Summary
Målet med denne protokollen er å genotype havet Anemone Nematostella vectensis under gastrulation uten å ofre det embryo.
Abstract
Beskrevet her er en PCR-basert protokoll for å genotype den gastrula scenen embryo av anthozoan Nesledyr Nematostella vectensis uten å ofre livet til dyret. Etter in vitro befruktning og de-jellying, zygotes har lov til å utvikle for 24 timer ved romtemperatur for å nå tidlig til midten av gastrula scenen. Den gastrula embryo blir deretter plassert på en agarose gel seng i en Petri parabolen inneholder sjøvann. Under dissekere mikroskop brukes en tungsten nål til å kirurgisk skille en aboral vev fragment fra hvert embryo. Post-kirurgi embryo er da lov til å helbrede og fortsette utviklingen. Genomisk DNA trekkes ut fra det isolerte vevs fragmentet og brukes som mal for geometrisk spesifikk PCR. Genotype kan fastslås basert på størrelsen på PCR-produkter eller tilstedeværelse/fravær av allel-spesifikke PCR-produkter. Etter operasjonen embryo sorteres deretter i henhold til genotype. Varigheten av hele genotyperingteknologi prosessen avhenger av antall embryo som skal undersøkes, men det krever minimalt 4 – 5 timer. Denne metoden kan brukes til å identifisere knockout mutanter fra en genetisk heterogen befolkning på embryo og muliggjør analyser av fenotyper under utvikling.
Introduction
Trichoplax representerer en mangfoldig gruppe av dyr som inkluderer maneter, koraller, og sjø anemoner. De er diploblasts, bestående av ektoderm og endoderm som er adskilt av en ekstracellulære matrise (mesoglea). Cnidaria er en søster gruppe til speciose Bilateria, som tradisjonelle dyremodeller som Drosophila og mus hører til1. I tillegg antas det at Cnidaria-Bilateria-forskjellene har forekommet i pre-Cambrian periode2. Som sådan, komparative studier av Trichoplax og bilaterians er avgjørende for å få innsikt i biologi av deres siste felles stamfar. Nylig har komparative Genomics avdekket at Trichoplax og bilaterians dele mange utviklingsmessige Toolkit gener som hakk og bHLH, noe som tyder på at deres felles stamfar allerede hadde disse genene3. Imidlertid er rollen til disse utviklingsmessige verktøykasse gener i den siste felles stamfar til Cnidaria og Bilateria sammenlignbare mindre godt forstått. For å løse dette problemet er det avgjørende å studere hvordan disse dypt bevarte genene fungerer i Trichoplax.
En av de nye Nesledyr genetiske modellene er anthozoan Nematostella vectensis. Dens Genova er blitt i rekkefølge3, og en variasjon av genetisk verktøy, inkluderer morpholino-mediert gen knockdown, meganuclease-mediert transgenesis, og CRISPR-Cas9-mediert gen knockins og Knockouts, er nå anvendelig for bruk i denne dyr. I tillegg er Nematostella utvikling relativt godt forstått. Under embryogenesis skjer gastrulation ved invagination4, og fosteret utvikler seg til et fritt-svømming planula Larven. Planula senere forvandles til en fastsittende polypp med en munn og circumoral tentakler. Den polypp deretter vokser og når seksuell modenhet.
