Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لأخذ عينات من الدم من الوريد تحت الترقوة من الفئران.
Abstract
الفار هو نموذج الثدييات قبل كل شيء لدراسة الامراض البشرية وصحة الإنسان. ومع ذلك ، فان جمع عينه الدم من الفئران يشكل تحديا في العمل البحثي. جمع الدم الذيل هو وسيله شعبيه عند الحاجة إلى كميه صغيره من عينه الدم. يمكن النظر في الشريان المداري إذا كانت هناك حاجه إلى كميه كبيره من الدم ولكن طريقه جمع الدم هذه لها قضايا اخلاقيه. سابقا ، أظهرنا جدوى وسلامه جمع عينه الدم من خلال ثقب الوريد تحت الترقوة في الفئران ، وهنا نحقق ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة في الفئران. نحن الإبلاغ عن ان هذه الطريقة أمنه وعمليه لجمع الدم في الفئران. جمع الدم من خلال ثقب الوريد تحت الترقوة في الفئران يمكن ان يكون وسيله مريحه في الاعمال البحثية اليومية.
Introduction
جمع عينه الدم من الفئران أمر ضروري في معظم مختبرات البحوث. النهج التقليدية لجمع الدم في الفئران هو قطع الذيل عندما تكون هناك حاجه إلى اقل من 100 μL من العينة1. ومع ذلك ، إذا كان هناك حاجه إلى أكثر من 100 μL من الدم في نقطه زمنيه غير الطرفية ، الرجعية المدارية ، نزيف فك أو جمع الدم تحت العقلية هي الأكثر شيوعا التقنيات المدروسة2. في بعض المناسبات ، تم اعتماد قسطرة الوريد الوداجي من خلال شق جراحي كطريقه بديله3.
ومع ذلك ، فان الطرق المذكورة أعلاه ضاره للفئران. وعلي حد علمنا ، فان الطريقة الرجعية غير مقبوله علي نطاق واسع بسبب المخاطر المحتملة لمضاعفات4،5. الصدمة العملية ذات الصلة لا يحدث فقط في المنطقة المرئية6،7، ولكن أيضا في عمق المدار6. إلى جانب ذلك ، فك جمع الدم هو المجهدة8 ويمكن ان تترافق مع النزيف المفرط2،9. بناء علي أبحاثنا السابقة10،11، هنا نقدم استراتيجية جديده لجمع الدم من الوريد تحت الترقوة في الفئران. يتم عرض ومناقشه السلامة والجدوى وحجم الدم الذي تم الحصول عليه مع هذه التقنية.
Protocol
وقد وافقت علي هذه الدراسة لجنه الأخلاق في جامعه الجنوب الوسطي للبحوث الحيوانية من مستشفي شيانغيا الثاني (تشانغشا ، الصين). تم اعداد المخطوطة وفقا للمبادئ التوجيهية12للوصول (البحوث الحيوانية: الإبلاغ عن التجارب في فيفو).
1. المواد والحيوانية
- اعداد المواد المطلوبة: 75 ٪ الايثانول ، شريط لاصق ، وكيل الخاتمة ، 2 مل أنبوب ، 1.0 مل حقنه متصلة مع ابره (26G) ، مقياس الكترونيه ، الهيبارين والمالحة (انظر جدول المواد).
- الحيوانية: اعداد 10 الفئران كونمينغ ، 6-8 أسابيع من العمر ووزنها 21.6-28.3 g (انظر جدول المواد). الحفاظ علي الفئران وفقا لدليل لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية13.
2. التخدير وتحديد المواقع الحيوانية
- تزن الماوس لحساب الجرعة المطلوبة من وكيل مخدر.
- حقن البنتوباربيتال الصوديوم (60 ملغم/كغ) من خلال حقن داخل الصفاق للحث علي التخدير العام14 (الشكل 1). تطبيق مرهم تزييت العين معقمه في بداية الاجراء لمنع الضرر للعيون المكشوفة.
ملاحظه: تعتبر الفئران لتكون تخدير بما فيه الكفاية عند إظهار اي استجابه المحرك لاختبار المنعكس الانسحاب دواسة ، قرصه الذيل ، أو قرصه الجلد في البطن. - ضع الماوس في الجدول العملية في موقف ضعيف و 2-4 سم بعيدا عن حافه الجدول لتسهيل ثقب الوريد (الشكل 2). إصلاح الأطراف في وضع مريح كما هو موضح في الشكل 2. لا حاجه إلى التنبيب أو التهوية الميكانيكية في الاجراء بأكمله.
- تطبيق وكيل الخاتمة حول الفضاء المتعدي مع مسحه القطن.
- بعد ثلاث دقائق ، اغسل العامل الذي يزيل الشعر بمسحه قطنية مبلله لأزاله الفراء وأي أوساخ مرئية.
- تعقيم الفضاء المتعدي مع 75 ٪ الايثانول ثم تجف مع الشاش نظيفه.
3. ثقب الوريد تحت الترقوة وجمع الدم
- تحديد موقع عظم الترقوة والحفرة المتفوقة مع الاصبع.
