Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.
Abstract
המתואר כאן הוא פרוטוקול ה-PCR כדי גנוטיפ העובר בשלב הגאולה של האנתוזואן לאחר הדלקת הקרום האנוטזיס מבלי להקריב את חיי החיה. בעקבות הפריה חוץ גופית ו-de-jellying, הזיטים מורשים להתפתח 24 שעות בטמפרטורת החדר כדי להגיע לשלב מוקדם עד באמצע הגאולה. העוברים הגאוטרולה מונחים לאחר מכן על מיטת ג'ל בצלחת פטרי המכילה מי ים. תחת מיקרוסקופ מבתר, מחט טונגסטן משמש בניתוח להפריד משבר רקמת הבורג מעובר כל. העוברים לאחר הניתוח מורשים להירפא ולהמשיך בפיתוח. דנ א גנומית מופק מרסיס רקמות מבודדים משמש כתבנית ל-PCR ספציפי לוקוס. ה-גנוטיפ ניתן לקבוע בהתבסס על גודל מוצרי ה-PCR או נוכחות/היעדרות של מוצרי PCR ספציפיים של allele. העוברים לאחר הניתוח ממוינים לאחר מכן לפי ה-גנוטיפ. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים שיוקרנו, אך הדבר מחייב את השעה 4 – 5 h. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות הסתרה מתוך אוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים ומאפשר ניתוח של פנוטיפים במהלך הפיתוח.
Introduction
החברה מייצגת קבוצה מגוונת של בעלי חיים הכוללים מדוזה, אלמוגים וכלניות ים. הם דיפלותקיעות, המורכב מעור ומעור, המופרדים על-ידי מטריצה מיגלנת (מזוגליא). Cנדבך היא קבוצת אחיות לסוגז בילוניה, שאליה מודלים מסורתיים של בעלי חיים כגון דרוסוהילה ומיוז שייכים ל- 1. בנוסף, הסטייה מהקטריה-בילוניה התרחשה בתקופה הקדם-קמברנית2. ככזה, מחקרים השוואתיים של בילנים ובילואים חיוניים לקבלת תובנות לגבי הביולוגיה של הקדמון המשותף העדכני ביותר שלהם. לאחרונה, גנומיקה השוואתית גילה כי הקטנים ו bilaterians חולקים הרבה גנים ערכת הכלים התפתחותיים כגון חריץ ו bhlh, רומז כי אבותינו המשותפים כבר היו אלה גנים3. עם זאת, התפקיד של גנים אלה ההתפתחותית הקדמון המשותף האחרון של Cנדבך ו Bilateria הוא זהובה פחות הבין היטב. כדי לטפל בבעיה זו, חשוב ללמוד כיצד לתפקד הגנים העמוקים הללו בתוך הקטרים.
אחד המודלים הגנטיים המתעוררים . הגנום שלה יש רצף3, ומגוון של כלים גנטיים, כולל שורסטינו-בתיווך גנים הסתרה, meganuclease-תיווך טרנסגנזה, ו CRISPR-Cas9-בתיווך גן knockins ו הסתרה, זמינים כעת לשימוש בחיה זו. בנוסף לכך , התפתחות ההתפתחות של הניפה מובנת באופן יחסי. במהלך הembryogenesis, הגסטרוציה מתרחשת על ידי הגבנות4, והעובר מתפתח לזחל בשחייה חופשית. לאחר מכן, הפלולה הופך לפוליפ סלוח עם פה וזרועות מעומות. הפוליפ גדל ומגיע לבגרות מינית.
