Summary
Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.
Abstract
Burada açıklanan, hayvan hayatından ödün vermeden anthozoan Genus nematostella vectensis gastrula sahne embriyo genotip için PCR tabanlı bir protokoldür. İn vitro fertilizasyon ve de-jellying takipte, zygotların erken-orta gastrula aşamasına ulaşmak için oda sıcaklığında 24 saat gelişmesine izin verilir. Gastrula embriyoları daha sonra deniz suyu içeren bir petri çanak agaroz jel yatağa yerleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında, bir tungsten iğne cerrahi olarak her embriyonun bir aboral doku parçası ayırmak için kullanılır. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra iyileşmeye ve gelişmeye devam etmesine izin verilir. Genomik DNA izole doku parçasından çıkarılır ve Locus özel PCR için bir şablon olarak kullanılır. Genotip, PCR ürünlerinin boyutuna göre veya ALLELE özel PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda tespit edilebilir. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra genottipe göre sıralanır. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4 – 5 h gerektirir. Bu yöntem embriyoların genetik olarak heterojen bir nüfusundan nakavt mutantları tanımlamak için kullanılabilir ve gelişim sırasında fenotiplerin analizlerini sağlar.
Introduction
Cnidarians denizanası, mercanlar ve deniz anemonlar içeren hayvanların çeşitli bir grup temsil eder. Bunlar, ekstrasellüler matris (mesoglea) ile ayrılan ektoderm ve endoderm 'den oluşan diploblastlar. Cnidaria, Drosophila ve mus gibi geleneksel hayvan modellerinin1' e ait olduğu Bilateria için bir kardeş grubudur. Ayrıca, Cnidaria-Bilateria sapma pre-Cambrian döneminde oluştuğu düşünülmektedir2. Bu nedenle, cnidarians ve bilatyalılar karşılaştırmalı çalışmalar en son ortak atalarının biyoloji içine anlayış kazanmak için önemlidir. Son zamanlarda, karşılaştırmalı genomikler, cnidarians ve bilatozların notch ve bhlh gibi birçok gelişimsel araç genlerini paylaşımının, ortak atalarının zaten bu genler olduğunu ima ettiğini açıkladı3. Ancak, Cnidaria ve Bilateria 'nın son ortak atalarında bu gelişimsel araç genlerinin rolü göreceli olarak daha az iyi anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için, cnidarians içinde bu derinden uyumlu genlerin nasıl işledik çalışması önemlidir.
Gelişen Genus genetik modellerinden biri anthozoan nematostella vectensis 'dir. Genomu3sıralanmıştır ve morpholino-aracılı gen taklası, meganuclease-aracılı Transgenesis ve Crispr-Cas9-aracılı gen tokmağı ve knockouts dahil olmak üzere çeşitli genetik araçlar, şimdi bu hayvanın kullanımı için kullanılabilir. Buna ek olarak, Nematostella gelişimi nispeten iyi anlaşılır. Embriyogenyon sırasında, gastrasyon invaginasyon tarafından oluşur4, ve embriyo serbest yüzme Planula larva içine gelişir. Planula daha sonra bir ağız ve circumoral dokunacles ile bir sapsız polip dönüşür. Polip sonra büyür ve cinsel olgunluğa ulaşır.
Crispr-Cas9-aracılı hedeflenen Mutagenezi artık rutin olarak nematostella vectensis5,6,7,8,9' da gen fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Nematostella'da nakavt mutantlar oluşturmak için, Locus 'a özgü tek kılavuzluk Rnas ve endonükleaz Cas9 proteini içeren bir kokteyl, ilk olarak gösteren F0 kurucusu hayvanları üretmek için döllenmez veya döllenmiş yumurtalara enjekte edilir Mozaik. F0 hayvanlar daha sonra cinsel olgunluğa yükseltilmiş ve bir F1 nüfus üretmek için birbirleri ile geçti, bir alt kümesi hangi nakavt mutantlar6olabilir. Alternatif olarak, cinsel olgun F0 hayvanlar F1 heterozigot hayvanlar oluşturmak için vahşi tip hayvanlar ile geçilebilir ve faiz Locus içinde bir nakavt allel taşımak F1 heterozigotlar daha sonra F2 yavru üretmek için birbirleri ile kesişebilir, bir çeyrek Hangi nakavt mutantlar5bekleniyor. Her iki yaklaşım da genetik heterojen bir nüfusun nakavt mutantları tanımlamak için bir yöntem gerektirir. Polyp tentacles Genotipleme için genomik DNA ayıklamak için kullanılabilir6,7. Bununla birlikte, ilgi geninin gelişimsel fonksiyonunun incelendiği ve mutant embriyoların polip aşamasına ulaşamayacağı durumlarda (yani, mutasyona bağlı larva saflığı nedeniyle), nakavt mutantların ontojende erken tespit edilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, hayvan ödün vermeden gastrula aşamasında genotip bireysel hayvanlar için PCR tabanlı bir protokoldür, bu embriyo genetiği heterojen bir nüfusun nakavt mutantların tanımlanması sağlar. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4-5 h gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yumurtlama indüksiyon, in vitro fertilizasyon, ve de-jellying
- 16 °C ' de karanlığın içinde bin başına 12 parça (PPT) tuzluluk ile deniz suyunda Nematostella vectensis koruyun, günlük Artemia besleme.