- تحديد موقع ثقب بالقرب من منتصف عظم الترقوة والنخاع اليها. وضع السبابة اليسرى الجانبية إلى موقع ثقب لإصلاح الجلد والانسجه تحت الجلد (الشكل 3).
- نقل الابره إلى الأعلى والتحريك نحو الحفرة القصيه متفوقة. بمجرد دخول الابره النسيج تحت الجلد ، وتحريك الاصبع البنصر من اليد اليمني إلى الوراء لتشكيل الضغط السلبي (الشكل 3).
ملاحظه: خلال هذه الخطوة ، يجب ان يكون موضع اليد اليمني للمشغل اقل قليلا من جدول التشغيل لجعل الابره تتحرك إلى الأعلى ومتفوقة علي المستوي الأفقي. هذا هو السبب في وضع الحيوانية بالقرب من حافه الطاولة. - نقل الحقنه إلى الامام 3-4 مم ولكن توقف إذا لم يكن هناك استنزاف الدم في الحقنه. ثم سحب ببطء مره أخرى الحقنه والحفاظ علي الضغط السلبي في ذلك. في معظم الحالات ، سيدخل الدم الحقنه عند السحب مره أخرى.
- بمجرد دخول الدم الحقنه ، وإصلاح الحقنه والحفاظ علي الضغط السلبي حتى يتم جمع الحجم المطلوب (200 μL) من الدم في الحقنه.
- بعد جمع الدم ، وسحب ابره ثقب ، واضغط علي موقع ثقب مع مسحه القطن قليلا لمده 1-2 دقيقه لوقف النزيف. ثم ، والفئران العودة إلى القفص.
ملاحظه: في بعض الأحيان ، لا يمكن للمرء الحصول علي الدم في محاولته الاولي. ضبط اتجاه الابره أفقيا وكرر الخطوات 3.3-3.5. إذا فشلت محاولات 3 للحصول علي عينه الدم ، والتحول إلى الجانب الآخر. - نقل عينه الدم إلى أنبوب heparinized.
4. الفئران الانتعاش
- في حين ان التخدير البنتوباربيتال هو في الواقع ، وسرعه الانتعاش عن طريق توفير الدعم الحراري حتى يتحرك الماوس مره أخرى.
Representative Results
كررنا هذا الاجراء في 10 الفئران كونمينغ (الذكور ن = 5 ، الإناث ن = 5 ، الوزن 25.4 ± 2.0 g). ونجحت تسعه إجراءات في الجانب الأيمن. فشلت حاله واحده في غضون 3 محاولات في الجانب الأيمن ونجحت عمليه جمع الدم علي الجانب الأيسر. وتراوحت الدورة الزمنيه (من ثقب للحصول علي حجم الدم المطلوب) بين 35-126 ثانيه (متوسط 68.4 ± 26.4 s). تم تعيين حجم جمع الدم إلى حوالي 200 μL (متوسط 203 ± 11.6 μL). نجحت عمليه جمع الدم في غضون 1 إلى 4 محاولات. الدم أخذ عينات ينجح علي المحاولة اولي في اثنان فيران وبعد 4 محاولات في واحده فاره; أخذ أخذ العينات 2-3 محاولات في الفئران الأخرى. وقد تم توضيح جميع البيانات في الجدول 1. وقد نجت جميع الماشية واستعادت عافيتها في غضون 30 دقيقه بعد أخذ عينات الدم. ولم يكن هناك فرق كبير بين الجنسين بالنسبة لجميع البارامترات المرصودة (الجدول 1).
الشكل 1 : التخدير العام من خلال حقن داخل الصفاق يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الموقف ضعيف من الماوس. لاحظ المسافة بين الهامش والماوس 2-4 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : موقع الثقب ووضعيه يد المشغل. لاحظ ان الاصبع الدائري من اليد اليمني يتحرك إلى الوراء لتشكيل الضغط السلبي. يتم وضع اليد اليسرى الجانبية إلى موقع ثقب لإصلاح الجلد والانسجه تحت الجلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : الموقع من الوريد تحت الترقوة ، عظم الترقوة والحفرة القصيه متفوقة. الوريد تحت الترقوة الدورات أسفل عظم الترقوة والمصارف في الوريد الأجوف متفوقة تحت الحفرة القصيه متفوقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : العلاقة بين جدار السفينة والابره اثناء العملية. (ا) تلتصق جدران الوريد تحت الترقوة ببعضها البعض بينما تتحرك الابره إلى الامام ، التالي لا يمكن سحب الدم. (ب) في حين سحب الابره إلى الوراء ، والجدران منفصلة عن بعضها البعض ، ويمكن سحب الدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| متغير | المجموع (ن = 10) | ذكور (ن = 5) | إناث (ن = 5) | القيمة P |
| وزن الجسم (ز) | 25.3 ± 2.2 | 25.3 ± 3.0 | 25.4 ± 1.3 | 0.926 |
| حجم الدم (μL) | 203.0 ± 11.6 | 208 ± 13.0 | 198 ± 8.4 | 0.187 |
| الدورة الزمنيه (ق) | 68.4 ± 26.4 | 70.6 ± 35.1 | 66.2 ± 18.0 | 0.809 |
| السحب | 2.3 ± 0.9 | 2.4 ± 1.1 | 2.2 ± 0.8 | 0.760 |
| لم تكن هناك اختلافات كبيره بين الجنسين لجميع المعلمات المرصودة ، كل قيمه P > 0.05. | ||||
الجدول 1: البارامترات المرصودة بين الجنسين
Discussion
ويمثل هذا التقرير امتدادا للبحوث السابقة المتعلقة بأخذ عينات الدم من خلال ثقب الوريد تحت الترقوة في الجرذان11. كما الماوس هو الأكثر شيوعا البحوث الحيوانية ، سيكون من المفيد معرفه ما إذا كان يمكن تطبيق هذه التقنية أيضا علي الفئران. وياتي التحدي من القطر الأصغر نسبيا للوريد تحت الترقوة.