Crispr-Cas9-בתיווך מוטגנזה ממוקדת המשמש כעת שימוש באופן שגרתי כדי ללמוד את התפקוד הגנטי בתוך להיות סטלה vectensis5,6,7,8,9. כדי ליצור מוטציות הנוקאאוט ב ne, קוקטייל המכיל לוקוס ספציפי מדריך יחיד rnas ו endonuclease Cas9 חלבון מוזרק תחילה לתוך ביצים לא מופרות או מופרות לייצר חיות מייסד F0 בדרך כלל להראות פסיפס. F0 בעלי חיים מוגשים לאחר מכן לבגרות מינית ועברו אחד עם השני כדי לייצר אוכלוסייה F1, תת קבוצה של אשר עשוי להיות מוטציות הנוקאאוט6. לחילופין, בוגרת מינית בעלי חיים F0 יכול להיות חצה עם חיות מסוג פראי כדי ליצור heterozygous בעלי חיים f1, ו f1 הטרוזיטים כי לשאת את אלל הנוקאאוט בתוך מקום העניין יכול אז להיות חצה אחד עם השני כדי לייצר הצאצאים F2, אחד ברבעון מהם צפויים להיות. מוטציות בנוקאאוט5 שתי הגישות דורשות שיטה לזיהוי מוטציות הסתרה מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית. הפוליפ זרועות ניתן להשתמש כדי לחלץ דנ א גנומית עבור גנוהקלדה6,7. עם זאת, במקרים שבהם הפונקציה ההתפתחותית של גן העניין היא להיחקר ועוברי מוטציה אינם מגיעים לשלב הפוליפ (כלומר, עקב הפרשות הזחל הקשורות למוטציה), יש לזהות מוטציות הסתרה בתחילת האירוע. המתואר כאן הוא פרוטוקול PCR המבוסס על בעלי חיים בודדים בשלב הגסטרולה מבלי להקריב את בעל החיים, אשר מאפשר זיהוי של מוטציות נוקאאוט מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים להיות מוקרן, אבל זה מינימלית דורש 4-5 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אינדוקציה של השאיפה, הפריה חוץ גופית , ו-דה-jellying
- שמירה על שלפוחית הזרע בתוך מי ים עם מליחות של 12 חלקים לאלף (ppt) בחשיכה ב -16 ° c, האכלה artemia מדי יום.
- ביום לפני הבהיית השראה, מניחים בעלי חיים בחממה בטמפרטורה ובשליטה קלה. לתכנת את החממה כך שבעלי החיים ייחשפו ל -8 מעלות של אור ב -25 ° c. אופציונלי: האכילו חתיכה קטנה (< 1 מ"מ3) של צדפה לבעלי חיים בודדים לפני הצבת אותם לתוך החממה כדי לשפר את ההשריץ.
- השאירו את החיות בחממה במשך 1 h ב -16 ° c.
- הסר את בעלי החיים מהאינקובטור והשאר אותם על שחקן ספסל עם אור בטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר השאיפה. ההשמה מתרחשת בדרך כלל בתוך 1.5-2 h הבאה.
- אם הזכרים והנקבות מצויים במכולות שונות, מניחים חבילות ביצים מהמכולה הנשית לתוך מכולה גברית המכילה זרע באמצעות פיפטה העברה שקצהו נחתך כדי להגדיל את הפתח כך שהביצים לא ניזוקו על-ידי לחץ מכני במהלך עברת. לאפשר לביצים להיות מופרות על ידי השארת אותם במיכל זכר לפחות 15 דקות.
- דה-ג'לי חבילות הביצית במי ים המכילים 3% ציסטאין (pH 7.4) על צלחת פטרי או בשפופרת של 15 מ ל. בעדינות מתפרעים על שייקר עבור 12 דקות.
- השתמש בפיפטה פלסטי כדי לפרק את הגושים ולהמשיך להיות מתפרעים לעוד 2-3 דקות עד לחלוטין דה-ג'אליאד.
- להסיר את ציסטאין על ידי החלפת המדיה עם מי ים טריים לפחות 5x.
- שמרו את הביצים המוופרות על צלחת פטרי מזכוכית ב -16 ° c או RT.
2. הסרה כירורגית של רקמת הבורג מעובר הגסטרולה
- להכין מאגר הפקת ה-DNA המורכב של 10 mM טריס-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.3% Tween20, 0.3% NP40, ו 1 מ"ג/mL פרוטטינואז K. שימוש 20 מ ל של מאגר החילוץ לכל העובר. מערבבים היטב על ידי vortexing ו סדרת מחלקים את המאגר לתוך צינורות PCR.
