Summary
이 프로토콜의 목표는 배아를 희생하지 않고 위도 동안 말미잘 성충을 유전자 형화하는것입니다.
Abstract
여기서 설명된 PCR-기반 프로토콜은 동물의 생명을 희생시키지 않고 안토조안 성충성 네마토스텔라 의 기압기 배아를 유전자형화한다. 체외 수정 및 탈 젤리에 이어, zygotes는 초기 - 중간 gastrula 단계에 도달하기 위해 실온에서 24 시간 동안 개발할 수 있습니다. 가스트룰라 배아는 다음 해수를 포함하는 페트리 접시에 아가로즈 젤 침대에 배치됩니다. 해부 현미경의 밑에, 텅스텐 바늘은 외과로 각 태아에서 aboral 조직 단편을 분리하기 위하여 이용됩니다. 수술 후 배아는 치유하고 개발을 계속할 수 있습니다. 게놈 DNA는 단리된 조직 단편으로부터 추출되고 궤적 특이적 PCR에 대한 템플릿으로서 사용된다. 유전자형은 PCR 제품의 크기 또는 대문자 특정 PCR 제품의 유무에 따라 결정될 수 있습니다. 수술 후 배아는 유전자형에 따라 분류됩니다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다. 이 방법은 배아의 유전이 종족적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하고 발달 도중 표현형의 분석을 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
Cnidarians는 해파리, 산호 및 바다 말미잘을 포함하는 동물의 다양한 그룹을 나타냅니다. 그(것)들은 세포외 매트릭스 (mesoglea)에 의해 분리되는 외엽과 내배엽으로 구성된 diploblasts입니다. Cnidaria는 초파리와 무스와 같은 전통적인 동물 모델이 1에 속하는 Bilateria를추측하는 자매 그룹입니다. 또한, Cnidaria-Bilateria 발산은 캄브리아기 이전 기간에 발생 한 것으로 생각된다2. 이와 같이, cnidarians와 양자학자의 비교 연구는 그들의 가장 최근의 일반적인 조상의 생물학에 대한 통찰력을 얻기 를 위해 필수적입니다. 최근, 비교 유전체학은 cnidarians와 양자학자가 노치와 bHLH와 같은 많은 발달 툴킷 유전자를 공유한다는 것을 밝혔습니다, 그들의 일반적인 조상이 이미 이 유전자3가 있었다는 것을 암시하. 그러나, Cnidaria와 Bilateria의 마지막 일반적인 조상에 있는 이 발달 공구 키트 유전자의 역할은 비교적 적게 잘 이해됩니다. 이 문제를 해결하기 위하여는, 이 깊이 보존한 유전자가 cnidarians에 있는 어떻게 작동하는지 공부하는 것이 중요합니다.
신흥 세포주의 유전 모델 중 하나는 안토조안 네마토스텔라 정맥학입니다. 그것의 게놈은3,및 모폴리노 매개 유전자 녹다운, meganuclease 중재한 기형성, 및 CRISPR-Cas9 중재한 유전자 녹진 및 녹아웃을 포함하여 다양한 유전 공구가 지금 이 동물에서 유효하게 유효합니다. 또한, 네마토스텔라 개발은 비교적 잘 이해된다. 배아 발생 시, 위분은 질4에 의해 발생하며, 배아는 자유 수영 플라눌라 유충으로 발전합니다. 플래눌라는 이후 입과 경부 촉수와 sessile 폴리페로 변환합니다. 용종은 성장하고 성숙에 도달합니다.