في البحث الحالي ، وجدنا ان ثقب تحت الترقوة في الفئران هو وسيله ممكنة وموثوق بها لجمع الدم. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية مثل قطع الوريد الذيل أو جمع الدم المداري ، لا توجد قضايا اخلاقيه للأسلوب الحالي. نجا جميع الكائنات بعد هذا الاجراء دون المكملات السائلة بعد حوالي 200 μL من استخراج الدم, ويمكن استخدام الحيوانية لمزيد من الدراسات التجريبية. نظريا ، فان إجمالي حجم عينه استخراج لا يمكن ان تصل إلى أكثر من 10 ٪ من إجمالي حجم الدم المتداول في كل مره والحجم الإجمالي للحيوان البالغ هو 55 إلى 70 مل/كغ وزن الجسم5. للفئران المستخدمة في هذا البحث (21.6-28.3 g) ، يجب ان يكون الحد الأقصى لاستخراج حجم حوالي 200 μL. ونحن بذلك تعيين كميه الدم أخذ العينات حول 200 μL لكل ماوس. ان عدم القدرة علي قياس ضغط الدم ، ومعدل ضربات القلب ، ومعلمات الإجهاد الأخرى هي القيود الرئيسية لهذا التقرير.
التخدير العام الكافي هو مساله هامه أخرى لضمان نجاح الثقب. وينبغي ان تظل الفئران هادئه اثناء اجراء الثقب لتجنب خطر أصابه السفينة بالابره. وجدنا ان الصوديوم البنتوباربيتال في 60 ملغم/كغم للتخدير العام يمكن ان يلبي العمق المثالي للتخدير. ومن الجانب السلبي لهذا العامل هو وقت طويل نسبيا الانتعاش (في المتوسط حوالي 30 دقيقه). في بعض المعاهد ، يتم استخدام استنشاق ايزوفلواني لفتره النقاهة القصيرة وينبغي ان يؤخذ في الاعتبار كخيار تخدير بديل15.
ويبين الشكل 4مكان الوريد تحت الترقوة. بسبب الجدار رقيقه والضغط المنخفض في الوريد ، فان الجدار الامامي والخلفي من الوريد تحت الترقوة نعلق علي بعضها البعض تحت ضغط ابره في حين ان الابره تتحرك إلى الامام (الشكل 5A). في حين سحب المكبس ببطء إلى الوراء ، فان الجدران المرفقة منفصلة تلقائيا ، وغيض من ابره يمكن ان تدخل التجويف الحقيقي للسفينة والدم يمكن ان تستنزف في حقنه تحت ضغط سلبي مستمر (الشكل 5 ب). استخدام نظام جمع الدم الفراغي16 قد يفضل أيضا جمع الدم. بسبب القطر الصغير نسبيا من الوريد تحت الترقوة الفئران ، يمكن ان يكون هناك فشل حتى بالنسبة للمشغل من ذوي الخبرة. للمبتدئ ، ونحن نوصي ثقب الوريد تحت الترقوة في الفئران كما ذكرت11. بعد عده محاولات ثقب ناجحه في الفئران ، يمكن تعزيز معدل نجاح ثقب الوريد تحت الترقوة في الفئران بشكل كبير. تاكد من ان موقع ثقب الدقيق هو مجرد الذيليه إلى منتصف عظم الترقوة. الابره تتحرك صعودا والجمجمة إلى الحفرة القصيه متفوقة هي النقاط الرئيسية الأخرى لضمان ثقب ناجحه.
في الختام ، ثقب الوريد تحت الترقوة هو وسيله أمنه وفعاله لجمع الدم في الفئران. إلى جانب الذيل الوريد القطع والرجعية المدارية جمع الدم الضفيرة ، وهذا الأسلوب هو ممكن ، أمنه ، ومناسبه للبحوث المراقبة في عده نقاط الوقت في الفئران.
Disclosures
لم يعلن اي منها.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المنحة المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين رقم 81670269 ، رقم 81500355 ورقم 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