- מתמוסס 1% התעורר במי ים ויוצקים אותו צלחת פטרי כדי לכסות את הקרקעית. מגניב על שחקן ספסל. להכין מיטת ג'ל יוצקים מי ים טריים כדי לכסות את מיטת ג'ל בצלחת פטרי.
- העבר 24 h לאחר הפריה (hpf) עוברים (שלב מוקדם עד באמצע הבמה) לתוך צלחת פטרי המכילה מיטת ג'ל agarose.
- הכנס מחט טונגסטן למחזיק מחט לחטא על ידי לטבול את קצה המחט באלכוהול (70% או יותר) והצבת אותו להבה כדי לשרוף את האלכוהול.
- תחת מיקרוסקופ מבתר (ב 20x כדי 40x ההגדלה), להשתמש במחט טונגסטן כדי לעשות דיכאון על מיטה agarose על ידי הסרת פיסת משטח על גבי גודל של העובר כדי להיות מניפולציות, ומניחים את העובר על הדיכאון עם לרוחב שלה צד כלפי מטה כדי להגביל את תנועת העובר עבור ניתוח מיקרו.
- השתמש במחט טונגסטן כדי בניתוח בוהן פיסת של רקמת הבורג הממוקם מול הפתיחה אוראלי בלייסטופה. בדרך כלל מספיקה הבורג השלישי לרבע של הרקמה העוברה לאורך ציר הפה-הבורג.
- השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר את רקמת הבורג המבודד (ב< 2 מ ל) לצינור PCR המכיל 20 מ ל של מאגר חילוץ DNA.
- להעביר את העובר אחרי הניתוח לתוך היטב המכיל לפחות 500 mL של מי ים טריים בצלחת 24 או 96-באר.
- חזור על שלבים 2.4 – 2.8 עבור מספר העוברים לפי הצורך.
- מניחים את הצלחת היטב המכילה העוברים לאחר הניתוח בחממה ב -16 ° צ' או RT עד השלמת הגנוהקלדה.
3. הוצאת דנ א גנומית ו-PCR הקלדה
- בקצרה לסובב את צינורות ה-PCR המכיל את מאגר החילוץ DNA ורקמות עובריות מבודדים באמצעות מיני צנטריפוגה (למשל ב 2,680 x g עבור 10 s).
- כדי לחלץ דנ א גנומית של עוברים בודדים, מודפת את צינורות ה-PCR ב 55 ° c עבור 3 h. מערבולת עבור 30 כל 30 דקות כדי להבטיח התמוטטות של גושי תאים ולשפר את הליזה תאים.
- מודטה את צינורות ה-PCR ב 95 ° צ' עבור 5 דקות כדי להשבית את האבטחה K.
- לשמור על תמציות gDNA ב 4 ° צ' או על קרח, ומיד להמשיך ל-PCR.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי הצבת תמציות gDNA במקפיא של 20 ° c. - הגדר תגובת PCR באמצעות gDNA חילוץ כתבנית כדי להגביר את מקור גנומית של עניין.
- אם האללים שונים במיקום הריבית שונים בגודלם, כך שהפרש הגודל ניתן לזיהוי על ידי האלקטרופורזה בג ג'ל, עיצוב קבוצה אחת של התחל כדי להגביר את היקום כולו.
- לחילופין, השתמש בצבעי היסוד של allele היוצרים מוצרים PCR רק בנוכחות האלל המסוים; למשל, על ידי עיצוב פריימר הנקשר לאזור המכיל מוטציות הכניסה/מחיקה.
- השתמש ב-20 מ ל התגובה האופיינית ל-PCR כדלקמן: 5 מ ל של תמציות gDNA, 8 מ ל של nuclease-מים ללא תשלום, 4 מ ל של מאגר PCR, 0.2 מ ל של 10mM dNTPs, 0.6 מ ל של DMSO, 1 מ מ של 10 מ"מ בהילוך קדמי, 1 מ ל של 10 מ"מ תחל , ו 0.2 מ ל של דנ א פולימראז (ראה טבלת חומרים).