CRISPR-Cas9 매개 표적 돌연변이 발생은 이제 일상적으로 Nematostella 정맥염5,6,7,8,9에서 유전자 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Nematostella에서녹아웃 돌연변이를 생성하기 위해, 궤적 특이적 단일 가이드 RNA와 endonuclease Cas9 단백질을 포함하는 칵테일은 먼저 일반적으로 보여주는 F0 창시자 동물을 생산하기 위해 비옥한 또는 기름지게 한 계란에 주입됩니다. 모자이크. F0 동물은 이후에 성숙도에 제기되고 F1 집단을 생성하기 위해 서로 교차되고, 그중 부분 집합은 녹아웃 돌연변이체일 수 있다 6. 또는, 성적으로 성숙한 F0 동물은 F1 이형 동물을 생성하기 위해 야생 형 동물과 교차 할 수 있으며, 관심의 궤적에 녹아웃 대립 유전자를 운반하는 F1 이형은 F2 자손을 생산하기 위해 서로 교차 할 수 있습니다, 1 분기 그 중 녹아웃 돌연변이 가 될 것으로 예상된다5. 두 접근은 유전으로 이질적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하는 방법을 요구합니다. 폴립 촉수는 6,7. 그러나 관심 있는 유전자의 발달 기능이 조사되고 돌연변이 배아가 폴립 단계에 도달하지 않는 경우(즉, 돌연변이와 관련된 애벌레 치사성으로 인해), 녹아웃 돌연변이는 초기에 확인되어야 합니다. 여기에 설명된 PCR 기반 프로토콜은 동물을 희생시키지 않고 가스트루라 단계에서 개별 동물을 유전자형으로 하는 것으로, 이는 배아의 유전적 이질적인 집단으로부터 녹아웃 돌연변이체의 식별을 가능하게 한다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다.
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Protocol
1. 산란 유도, 체외 수정 및 탈 젤리
- 16 °C에서 어둠 속에서 천 (ppt)당 12 부분의 염분으로 바닷물에 Nematostella 정맥스텐시스를 유지, 매일 아르테미아를 공급.
- 산란 유도 전날, 동물을 온도 및 조명 제어 인큐베이터에 놓습니다. 인큐베이터를 프로그래밍하여 동물이 25°C에서 8시간의 빛에 노출되도록 합니다. 선택 사항: 굴의 작은 조각(&1 mm 3)을 개별 동물에게 먹이고 산란을 향상시키기 위해 인큐베이터에 넣습니다.
- 동물을 16°C에서 1시간 동안 인큐베이터에 둡니다.
- 인큐베이터에서 동물을 제거하고 산란을 허용하기 위해 실온 (RT)에서 빛벤치 위에 둡니다. 산란은 일반적으로 다음 1.5-2 시간 안에 발생합니다.
- 수컷과 암컷이 별도의 용기에 있는 경우, 여성 용기의 달걀 패키지를 정자가 들어있는 남성 용기에 넣고, 팁이 절단된 이송 피펫을 사용하여 개구부를 확대하여 계란이 기계적 스트레스로 손상되지 않도록 합니다. 전송. 계란을 적어도 15 분 동안 남성 용기에 두어 기름지게하십시오.
- 3% 시스테인 (pH 7.4)을 함유 한 바닷물에 달걀 패키지를 페트리 접시 또는 15 mL 튜브에 담는다. 12분 동안 셰이커에서 부드럽게 교반합니다.
- 플라스틱 피펫을 사용하여 덩어리를 부수고 완전히 젤리가 제거 될 때까지 2-3 분 동안 계속 교반하십시오.
- 미디어를 신선한 바닷물로 적어도 5배 이상 교체하여 시스테인을 제거합니다.
- 16 °C 또는 RT에서 유리 페트리 접시에 기름지게 한 계란을 유지합니다.
2. 가스트룰라 배아에서 압제 조직의 외과 적 제거
- 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.3% Tween20, 0.3% NP40 및 1 mg/mL 단백질화 K. 배아당 추출 완충액의 20 mL로 구성된 DNA 추출 완충액을 준비한다. 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 PCR 튜브에 버퍼를 aliquot.