CRISPR-Cas9-mediert målrettet mutagenese er nå rutinemessig brukt til å studere gen funksjon i Nematostella vectensis5,6,7,8,9. For å generere knockout mutanter i Nematostella, en cocktail som inneholder geometrisk-spesifikke single-guide RNAs og endonuclease Cas9 protein er først injiseres i ubefruktede eller befruktet egg til å produsere F0 grunnlegger dyr som vanligvis viser mosaikk. F0 dyr er senere hevet til seksuell modenhet og krysset med hverandre for å produsere en F1 befolkning, en undergruppe som kan være knockout mutanter6. Alternativt kan seksuelt modne F0 dyr krysses med vill-type dyr for å generere F1 heterozygot dyr, og F1 heterozygotes som bærer en knockout allel i det geometriske interesse kan deretter krysses med hverandre for å produsere F2 avkom, en fjerdedel som forventes å være knockout mutanter5. Begge tilnærminger krever en metode for å identifisere knockout mutanter fra en genetisk heterogen befolkning. Polypp tentakler kan brukes til å trekke ut genomisk DNA for genotyperingteknologi6,7. Men i tilfeller der utviklingsmessige funksjon av genet av interesse blir undersøkt og mutant embryo ikke når polypp Stadium (dvs. på grunn av larvestadiet dødelighet forbundet med mutasjon), knockout mutanter må identifiseres tidlig i Ontogenese. Beskrevet her er en PCR-basert protokoll for å genotype individuelle dyr på gastrula scenen uten å ofre dyret, noe som muliggjør identifisering av knockout mutanter fra en genetisk heterogen befolkning på embryo. Varigheten av hele genotyperingteknologi prosessen avhenger av antall embryo som skal undersøkes, men det krever minimalt 4-5 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. induksjon av gyting, in vitro befruktning, og de-jellying
- Oppretthold Nematostella vectensis i sjøvann med et saltinnhold på 12 deler per tusen (PPT) i mørket ved 16 ° c, fôring Artemia daglig.
- På dagen før gyting induksjon, plassere dyr i en temperatur-og lys-kontrollerte inkubator. Programmere inkubator slik at dyrene utsettes for 8 t lys ved 25 ° c. Valgfritt: mate et lite stykke (< 1 mm3) av østers til enkelte dyr før du legger dem inn i inkubator for å forbedre gyting.
- La dyrene ligge i inkubator i 1 time ved 16 ° c.
- Fjern dyrene fra inkubator og la dem på en stasjonære med lys ved romtemperatur (RT) for å tillate gyting. Gyting skjer vanligvis i løpet av de neste 1.5-2 h.
- Hvis menn og kvinner er i separate beholdere, Legg egg pakker fra den kvinnelige beholderen inn i en sperm-inneholdende mannlig container ved hjelp av en overføring pipette som spissen er kuttet for å forstørre åpningen slik at eggene ikke er skadet av mekanisk stress under Overføre. Tillat egg skal befruktet ved å la dem i den mannlige beholderen i minst 15 min.
- De-Jelly egg pakkene i sjøvann som inneholder 3% cystein (pH 7,4) på en Petri parabolen eller i en 15 mL tube. Forsiktig agitere på en shaker i 12 minutter.
- Bruk en plast pipette for å bryte opp klumper og fortsette å agitere for en annen 2-3 min til helt de-jellied.
- Fjern cystein ved å bytte ut mediet med friskt sjøvann i minst 5x.
- Oppbevar befruktet egg på et glass Petri parabolen ved 16 ° c eller RT.
2. kirurgisk fjerning av et aboral vev fra et gastrula embryo
- Klargjør en DNA-utvinnings buffer bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 og 1 mg/mL proteinase K. Bruk 20 mL av utvinnings bufferen per embryo. Bland godt ved å virvlingen og alikvot buffer i PCR-rør.
- Oppløse 1% agarose i sjøvann og hell den i en Petri parabolen å dekke bunnen. Cool på en stasjonære å lage en gel seng. Hell fersk sjøvann for å dekke gel sengen i Petri parabolen.
- Transfer 24 h post-befruktning (hpf) embryo (tidlig-til midten av gastrula scenen) i Petri parabolen inneholder en agarose gel seng.
- Sett en wolfram nål i en nål holder og sterilisere ved å dyppe nålen spissen i alkohol (70% eller høyere) og plassere den i flammer for å brenne av alkohol.
- Under en dissekere mikroskop (på 20x til 40x forstørrelse), bruk tungsten nålen for å gjøre en depresjon på agarose seng ved å fjerne et stykke overflate agarose om størrelsen på et embryo som skal manipuleres, og plassere embryo på depresjonen med lateral sin side vendt ned for å begrense bevegelsen av fosteret for mikrokirurgi.
- Bruk wolfram nålen til kirurgisk forbruksavgift et stykke aboral vev ligger overfor den muntlige blastoporal åpningen. En aboral en tredjedel til en fjerdedel av embryonale vevet langs oral-aboral aksen er vanligvis tilstrekkelig.
- Bruk en P20-pipette til å overføre det isolerte aboral vevet (i < 2 mL) til et PCR-rør som inneholder 20 mL DNA-utvinnings buffer.