- Yumurtlama İndüksiyon öncesi gün, bir sıcaklık ve ışık kontrollü kuluçla hayvan yerleştirin. Böylece hayvanların 25 °C ' de 8 h ışığa maruz kalabilmesi için kuluçk programını programlamak. Opsiyonel: yumurtlama geliştirmek için küçük bir parça (< 1 mm3) istiridye, bireysel hayvanlar için kuluçtar içine yerleştirmeden önce beslemek.
- Hayvanlarını, 16 °C ' de 1 saat boyunca kuluçsa bırakın.
- Hayvanlarını kuluçla çıkarın ve yumurtlama izin vermek için oda sıcaklığında (RT) ışık ile bir tezgah üzerinde bırakın. Yumurtlama genellikle sonraki 1,5 – 2 saat içinde gerçekleşir.
- Erkek ve dişiler ayrı konteynerlerde ise, dişi kabından yumurta paketlerini sperm içeren bir erkek konteynırı kullanarak, uçları açılması büyütmek için kesilen bir transfer pipeti kullanılarak, yumurtaların mekanik stres sırasında zarar görmediğinden Transfer. Yumurta en az 15 dakika için erkek kap içinde bırakarak döllenmiş izin verin.
- De-Jelly deniz suyunda yumurta paketleri 3% sistein içeren (pH 7,4) bir petri çanak veya 15 mL tüp. Yavaşça 12 dakika boyunca bir shaker üzerinde sarsıcı.
- Kümeleri kırmak için plastik bir pipet kullanın ve tamamen de-jellied kadar başka bir 2-3 dk için karıştırmaya devam.
- En az 5x için taze deniz suyu ile medyayı değiştirerek sistein çıkarın.
- 16 °C veya RT bir cam Petri çanak üzerinde döllenmiş yumurta tutun.
2. bir gastrula embriyo bir aboral doku cerrahi kaldırılması
- 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 ve 1 mg/mL proteinaz K ile oluşan bir DNA ekstraksiyon tamponu hazırlayın. embriyo başına 20 mL ekstraksiyon tamponu kullanın. İyi vortekslenir tarafından mix ve PCR tüpler içine arabellek kısım.
- Deniz suyunda% 1 agaroz eritin ve alt kapak için bir petri çanak içine dökün. Jel yatak yapmak için bir tezgah üzerinde cool. Petri çanak jel yatak kapsayacak şekilde taze deniz suyu dökün.
- 24 saat sonrası fertilizasyon (HPF) embriyoları (erken-orta gastrula aşaması), agaroz jel yatağı içeren Petri tabağına aktarın.
- Bir iğne tutucu içine bir tungsten iğne takın ve alkol iğne ucu daldırma ile sterilize (70% veya daha yüksek) ve alkol yakmak için alev yerleştirerek.
- Bir diseksiyon mikroskop altında (20X 40X büyütme), bir embriyo boyutu hakkında yüzey agaroz bir parça kaldırarak agaroz yatakta bir depresyon yapmak için tungsten iğne kullanın ve onun lateral ile depresyon üzerine embriyo yerleştirin Mikrocerrahi için embriyonun hareketini kısıtlamak amacıyla aşağı bakacak şekilde.
- Oral blastoporal açılış karşısında bulunan aboral doku bir parçası cerrahi olarak tüketim tungsten iğne kullanın. Oral-aboral eksen boyunca embriyonik doku dörtte biri için bir aboral bir-üçte genellikle yeterlidir.
- İzole aboral dokusu (< 2 mL) 20 mL 'Lik DNA ekstraksiyon tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarmak için P20 pipet kullanın.
- Ameliyat sonrası embriyo, 24 veya 96-kuyu plakasında en az 500 mL 'Lik taze deniz suyu içeren bir kuyu içine aktarın.
- Gerektikçe embriyo sayısı için 2.4 – 2.8 arasındaki adımları yineleyin.