- 바닷물에 1% 아가로즈를 녹여 페트리 접시에 붓고 바닥을 덮습니다. 벤치탑에서 식혀 젤 침대를 만드세요. 페트리 접시에 젤 침대를 덮기 위해 신선한 바닷물을 붓습니다.
- 24 시간 후 수정 후 (hpf) 배아 (초기- 중간 가스 트루라 단계)를 아가로즈 젤 베드를 함유하는 페트리 접시에 옮니다.
- 텅스텐 바늘을 바늘 홀더에 삽입하고 바늘 팁을 알코올 (70 % 이상)에 담그고 화염에 넣어 알코올을 태워 살균하십시오.
- 해부 현미경 (20x에서 40 x 배율)에서, 조작 할 배아의 크기에 대한 표면 아가로즈의 조각을 제거하여 아가로즈 침대에 우울증을 만들기 위해 텅스텐 바늘을 사용하고, 그 측면과 우울증에 배아를 배치 미세 수술을 위해 배아의 움직임을 제한하기 위해 아래를 향하게합니다.
- 텅스텐 바늘을 사용하여 구강 블라소랄 개구부 맞은편에 위치한 복부 조직의 조각을 외과적으로 절제하십시오. 경구-아포랄 축을 따라 배아 조직의 1/3 내지 1/4이 일반적으로 충분합니다.
- P20 피펫을 사용하여 분리된 아포랄 조직(<2 mL)을 DNA 추출 완충제 20 mL를 함유하는 PCR 튜브로 옮긴다.
- 수술 후 배아를 24- 또는 96 웰 플레이트에 담수 500 mL 이상을 함유하는 우물로 옮김을 옮김.
- 필요에 따라 배아 수에 대해 2.4-2.8단계를 반복합니다.
- 수술 후 배아를 함유하는 웰 플레이트를 16°C 또는 RT에서 인큐베이터에 놓고, 지질형 분석이 완료될 때까지.
3. 유전체 DNA 추출 및 게놈 PCR
- 미니 원심분리기를 사용하여 DNA 추출 완충액 및 단리된 배아 조직을 포함하는 PCR 튜브를 간단히 스핀다운합니다(예: 10초 동안 2,680 x g).
- 단일 배아에서 게놈 DNA를 추출하려면 세포 덩어리의 분해를 보장하고 세포 용해를 향상시키기 위해 30 분마다 30 초 동안 55 °C에서 PCR 튜브를 30 초 동안 배양하십시오.
- PCR 튜브를 95°C에서 5분 동안 배양하여 단백질화 K를 비활성화합니다.
- gDNA 추출물을 4°C 또는 얼음 위에 보관하고 즉시 PCR로 진행하십시오.
참고: gDNA 추출물을 -20°C 냉동고에 배치하여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 추출된 gDNA를 템플릿으로 사용하여 관심 있는 게놈 궤적을 증폭시키는 PCR 반응을 설정합니다.
- 관심 궤적에서 다른 알레임이 크기가 다른 경우 agarose 젤 전기 동아에 의해 크기 차이를 검출 할 수 있도록, 전체 궤적을 증폭하는 프라이머의 단일 세트를 설계.
- 대안적으로, 특정 대열의 존재 에서만 PCR 제품을 생성하는 대열제 특이적 프라이머를 사용; 예를 들어 삽입/삭제 돌연변이를 포함하는 영역에 결합하는 프라이머를 설계합니다.
- 다음과 같이 일반적인 20 mL PCR 반응 믹스를 사용: gDNA 추출의 5 mL, 8 mL의 뉴클레아제 없는 물, 4 mL의 PCR 버퍼, 0.2 mL의 10mMdNTPs의, DMSO의 0.6 mL, 10 mMM 의 1 mL, 1mL의 1 mL의 10 mMM 리버스 프라이머 및 0.2 mL의 DNA 폴리머라제(물질 표참조).