הערה: ניתן להשתמש בצבעי יסוד מרובים בתגובת PCR. למשל, אחד לשלב הקדמי האוניברסלי ושני התחל הפוך הספציפי האחרון ניתן לשלב, כל עוד שני התחל לאחור נועדו לייצר מוצרים PCR בגדלים שונים, כך הנוכחות/העדר של שני האללים יכול להיות חד משמעית שנקבע על ידי ג'ל אלקטרופורזה (ראה סעיף תוצאות מייצג).
- הפעל אלקטרופורזה בג ג'ל כדי לקבוע את הגודל והנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR. כוונן את מצבם של האלקטרופורזה בג ג'ל (למשל, אחוז ג'ל מעלה, V/cm ומשך) בהתאם לגודל הצפוי של מוצרי ה-PCR.
- השתמש בתוצאות מ-PCR לגבי הגודל והנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר שלאחר ניתוח. לדוגמה, אם האללים שונים צפויים ליצור מוצרי PCR בגדלים שונים, השתמש בנתוני הגודל כדי להקצות את ה-גנוטיפ עבור כל עובר. אם נעשה שימוש בצבעי היסוד הספציפיים של allele, יש להשתמש בנתונים בנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר.
- מיון עוברים לפי גנוטיפ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגנום Ne, סטלה יש לוקוס יחיד המקודד חלבון מקודמן עבור GLWamide נוירופפטיד. שלוש הנוקאאוט של המוטציות בלוקוס זה (glw-a, glw-b, ו -glw-c) דווחו בעבר5. ארבעה זכרים heterozygous נושאת אלל פראי (+) ו הנוקאאוט אלל glw-cב glwamide לוקוס (גנוטיפ: +/glw-c) נחצה עם נקבה heterozygous נושאת אלל פראי ונוקאאוט שונים אלל glw-a באותו לוקוס (גנוטיפ: +/glw-a) כדי ליצור צאצאים. ישנם ארבעה גנוטיפים אפשריים בצאצאי: glw-a/glw-c, +/glw-c, glw-a/+, ו +/+. מתוך כל הצאצאים, שמונה עוברים נבחרו באופן אקראי עבור שיטת הקלדה של נציג זה. עבור ה-PCR המקליד, האחד הקדמי האוניברסלי הראשון ושני התחל הפוכה ספציפי allele עוצבו5. פריימר הפוך ספציפי glw-a נקשר לאזור המכיל מוטציות הכניסה, ואת הגודל הצפוי של מוצר ה-PCR הוא 151 bp. פריימר הפוכה ספציפי glw-c נקשר לאזור המכיל הן מוטציות הכניסה והמחיקה, ואת הגודל הצפוי של המוצר PCR הוא 389 bp. ההילוך ההפוך לא יכול לאגד את הרצף פראי, ולכן לא מוצרי ה-PCR ייווצרו העוברים סוג פראי. איור 1 מציג תוצאה מייצגת של שיטת ה-PCR. עוברים 1 ו-2 מראים להקת PCR אחת התואמת לגודל הצפוי של glw-a. עוברים 3 ו-6 מראים שתי להקות PCR המתאימות למידות הצפויות עבור אללים glw-aו- glw-c. עוברים 4, 7, ו 8 להראות הלהקה PCR אחד תואם את הגודל הצפוי של glw-c. עובר 5 לא מראה להקות, מציע את חוסר הכריכה הפריימר.
כדי לשלול את האפשרות של כשל בחילוץ gDNA, PCR נוסף הופעל באמצעות פריימר הפוך שיכול לאגד את הרצף סוג פראי, אשר הראה מוצר PCR של גודל צפוי (1290 bp; איור 2). יצוין כי באיור 2, אחד הדגימות (המצוין על ידי *) לא הראה מוצרי PCR, מציע כישלון בחילוץ gdna.