- Overfør etter operasjonen embryo til en brønn som inneholder minst 500 mL fersk sjøvann i en 24-eller 96-brønn plate.
- Gjenta trinn 2.4 – 2.8 for antall embryo etter behov.
- Plasser brønn platen som inneholder etter operasjonen embryo i en inkubator ved 16 ° c eller RT til genotyperingteknologi er fullført.
3. genomisk DNA-ekstraksjon og genotyperingteknologi PCR
- Snurr kort ned PCR-rørene som inneholder DNA-ekstraksjon buffer og isolert embryonale vev ved hjelp av en mini-sentrifuger (f. eks ved 2 680 x g for 10 s).
- For å trekke ut genomisk DNA fra enkelt embryo, ruge PCR-rørene ved 55 ° c for 3 h. Vortex for 30 s hver 30 min for å sikre brudd på celle klumper og forbedre cellelyse.
- Ruge PCR-rørene ved 95 ° c i 5 min for å deaktivere proteinase K.
- Behold gDNA-ekstrakter ved 4 ° c eller på is, og Fortsett umiddelbart til PCR.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her ved å plassere gDNA-ekstrakter i en-20 ° c fryser. - Sett opp en PCR-reaksjon ved hjelp av utpakkede gDNA som en mal for å forsterke genomisk geometriske interesse.
- Hvis ulike alleler på det geometriske interesse varierer i størrelse slik at størrelsen forskjellen kan oppdages ved agarose gel elektroforese, designe et enkelt sett med primere å forsterke hele geometriske.
- Alternativt kan du bruke allel-spesifikke primere som genererer PCR-produkter bare i nærvær av den spesifikke allel; for eksempel ved å designe primer som binder seg til en region som inneholder innsetting/sletting mutasjoner.
- Bruk en typisk PCR-reaksjon på 20 mL som følger: 5 mL gDNA-ekstrakter, 8 mL nuklease vann, 4 mL PCR-buffer, 0,2 mL på 10mM dNTPs, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM forover primer, 1 mL 10 mM omvendt primer og 0,2 mL DNA-polymerase (se tabell over materialer).
Merk: flere primere kan brukes i en PCR-reaksjon. For eksempel, en universell Forward primer og to allel-spesifikke omvendt primere kan kombineres, så lenge de to omvendte primere er utformet for å generere PCR produkter av forskjellige størrelser, slik at tilstedeværelsen/fraværet av de to alleler kan entydig bestemmes av gel elektroforese (se representative resultater seksjon).
- Kjør agarose gel elektroforese for å bestemme størrelsen og tilstedeværelsen/fraværet av PCR-produkter. Juster tilstanden til agarose gel-elektroforese (f.eks. agarose gel prosent, V/cm og varighet), avhengig av forventet størrelse på PCR-produkter.
- Bruk resultatene fra PCR om størrelse og tilstedeværelse/fravær av PCR-produkter for å tildele en genotype til hvert post-kirurgi embryo. Hvis for eksempel forskjellige alleler forventes å generere PCR-produkter av forskjellige størrelser, kan du bruke størrelsesinformasjonen til å tilordne genotype for hvert embryo. Hvis allel-spesifikke primere brukes, bør dataene på tilstedeværelsen/fraværet av PCR-produkter brukes til å tildele en genotype til hvert embryo.