참고: PCR 반응에 여러 프라이머를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 두 개의 역프라이머가 두 개의 대열의 존재/부재를 명확하게 할 수 있도록 두 개의 리버스 프라이머가 뚜렷한 크기의 PCR 제품을 생성하도록 설계된 한 하나의 범용 전방 프라이머와 두 개의 대열레 전용 역프라이머를 결합할 수 있습니다. 겔 전기 동에 의해 결정됩니다 (대표 결과 섹션 참조).
- 아가로즈 젤 전기 동동을 실행하여 PCR 제품의 크기와 유무를 결정합니다. PCR 제품의 예상 크기에 따라 아가로즈 겔 전기 동거의 상태(예: 아가로즈 겔 백분율, V/cm 및 지속 시간)의 상태를 조정합니다.
- PCR 제품의 크기 및 존재/부재에 관한 PCR의 결과를 사용하여 각 수술 후 배아에 유전자형을 할당합니다. 예를 들어, 다른 대문자가 서로 다른 크기의 PCR 제품을 생성할 것으로 예상되는 경우 크기 정보를 사용하여 각 배아에 대한 유전자형을 할당합니다. 알렘 특이적 프라이머를 사용하는 경우, PCR 제품의 존재/부재에 대한 데이터를 사용하여 각 배아에 유전자형을 할당해야 합니다.
- 유전자형에 따라 배아를 분류합니다.
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Representative Results
Nematostella 게놈은 neuropeptide GLWamide를 위한 전구체 단백질을 암호화하는 단 하나 궤적이 있습니다. 이 궤적에서 세 개의 녹아웃 돌연변이 대엽(glw-a,glw-b및 glw-c)은이전에5. GLWamide 궤적에서 야생 형 알레르 (+)와 녹아웃 알레이 glw-c를운반하는 4 명의 이형 남성 (유전자 형 : +/ glw-c)은야생 형 알레르와 다른 녹아웃을 운반하는 이형 지푸스 암컷과 교차했습니다. 동일한 궤적에서 -a 를 골자(유전자형: +/glw-a)로하여 자손을 생성한다. 자손에는 4가지 가능한 유전자형이 있습니다: glw-a/glw-c, +/glw-c,glw-a/+, 및 +/+. 모든 자손 중에서, 8개의 배아는 이 대표적인 유전자형 분석사를 위해 무작위로 선택되었다. 지질형 PCR의 경우 범용 전방 프라이머 1개와 알레일 전용역프라이머 2개가 5개 설계되었다. glw-a에 특이적인 역프라이머는 삽입 돌연변이를 포함하는 영역에 결합하고, PCR 생성물의 예상 크기는 151 bp이다. glw-c에 특이적인 역프라이머는 삽입 및 결실 돌연변이를 모두 포함하는 영역에 결합하고, PCR 생성물의 예상 크기는 389 bp이다. 어느 역프라이머도 야생형 서열에 결합할 수 없으며, 따라서 야생형 배아로부터 PCR 제품이 생성되지 않습니다. 도 1은 PCR 분석법의 대표적인 결과를 나타낸다. 배아 1 및 2는 glw-a의 예상 크기와 일치하는 단일 PCR 대역을 보여줍니다. 배아 3 및 6은 두 개의 PCR 대역이 골조 glw-a및 glw-c에대한 예상 크기에 해당하는 것을 보여줍니다. 배아 4, 7, 및 8은 glw-c의 예상 크기와 일치하는 단일 PCR 대역을 보여준다. 배아 5는 프라이머 결합의 부족을 시사하는 밴드를 나타내지 않는다.
gDNA 추출 실패가능성을 배제하기 위해, 또 다른 PCR은 야생형 서열에 결합할 수 있는 역프라이머를 사용하여 실행되었고, 이는 예상 크기(1290 bp)의 PCR 생성을 나타냈다; 그림2). 그림2에서 샘플 중 하나(*로 표시)는 PCR 제품이 나타나지 않았으며 gDNA 추출에 실패를 시사합니다.