- Cerrahi sonrası embriyoları içeren kuyu plakasını 16 °C veya RT 'de Genotipleme tamamlanıncaya kadar bir kuluçta yerleştirin.
3. genomik DNA ekstraksiyon ve genotipleme PCR
- DNA ekstraksiyon tamponu ve izole embriyonik dokulara mini Santrifüjü kullanarak (örn. 2.680 x g , 10 s için), PCR tüplerini kısaca döndürün.
- Tek embriyodan genomik DNA 'yı ayıklamak için 55 °C ' de PCR tüplerini 3 h. 30 sn. Vortex için her 30 dakikada bir hücre kümeleri dağıldığından emin olmak ve hücre liziz geliştirmek.
- 95 °c ' de PCR tüplerini 5 dakika boyunca devre dışı proteinaz K olarak kulbin.
- GDNA özleri 4 °C veya buzda tutun ve hemen PCR 'ye geçin.
Not: protokol,-20 °C ' lik dondurucuda gDNA özleri yerleştirerek burada duraklatılabilir. - İlgi genomik Locus yükseltmek için bir şablon olarak çıkarılan gDNA kullanarak bir PCR reaksiyon ayarlayın.
- Eğer faiz Locus farklı allonların boyutu fark agaroz jel elektroforez tarafından tespit edilebilir böylece büyüklüğü farklıdır, tüm Locus yükseltmek için tek bir set astar tasarımı.
- Alternatif olarak, yalnızca belirli bir ALLELE varlığında PCR ürünleri üreten ALLELE özgü astar kullanın; Örneğin, ekleme/silme mutasyonları içeren bir bölgeye bağlanan astar tasarlayarak.
- Tipik bir 20 mL PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki gibi kullanın: 5 mL gDNA özler, 8 mL çekirdeksiz su, 4 mL PCR tampon, 0,2 mL mm dNTPs, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM ileri astar, 1 mL 10 mM ters astar ve 0,2 mL DNA polimeraz (bkz. malzeme tablosu).
Not: çoklu astar, PCR reaksiyonunda kullanılabilir. Örneğin, bir evrensel ileri astar ve iki ALLELE özel ters astarlar kombine edilebilir, sürece iki ters astar farklı boyutlarda PCR ürünleri üretmek için tasarlanmıştır, böylece varlığı/yokluğunda iki alelleri belirsizliğe sahip olabilir Jel Elektroforez tarafından belirlenir (bkz. temsili sonuçlar bölümü).
- PCR ürünlerinin boyutunu ve varlığını/yokluğunda belirlemek için agaroz jel elektroforezi çalıştırın. PCR ürünlerinin beklenen boyutuna bağlı olarak agaroz jel elektroforezinin (örn. agaroz jel yüzdesi, V/cm ve süre) durumunu ayarlayın.
- Her ameliyat sonrası embriyo için bir genotip atamak için PCR ürünlerinin boyutu ve varlığı/yokluğunda ilgili PCR sonuçlarını kullanın. Örneğin, farklı boyutlarda PCR ürünleri üretmek için başka bir Allen bekleniyorsanız, her embriyo için genotip atamak için boyut bilgilerini kullanın. ALLELE özel astar kullanıldığında, PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda veri her embriyo bir genotip atamak için kullanılmalıdır.
- Embriyoları genottipe göre sıralayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nematostella genomunun, Nörofobide glwamıde için bir preürot proteini kodlayan tek bir Locası vardır. Bu Locus 'ta üç Knockout mutant alelleri (GLW-a, GLW-bve GLW-c) daha önce5bildirildi. Glwamide Locus (Genotype: +/GLW-c) ile vahşi tip allel (+) ve nakavt allel GLW-ctaşıyan dört heterozigot erkek, vahşi tip allel ve farklı nakavt taşıyan bir heterozigot dişi ile geçti allel GLW-a aynı Locus (Genotype: +/GLW-a) bir Progeny oluşturmak için. Progeny 'de dört olası genotip vardır: GLW-a/GLW-c, +/GLW-c, GLW-a/+ ve +/+. Tüm Progeny dışında, sekiz embriyo rasgele Bu temsilci Genotipleme tahlil için seçildi. Genotipleme PCR için, bir evrensel ileri astar ve iki ALLELE özgü ters astar5tasarlanmıştır. GLW-a bağlanan ters astar, ekleme mutasyonları içeren bir bölgeye bağlanır ve PCR ürününün beklenen boyutu 151 BP 'dir. GLW-c ' y e özgü ters astar, hem ekleme hem de silme mutasyonları içeren bir bölgeye bağlanır ve PCR ürününün beklenen boyutu 389 BP 'dir. Ne Reverse astar vahşi tip dizisine bağlayabilirsiniz ve böylece hiçbir PCR ürünleri vahşi tip embriyolar oluşturulur. Şekil 1 , PCR testin temsili bir sonucunu gösterir. Embriyo 1 ve 2 GLW-a beklenen boyutu ile tutarlı tek bir PCR Band gösterir. Embriyolar 3 ve 6, alelleri GLW-ave GLW-ciçin beklenen boyutlara karşılık gelen iki PCR bandını gösterir. Embriyo 4, 7, ve 8 GLW-c beklenen boyutu ile tutarlı tek bir PCR Band gösterir. Embriyo 5 hiçbir bant gösterir, astar bağlayıcı eksikliği düşündürmektedir.