בהתבסס על התוצאות הנ ל, גנוטיפ של כל עובר מפורש להיות כדלקמן: העובר 1: +/glw-a, העובר 2: +/glw-a, העובר 3: glw-a/glw-c, העובר 4: +/glw-c, העובר 5: +/+, העובר 6: glw-a/glw-c, העובר 7: +/glw-c, ואת העובר 8: +/glw-c.
איור 1: תוצאות הנציג של שיטת ה-PCR המהווה הקלדה. 1-8 מייצגים את התוצאות ה-PCR של הגנואיות מעוברים שנדגמו באקראי בקרב צאצאי הצלב heterozygous מוטציה F1 בין אחד +/glw- נקבה ו +/glw-cזכרים. gDNA הופק מרסיס רקמה עובריים משמש תבנית ה-PCR. לוקוס GLWamide היה ממוקד עבור הגברה ה-PCR, ו אחד הקדמי האוניברסלי קדימה ושתי כללי הפוכה ספציפיים allele שימשו (טבלת חומרים). פריימר הפוכה ספציפי glw-a מחולל 151 bp הלהקה להקה (1, 2, 3, 6), בעוד פריימר הפוכה ספציפי glw-c יוצר להקה 389 bp-PCR (3, 4, 6, 7, 8). ההילוך ההפוך לא יכול לאגד את הרצף הפראי, ולכן לא מוצרי ה-PCR ייווצרו מעוברים סוג פראי (5). 1.5% agarose ג'ל הופעל ב 128 V במשך 25 דקות. שימוש בסולם דנ א של 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות הנציג של ה-PCR הספציפי לוקוס כדי לאשר נוכחות של gDNA. עשרה תמציות gDNA שנכשלו לייצר מוצרים PCR בניסויים ה-PCR הספציפי ל- glw , כולל העובר 5 מתוך איור 1 (' 5 '), שימשו כתבניות pcr עבור הניסוי ה-pcr המוצג. אוניברסלי והפוך GLWamide-לוקוס ספציפי התחל שימשו כדי ליצור מוצר 1290 מסוג PCR bp של הקלד פראי allele. תשעה מתוך עשרה תמציות DNA (מלבד האחד שצוין *) הראה להקה PCR בגודל צפוי, כולל העובר 5 מתוך איור 1 (' 5 '). הדבר מצביע על כך שכישלון בהפקת מוצרי PCR מהעובר 5 לא היה נובע מהעדר תבנית gDNA מספקת. 1.5% agarose ג'ל הופעל ב 128 V עבור 25 מינימום 1 kb סולם DNA שימש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתואר כאן פרוטוקול PCR על מנת גנוטיפ בודד העובר כלנית ים מבלי להקריב את החיה. הביצים המוופרות מורשות להתפתח בעקבות ההשאיפה והדה-מיולים. האזור הבורג של העובר כל גאורולה הוא הוסר בניתוח, ואת רקמת הבורג המבודד משמש להפקת DNA הבאים גנומית, בעוד העוברים שלאחר ניתוח שנותרו לרפא ולהמשיך בפיתוח. תמציות ה-Dna משמשות לצורך שיטת PCR כדי לקבוע את ה-גנוטיפ של כל עובר. שיטה זו מנצלת את היכולת של החצאים אוראלי של העובר כלנית הים לווסת ולפתח10,11, ואת רוב העוברים (> 90%) בדרך כלל לשרוד את הניתוח ולהתפתח כרגיל תחת תנאי התרבות המתאימים. כמות הרקמה הנדרשת לצורך שיטת הקלדה זו היא פחות ממחצית העובר gastrula ותוצאות שליליות עקב כישלון החילוץ gDNA הם נדירים (< 5%). בהינתן כי רק כמות קטנה של רקמות הוא הכרחי, סביר להניח שניתן להשתמש עוברי הבמה לפני gastrula זה שיטת הקלדה. למרות זאת, הדבר טרם נבדק. ניתן לבצע שיטה זו ביעילות כל עוד החיה לא הגיעה לשלב של שחייה פעילה (כלומר, לפני שלב השחייה החופשי של המטוס). שיטת הקלדה זו מהווה יתרון במיוחד במקרים המחייבים ביצועים של מניתוחי פנוטיפ במהלך הפיתוח.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא שמספר העוברים הניתנים להקרנה עשוי להיות מוגבל. במיוחד, הסרה כירורגית של רקמת הבורג יכולה להימשך אחת עד שתי דקות לעובר, במיוחד עבור הבלתי מפותחים. חוקר מנוסה צריך להיות מסוגל להשלים את שיטת הקלדה כולה עבור לפחות 80 עוברים ליום, אבל מחקרים מעורבים מאות או אלפי עוברים צפויים זמן רב מדי כדי להשלים ביום אחד.