위의 결과에 따라, 각 배아의 유전자형은 다음과 같이 해석됩니다: 배아 1: +/glw-a, 배아 2: +/glw-a,배아 3: glw-a/glw-c,배아 4: +/glw-c 배아 5 : +/+, 배아 6 : glw-a/glw-c, 배아 7 : +/ glw-c, 및 배아 8 : +/glw-c.
도 1: 지질형 PCR 분석법의 대표적인 결과. 1-8은 F1 이종 돌연변이 체종 중 에서 무작위로 샘플링된 배아에서 1 +/glw-a 암컷 및 +/glw-c수컷 사이의 유전자형 검사 PCR 결과를 나타낸다. gDNA는 배아 조직 단편으로부터 추출되어 PCR 템플릿으로 사용되었다. GLWamide 궤적 PCR 증폭을 대상으로 하고, 1개의 범용 전방 프라이머와 2개의 알레일 특이적 역프라이머(표오브 머티리얼)를사용하였다. glw-a에 특이적인 역프라이머는 151 bp PCR 대역(1, 2, 3, 6)을 생성하는 반면, glw-c에 특이적인 역프라이머는 389 bp PCR 대역(3, 4, 6, 7, 8)을 생성한다. 어느 역프라이머도 야생형 서열에 결합할 수 없으며, 따라서 야생형 배아(5)로부터 PCR 생성물이 생성되지 않는다. 1.5% 아가로즈 겔은 25분 동안 128V에서 실행되었다. 100 bp DNA 사다리를 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: gDNA의 존재를 확인하기 위해 궤적 특이적 PCR의 대표적인 결과. 그림 1('5')에서 배아 5를 포함하여 glw 돌연변이 대일 특이적 PCR 실험에서 PCR 제품을 생성하지 못한 10개의 gDNA 추출물을 PCR 실험을 위한 PCR 템플릿으로 사용하였다. 범용 전진 및 역방향 GLWamide-locus-특이적 프라이머를 사용하여 야생형 알레일로부터 1290 bp PCR 생성제품을 생성했습니다. 10개의 DNA 추출물 중 9개(표시된 추출물 을 제외하고*)는 도 1('5')에서 배아 5를 포함한 예상 크기의 PCR 대역을 보였다. 이는 배아 5로부터 PCR 생성 실패가 충분한 gDNA 템플릿의 부족 때문이 아님을 시사한다. 1.5% 아가로즈 겔을 128 V에서 25분 동안 1kb DNA 사다리로 실행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 동물을 희생시키지 않고 단일 말미잘 배아를 유전자형화하는 PCR 기반 프로토콜을 기술한다. 산란 과 탈 젤리 다음, 수정된 계란은 gastrulae로 발전하는 것을 허용됩니다. 각 gastrula 배아의 복부 영역은 외과적으로 제거되고, 분리된 아포랄 조직은 후속 게놈 DNA 추출을 위해 사용되며, 나머지 수술 후 배아는 치유되고 개발을 계속한다. gDNA 추출물은 각 배아의 유전자형을 결정하기 위해 PCR 분석에 사용됩니다. 이 방법은 10,11,및 배아의 대다수 (>90%)를 조절하고 개발하는 말미잘 배아의 경구 반쪽의 능력을 이용합니다 일반적으로 수술을 생존하고 적절한 문화 조건하에서 정상적으로 개발. 이 게노티핑 분석에 필요한 조직 양은 전체 가스트룰라 배아의 절반 미만이며, gDNA 추출 실패로 인한 부정적인 결과는 드물다(&5%). 소량의 조직만 이 것을 감안할 때, 이 게노티핑 분석에 대한 프리 가스트루라 단계 배아를 사용할 가능성이 있다; 하지만, 이것은 아직 테스트. 이 방법은 동물이 활성 수영 단계에 도달하지 않는 한 효율적으로 수행 할 수 있습니다 (즉, 자유 수영 플라눌라 단계 전에). 이 유전자 형 화 방법은 개발 중에 표현형 분석의 성능을 필요로하는 경우에 특히 유리하다.