- Sorter embryo i henhold til genotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det Nematostella Genova har en enkelt geometriske som koder en forløper protein for neuropeptide GLWamide. Tre knockout mutant alleler på dette geometriske (GLW-a, GLW-bog GLW-c) har tidligere rapportert5. Fire heterozygot menn som bærer en vill-type allel (+) og knockout allel GLW-cpå GLWamide geometrisk (genotype: +/GLW-c) ble krysset med en heterozygot kvinnelig bærer en vill-type allel og ulike knockout allel GLW-a på samme geometrisk (genotype: +/GLW-a) for å generere en avkom. Det er fire mulige genotyper i avkom: GLW-a/GLW-c, +/GLW-c, GLW-a/+, og +/+. Ut av alle avkom, åtte embryo ble tilfeldig valgt for denne representative genotyperingteknologi analysen. For genotyperingteknologi PCR, en universell Forward primer og to allel-spesifikke omvendt primere ble utformet5. Den omvendte primer spesifikke for GLW-a binder seg til en region som inneholder innsetting mutasjoner, og den forventede størrelsen på PCR produktet er 151 BP. Omvendt primer spesifikke for GLW-c binder seg til en region som inneholder både innsetting og sletting mutasjoner, og den forventede størrelsen på PCR produktet er 389 BP. Verken omvendt primer kan binde til den ville-type sekvensen, og dermed ingen PCR-produkter vil bli generert fra vill-type embryo. Figur 1 viser et representativt resultat av PCR-analysen. Embryo 1 og 2 viser et enkelt PCR-band i samsvar med forventet størrelse på GLW-a. Embryo 3 og 6 viser to PCR-band som tilsvarer de forventede størrelsene for alleler GLW-aog GLW-c. Embryo 4, 7 og 8 viser et enkelt PCR-band i samsvar med forventet størrelse på GLW-c. Embryo 5 viser ingen band, noe som tyder på mangelen på primer bindende.
For å utelukke muligheten for gDNA utvinning svikt, en annen PCR ble kjørt ved hjelp av en omvendt primer som kan binde til Wild-type sekvensen, som viste et PCR produkt av en forventet størrelse (1290 BP; Figur 2). Det bør bemerkes at i figur 2, en av prøvene (indikert med *) VISTE ingen PCR produkter, antyder en svikt i gDNA utvinning.
Basert på resultatene ovenfor, tolkes genotype av hvert embryo til å være som følger: embryo 1: +/GLW-a, embryo 2: +/GLW-a, embryo 3: GLW-a/GLW-c, embryo 4: +/GLW-c, embryo 5: +/+, embryo 6: GLW-a/GLW-c, embryo 7: +/GLW-c, og embryo 8: +/GLW-c.
Figur 1: representative resultater fra en GENOTYPERINGTEKNOLOGI PCR-analyse. 1-8 representerer genotyperingteknologi PCR resultater fra tilfeldig samplet embryo blant avkom av en F1 heterozygot mutant krysning mellom en +/GLW-en kvinnelig og +/GLW-channer. gDNA ble Hentet fra en embryonale vev fragment og brukes som en PCR mal. GLWamide-geometrisk ble rettet mot PCR-forsterkning, og en universell frem primer og to allel-spesifikke omvendte primere ble brukt (tabell med materialer). Den omvendte primer spesifikke for GLW-a genererer en 151 BP PCR band (1, 2, 3, 6), mens omvendt primer spesifikke for GLW-c genererer en 389 BP PCR band (3, 4, 6, 7, 8). Verken omvendt primer kan binde til den ville-type sekvensen, og dermed ingen PCR-produkter vil bli generert fra vill-type embryo (5). Den 1,5% agarose gel ble kjørt på 128 V i 25 min. En 100 BP DNA stigen ble brukt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative resultater fra Geometrisk spesifikk PCR for å bekrefte tilstedeværelsen av gDNA. Ti gDNA-ekstrakter som ikke klarte å generere PCR-produkter i GLW mutant allel-spesifikke PCR-eksperimenter, inkludert embryo 5 fra figur 1 (' 5 '), ble brukt som PCR-maler for PCR-eksperimentet som ble vist. En universell fremover og revers GLWamide-spesifikke primere ble brukt til å generere et 1290 BP PCR produkt fra en vill-type allel. Ni av ti DNA-ekstrakter (bortsett fra den som indikeres *) viste et PCR-band med forventet størrelse, inkludert embryo 5 fra figur 1 (' 5 '). Dette tyder på at unnlatelse av å generere PCR-produkter fra embryo 5 var ikke på grunn av mangelen på en tilstrekkelig gDNA mal. 1,5% agarose gel ble kjørt på 128 V i 25 min. 1 kb DNA stigen ble brukt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her en PCR-basert protokoll for å genotype en enkelt sjø Anemone embryo uten å ofre dyret. Etter gyting og de-jellying, befruktet egg har lov til å utvikle seg til gastrulae. Den aboral regionen av hver gastrula embryo er kirurgisk fjernet, og den isolerte aboral vevet brukes til påfølgende genomisk DNA-ekstraksjon, mens de resterende post-kirurgi embryo helbrede og fortsette utviklingen. GDNA-ekstrakter brukes deretter for en PCR-analyse for å fastslå genotype til hvert embryo. Denne metoden utnytter muligheten for muntlige halvdelene av havet Anemone embryo å regulere og utvikle10,11, og flertallet av embryo (> 90%) vanligvis overleve operasjonen og utvikle normalt under egnede kultur forhold. Det tissue beløpet krevde for denne genotyperingteknologi analysen er mindre enn ettall-halvparten av en hel gastrula embryo, og negativ resultater på grunn av gDNA trekking dårlig er sjelden (< 5%). Gitt at bare en liten mengde vev er nødvendig, er det sannsynlig mulig å bruke pre-gastrula stadium embryo for denne genotyperingteknologi analysen; men dette har ennå ikke blitt testet. Denne metoden kan utføres effektivt så lenge dyret ikke har nådd et stadium av aktiv svømming (dvs. før fri-svømming planula scenen). Denne genotyperingteknologi metoden er spesielt fordelaktig i tilfeller som krever utførelsen av fenotype analyser under utviklingen.