החוקרים גם צריכים להיות מודעים לכך שהפנוטיפים במוטציות שלאחר הניתוח עשויים להיות שונים מזה שבמוטציות שלמים, למשל, בשל השפעת נוקאאוט גנטי בריפוי ו/או ברגולציה מעובריים. אפשרות זו צריכה להיבדק על ידי בחינת האם הפנוטיפ שנמצא במוטציות שלאחר הניתוח הוא אכן נצפה במוטציות שלמות.
קיימות מספר גישות חלופיות לשיטה המתוארת של הגנוטיפים. ראשית, הזדהות חיסונית עם נוגדן נגד חלבון שהביטוי אובד במוטציות הסתרה ניתן לבצע כדי לזהות אנשים מוטנטים מוטציה מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית של חיות מתפתחות. שנית, באתרו היברידיזציה ניתן להשתמש למטרה זו, אם הגלימה יכול להיות מעוצב כך שהוא לא hybridize ל-mrnas מוטציה. למשל, אם המוטציות של בעלי חיים מסוימים מבצעים מוטציות מחיקה גדולות באותו אזור של הגן, הגלימה יכול להיות מיועד לhybridize לאזור הגן נמחק במוטציות הנוקאאוט. בשני המקרים, מוטציות הנוקאאוט צפויים להראות שום תיוג, בעוד heterozygous ומסוג פראי אנשים צריכים להראות תיוג. עם זאת, בעלי החיים יצטרכו להיות הוקרב עקב קיבעון רקמה נדרש עבור ההכתמים. לבסוף, מוטציות הנוקאאוט יכול להיות גדל לבגרות מינית וחצה אחד עם השני כדי ליצור צאצאים, כולם צריכים להיות מוטציות נוקאאוט, וניתוחים של פנוטיפים התפתחותיים ניתן לבצע באמצעות צאצא זה6. שיטה זו דורשת כי בעלי חיים הנוקאאוט הם קיימא ומסוגלים רבייה ולכן מוגבל ביישום שלה גנים לא חיוניים.
למרות שפרוטוקול ה-גנוקליד המתואר מיועד לעוברי כלנית בים, ניתן להשתמש בשיטה זו עם משתמשים אחרים שבהם מידע גנומי והעוברים נגישים (למשל, אלמוגים12 ומדוזה13), כל עוד העוברים מסוגלים לריפוי ורגולציה על ידי הסרה כירורגית. שינוי מוצלח crispr בתיווך גן ניסויים כבר דווחו באלמוגים14 , כמו גם הידרוזוגן מדוזה15,16. היישומים העתידיים של פרוטוקול ההקלדה הזאת לגבי כלנית לא-ימית יהיו חשובים למחקרים של הבסיס הגנטי של התפתחותם. זה, בתורו, יהיה המפתח כדי לצבור תובנות מכניסטיות לתוך האבולוציה של התפתחות מגוונת במידה ניכרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. לסופר אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לסוקרים אנונימיים על הערות על הגרסה המוקדמת של כתב היד, ששיפרו את כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת ארקנסו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