이 프로토콜의 한 가지 제한은 스크리킹할 수 있는 배아의 수가 제한될 수 있다는 것이다. 특히, 복부 조직의 외과 적 제거는 배아 당 1 ~ 2 분, 특히 미숙한 사람들을 위해 걸릴 수 있습니다. 숙련된 연구원은 하루에 적어도 80개의 배아에 대한 전체 지질분석결과를 완료할 수 있어야 하지만, 수백 또는 수천 개의 배아를 수반하는 연구는 하루에 완료하기에는 너무 많은 시간이 소요될 가능성이 높습니다.
연구원은 또한 수술 후 돌연변이체에서 관찰된 표현형이 그대로 돌연변이체에서 그것과 다를 수 있다는 것을 염두에 두어야 합니다, 예를 들면, gastrulae에 있는 치유 및/또는 배아 규칙에 유전자 녹아웃의 효력 때문에. 이 가능성은 수술 후 돌연변이체에서 찾아낸 표현형이 손상되지 않은 돌연변이체에서 실제로 관찰가능한지 여부를 검사하여 시험되어야 합니다.
설명된 방법인 지질형 에 대한 몇 가지 대안접근법이 있다. 첫째, 녹아웃 돌연변이체에서 발현이 손실된 단백질에 대하여 항체로 면역염색을 수행하여 개발 동물의 유전적으로 이질적인 집단으로부터 녹아웃 돌연변이 개인을 식별할 수 있다. 둘째, 이니지 혼성화에서 리보프로브가 돌연변이 mRNA로 혼성화되지 않도록 설계될 수 있다면, 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 녹아웃 동물의 돌연변이 대열유전자가 유전자의 동일한 영역에서 큰 결실 돌연변이를 운반하는 경우, 리보프로브는 녹아웃 돌연변이체에서 삭제된 유전자의 영역으로 혼성화되도록 설계될 수 있다. 두 경우 모두, 녹아웃 돌연변이는 라벨을 표시하지 않을 것으로 예상된다, 이형 및 야생 형 개인은 라벨을 표시해야하는 동안. 그러나, 동물은 염색에 필요한 조직 고정으로 인해 희생될 필요가 있을 것이다. 마지막으로, 녹아웃 돌연변이체는 성숙도에 제기되고 자손을 생성하기 위해 서로 교차 될 수 있으며, 모두는 녹아웃 돌연변이가되어야하며, 발달 표현형의분석은이 자손을 사용하여 수행 될 수있다 6. 이 방법은 녹아웃 동물이 생존 가능하고 번식 할 수 있어야하며 따라서 필수적이지 않은 유전자에 대한 적용이 제한됩니다.
기재된 지질형 프로토콜은 말미잘 배아를 위해 설계되었지만, 게놈 정보와 배아 모두에 접근할 수 있는 다른 cnidarians(예: 산호12 및 해파리13)와함께 이 방법을 사용할 수 있습니다. 배아는 외과 적 제거 시 치유 및 조절 할 수 있습니다. CRISPR 매개 유전자 변형 실험은 이미산호14뿐만 아니라 하이드로조안 해파리15,16에서보고되었다. 비 바다 말미잘 cnidarians에 이 유전형 질체형 프로토콜의 미래 응용은 그들의 발달의 유전 기초의 연구 결과를 위해 중요할 것입니다. 이것은, 차례로, 현저하게 다양한 cnidarian 발달의 진화에 기계론적 통찰력을 얻는 열쇠가 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고를 개선한 원고의 이전 버전에 대한 의견에 대해 익명의 검토자에게 감사드립니다. 이 작품은 아칸소 대학의 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
