>90%)通常在手术中存活,并在适当的培养条件下正常发育。这种基因分型测定所需的组织量不到整个胃芽胚胎的一半,而由于gDNA提取失败而导致的阴性结果很少(<5%)。鉴于只需要少量组织,有可能使用前胃分期胚胎进行这种基因分型测定;虽然,这还有待测试。只要动物尚未达到主动游泳阶段(即自由游泳平面阶段之前),这种方法就可以有效地执行。这种基因分型方法在需要开发过程中表型分析性能的情况下特别有利。
该协议的一个限制是,能够筛选的胚胎数量可能有限。特别是,手术切除腹腔组织可能需要每个胚胎一到两分钟,特别是对于未启动的胚胎。有经验的研究人员应该能够每天完成至少80个胚胎的整个基因分型测定,但涉及数百或数千个胚胎的研究可能太耗时,无法在一天内完成。
研究人员还需要注意,术后突变体中观察到的表型可能与完整突变体中的表型不同,例如,由于基因敲除对胃肠道愈合和/或胚胎调节的影响。这种可能性应该通过检查术后突变体中发现的表型在完整的突变体中是否确实可以观察到来测试。
对于所述的基因分型方法,有几种方法可以。首先,用抗体对在敲除突变体中失解的表达进行免疫染色,以识别来自发育中动物的遗传异质种群的敲除突变个体。其次,原位杂交可用于此目的,如果核糖核毒剂可以设计,使其不杂交到突变mRNA。例如,如果敲除动物的突变等位基因在基因的同一区域携带大的缺失突变,则核糖核毒杆菌可以设计为杂交到在敲除突变体中删除的基因区域。在这两种情况下,敲除突变体预期不显示标签,而异体型和野生型个体应显示标签。然而,由于染色所需的组织固定,动物需要被牺牲。最后,敲除突变体可以提升到性成熟,并相互交叉,以产生一个后代,所有这些都应该是敲除突变体,并且发育表型的分析可以使用这个后代6进行。这种方法要求敲除动物是可行和能够繁殖的,因此在应用非必需基因时受到限制。
虽然所述基因分型方案是为海葵胚胎设计的,但只要胚胎在手术切除后能够愈合和调节。成功的CRISPR介导基因修饰实验已经报告在珊瑚14以及水族水母15,16。这种基因分型方案今后在非海葵的遗传基因基质研究方面将具有重要意义。反过来,这将是获得机械见解的关键,对非常多样化的仙人掌发展的演变。
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Disclosures
提交人没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢匿名评论者对手稿的早期版本的评论,该版本改进了手稿。这项工作得到了阿肯色大学的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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