En begrensning av denne protokollen er at antall embryo i stand til å bli vist kan være begrenset. Spesielt kirurgisk fjerning av en aboral vev kan ta ett til to minutter per embryo, særlig for de uinnvidde. En erfaren forsker skal kunne fullføre hele genotyperingteknologi analysen for minst 80 embryo per dag, men studier som involverer hundrevis eller tusenvis av embryo er trolig for tidkrevende å fullføre på en dag.
Forskere må også være oppmerksomme på at fenotype observert i post-kirurgi mutanter kan være forskjellig fra det intakt mutanter, for eksempel på grunn av effekten av gen knockout på healing og/eller embryonale regulering i gastrulae. Denne muligheten bør testes ved å undersøke om fenotype funnet i etter kirurgi mutanter er faktisk synlig i intakt mutanter.
Det er flere alternative tilnærminger til den beskrevne metoden for genotyperingteknologi. For det første, immunostaining med et antistoff mot et protein hvis uttrykk er tapt i knockout mutanter kan utføres for å identifisere knockout mutant individer fra en genetisk heterogen befolkning på å utvikle dyr. For det andre, in situ hybridisering kan brukes til dette formålet, hvis riboprobe kan utformes slik at den ikke hybridize til mutant mRNAs. For eksempel, hvis den muterte alleler av en knockout dyr bære store sletting mutasjoner i samme region av genet, kan riboprobe utformes for å hybridize til regionen av genet slettet i knockout mutanter. I begge tilfeller er knockout mutanter forventes å vise noen merking, mens heterozygot og vill-type individer skal vise merking. Imidlertid vil dyrene må ofret på grunn av vev fiksering kreves for farging. Endelig kan knockout mutanter heves til seksuell modenhet og krysset med hverandre for å generere en avkom, som alle bør være knockout mutanter, og analyser av utviklingsmessige fenotype kan utføres ved hjelp av denne avkom6. Denne metoden krever at knockout dyrene er levedyktig og i stand til reproduksjon og er dermed begrenset i sin søknad til unødvendige gener.
Selv om den beskrevne genotyperingteknologi protokollen er utviklet for havet Anemone embryo, er det mulig å bruke denne metoden med andre Trichoplax der både genomisk informasjon og embryo er tilgjengelig (f. eks, koraller12 og maneter13), så lenge embryo er i stand til helbredelse og regulering ved kirurgisk fjerning. Vellykket CRISPR-mediert gen modifikasjon eksperimenter har vært allerede rapportert i koraller14 samt hydrozoan maneter15,16. Fremtidige anvendelser av denne genotyperingteknologi protokollen til ikke-Sea Anemone Trichoplax vil være viktig for studier av genetisk grunnlag av deres utvikling. Dette vil i sin tur være nøkkelen til å få mekanistisk innsikt i utviklingen av bemerkelsesverdig mangfoldig Nesledyr utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker anonyme anmeldere for kommentarer til den tidligere versjonen av manuskriptet, som forbedret manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Universitetet i Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