GDNA ekstraksiyon arızası olasılığını ortaya çıkarmak için, başka bir PCR beklenen bir boyutta bir PCR ürün gösterdi vahşi tip sıra, bağlayabilirsiniz bir ters astar kullanılarak çalıştırılmıştı (1290 BP; Şekil 2). Şekil 2' de, örneklerden biri (* ile belirtilir), gdna Ekstraksiyonunda bir başarısızlık düşündürerek HIÇBIR PCR ürünü göstermemesi gerektiğini belirtmelidir.
Yukarıdaki sonuçlara dayanarak, her embriyonun genotipi aşağıdaki gibi yorumlanır: embriyo 1: +/GLW-a, embriyo 2: +/GLW-a, embriyo 3: GLW-a/GLW-c, embriyo 4: +/GLW-c, embriyo 5: +/+, embriyo 6: GLW-a/GLW-c, embriyo 7: +/GLW-cve embriyo 8: +/GLW-c.
Resim 1: bir Genotipleme PCR tahlil sonuçları temsili. 1-8 bir +/GLW-a dişi ve +/GLW-cerkek arasında F1 heterozigot mutant haç arasında rasgele örneklenen embriyolar arasında Genotipleme PCR sonuçlarını temsil eder. gDNA, embriyonik doku parçasından çıkarıldı ve PCR şablonu olarak kullanılmıştır. GLWamide Locus PCR amplifikasyonu için hedeflenmiştir, ve bir evrensel ileri astar ve iki ALLELE özgü ters astar (malzeme tablosu) kullanıldı. GLW-a ' y a özgü ters astar bir 151 BP PCR bandı üretir (1, 2, 3, 6), GLW-c ' y e özgü ters astar bir 389 BP PCR bandı oluşturur (3, 4, 6, 7, 8). Ne Reverse astar vahşi tip sıra bağlamak ve böylece hiçbir PCR ürünleri vahşi tip embriyo (5) oluşturulur. 1,5% agaroz jel 128 V 'de 25 dakika boyunca çalıştırılmıştı. 100 BP DNA merdiven kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: gDNA 'nın varlığını onaylamak için Locus özel PCR temsili sonuçları. GLW mutant ALLELE özel PCR deneyler, Şekil 1 ' den embriyo 5 dahil olmak üzere PCR ürünleri oluşturmak Için başarısız olan on gdna özler (' 5 '), PCR deneme için PCR şablonları olarak kullanılmıştır gösterildi. Bir evrensel ileri ve ters GLWamide-Locus-özel astar bir vahşi tip ALLELE bir 1290 BP PCR ürün oluşturmak için kullanıldı. On DNA ekstraktından dokuz ' u (belirtilen *) dışında, Şekil 1 ' den (' 5 ') embriyo 5 de dahil olmak üzere beklenen boyutta bir PCR bandı gösterdi. Bu, embriyo 5 PCR ürünleri oluşturmak için başarısızlık yeterli bir gDNA şablonu eksikliği nedeniyle olmadığını göstermektedir. 1,5% agaroz jel 128 V 'de 25 dk. 1 KB 'lik DNA merdiven kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tanımlanan bir PCR tabanlı protokol genotip tek bir deniz anemone embriyo hayvan ödün vermeden. Yumurtlama ve de-jellying takiben, döllenmiş yumurtaların gastrulae içine gelişmesine izin verilir. Her gastrula embriyo aboral bölge cerrahi olarak kaldırılır ve izole aboral doku sonraki genomik DNA ekstraksiyon için kullanılır, kalan cerrahi sonrası embriyolar iyileşmek ve gelişmeye devam ederken. GDNA ekstraları daha sonra her embriyonun genotipini belirlemek için bir PCR tahlil için kullanılır. Bu yöntem,10,11ve embriyoların çoğunluğu (>% 90) düzenlemek ve geliştirmek için deniz anemone embriyo oral yarısı yeteneğini yararlanır genellikle ameliyat hayatta ve uygun kültür koşullarında normalde geliştirmek. Bu Genotipleme tahlil için gerekli doku miktarı tüm gastrula embriyo bir yarısında daha az, ve gDNA ekstraksiyon yetmezliği nedeniyle olumsuz sonuçlar nadirdir (< 5%). Sadece küçük bir miktar doku gerekli olduğu göz önüne alındığında, bu Genotipleme tahlil için önceden gastrula aşama embriyo kullanmak olasıdır; Ancak, bu henüz test edilmemiştir. Bu yöntem, hayvan aktif yüzme (yani, serbest yüzme Planula aşamasından önce) bir aşamaya ulaşmadı sürece verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu Genotipleme yöntemi, gelişme sırasında fenotip analizlerinin performansını gerektiren durumlarda özellikle avantajlıdır.
Bu protokolün bir sınırlaması, taramalı embriyo sayısının sınırlı olması olabilir. Özellikle, bir aboral doku cerrahi kaldırılması embriyo başına bir ila iki dakika sürebilir, başlatılmamış için. Deneyimli bir araştırmacı günde en az 80 embriyo için tüm Genotipleme tahlil tamamlamak mümkün olmalıdır, ancak yüzlerce veya embriyo binlerce içeren çalışmalar bir günde tamamlamak için çok zaman alıcı muhtemeldir.
Araştırmacılar ayrıca cerrahi sonrası mutantların görülen fenotipin, örneğin gastrulae 'deki şifa ve/veya embriyonik Yönetmelikte gen nakinin etkisi nedeniyle, bozulmamış mutantlar içinde olduğundan farklı olabilir. Bu olasılık sonrası cerrahi mutantlar bulunan fenotip gerçekten bozulmamış mutantlar içinde gözlemlenebilir olup olmadığını inceleyerek test edilmelidir.
Tanımlanan Genotipleme yöntemine birkaç alternatif yaklaşım vardır. İlk olarak, bir antikor ile immünostasyon, ifade nakavt mutantlar içinde kaybolur bir protein karşı gelişen hayvanların genetik heterojen nüfusu nakavt mutant bireyler belirlemek için gerçekleştirilebilir. Ikinci, içinde situ hibridizasyon bu amaçla kullanılabilir, Eğer riboprobe böylece mutant mrnas için melezleşme değil tasarlanmış olabilir. Örneğin, bir nakavt hayvanın mutant allizi genin aynı bölgesinde büyük silme mutasyonları taşırsa, riboprobe nakavt mutantlar silinmiş genin bölgeye melezleşme için tasarlanmış olabilir. Her iki durumda da, nakavt mutantların hiçbir etiketleme göstermek bekleniyor, heterozigot ve vahşi tip bireyler etiketleme göstermelidir iken. Ancak, hayvanların boyama için gerekli doku fikreme nedeniyle feda edilmesi gerekir. Son olarak, nakavt mutantlar cinsel olgunluğa yükseltilebilir ve birbirleriyle kesişen bir döl oluşturmak için, bunların hepsi nakavt mutantlar olmalıdır, ve gelişimsel fenotipin analizleri bu Döl kullanılarak gerçekleştirilebilir6. Bu yöntem, nakavt hayvanların uygulanabilir ve üreme yeteneğine sahip olmasını gerektirir ve böylece vazgeçilmez genlere uygulama sınırlıdır.
Tanımlanan Genotipleme Protokolü deniz anemon embriyoları için tasarlansa da, bu yöntemi her iki genomik bilginin ve embriyoların erişilebilir olduğu diğer cnidarianlar ile kullanmak mümkündür (örn., mercanlar12 ve denizanası13), embriyolar cerrahi kaldırma üzerine şifa ve düzenleme yeteneğine sahiptir. Başarılı Crispr-aracılı gen modifikasyon deneyleri zaten mercanlar14 yanı sıra hydrozoan denizanası15,16bildirilmiştir. Bu Genotipleme protokolünün deniz dışı Anemone cnidarianlar 'a gelecekteki uygulamaları, gelişiminin genetik temelini oluşturan çalışmalar için önemli olacaktır. Bu, sırayla, son derece çeşitli Genus gelişimi evrimine mekanik anlayışlar kazanmak için anahtar olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.
Acknowledgments
Yazının önceki versiyonunda anonim yorumcular için teşekkür ederiz, bu da taslağı geliştirdi. Bu çalışma Arkansas Üniversitesi 'nden fon tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
