Summary
在这里, 我们提出了一个从小鼠锁骨下静脉采集血液样本的方案。
Abstract
老鼠是研究人类疾病和人类健康的最重要的哺乳动物模型。然而, 在研究工作中, 从小鼠身上采集血液样本具有挑战性。当需要少量的血液样本时, 尾巴采血是一种流行的方法。如果需要大量的血液, 可以考虑轨道动脉, 但这种采血方法有伦理问题。以前, 我们通过大鼠锁骨下静脉穿刺法证明了采集血样的可行性和安全性, 并在此研究了该方法是否可用于小鼠。我们报告说, 这种方法对小鼠采血是安全和实用的。在日常研究工作中, 通过锁骨下静脉穿刺采血是一种简便的方法。
Introduction
在大多数研究实验室中, 从小鼠身上采集血液样本是必不可少的。小鼠采血的传统方法是在需要小于100μl 的样本时进行尾切1。然而, 如果在非末端时间点需要超过100μl 的血液, 眼眶后、下腔出血或胸下血液收集是最常用的技术2。在某些情况下, 采用颈静脉导管插入通过手术切口作为另一种方法3。
然而, 上述方法对小鼠有害。据我们所知, 由于潜在的并发症风险4,5,后眼眶法没有被广泛接受。操作相关的创伤不仅发生在可见区域6、7, 而且也发生在轨道深处6。此外, 下颌下采血压力为 8 , 可能与出血过多2,9有关。在我们之前的研究10,11的基础上, 我们介绍了一种新的策略, 从锁骨下静脉收集小鼠。介绍并讨论了该技术的安全性、可行性和获得的血量。
Protocol
本研究获得湘雅第二医院 (中国长沙) 中南大学动物研究伦理委员会批准。该手稿是根据 ARRIVE (动物研究: 活体实验报告) 指南 12编写的。
1. 材料和动物
- 准备所需材料: 75% 乙醇、胶带、脱毛剂、2毫升管、1.0 mL 注射器与针头连接 (26G)、电子秤、肝素和盐水 (见材料表)。
- 动物: 准备10只昆明小鼠, 6-8 大, 体重21.6-28.3 克 (见材料表)。根据《实验动物护理和使用指南》对小鼠进行维护。
2. 麻醉和动物定位
- 称重鼠标以计算所需的麻醉剂用量。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠 (60 mg/kg) 诱导全身麻醉 14 (图 1).在手术开始时使用无菌眼液中的润滑软膏, 以防止对暴露的眼睛造成损害。
注: 当没有运动反应的踏板退出反射, 尾巴捏, 或腹部皮肤捏, 被认为是充分麻醉。 - 将鼠标放在手术台上的仰角位置, 离工作台边缘2-4 厘米, 以方便静脉穿刺 (图 2)。将四肢固定在舒适的位置, 如图 2所示。整个过程不需要插管或机械通气。
- 用棉签在锁骨下空间周围涂上脱毛剂。
- 三分钟后, 用湿棉签清洗脱毛剂, 去除皮毛和任何可见的污垢。
- 用75% 乙醇消毒锁骨下空间, 然后用干净的纱布干燥。
3. 锁骨下静脉穿刺和采血
- 用手指识别锁骨骨和高级胸骨窝的位置。
- 找到靠近锁骨骨中间的穿刺部位, 并将其尾端到上。将左手食指侧向穿刺部位, 固定皮肤和皮下组织 (图 3)。
- 向上移动针头, 并向高级胸骨窝颅骨。针头进入皮下组织后, 将右手无名指向后移动, 形成负压 (图 3)。
注: 在此步骤中, 操作人员的右手的位置应略低于操作表, 以使针头向上移动, 并优于水平面。这就是为什么动物被放置在桌子边缘附近的原因。 - 将注射器向前移动3-4 毫米, 但如果没有血液流失到注射器中, 则停止。然后慢慢地收回注射器, 并保持负压。在大多数情况下, 血液在回吸时都会进入注射器。
- 血液进入注射器后, 请固定注射器并保持负压, 直到在注射器中收集所需体积 (200μl) 的血液。
- 采血后, 取出穿刺针, 用棉签轻轻按压穿刺部位1-2分钟以止血。然后, 让老鼠回到笼子里。
注: 偶尔, 一个人不能得到血液在他/她的第一次尝试。侧向调整针头的方向, 重复步骤 3.3-3.5。如果3次尝试未能获得血液样本, 切换到另一侧。 - 将血液样本转移到肝素化管中。
4. 小鼠恢复
- 在五巴比妥麻醉生效的同时, 通过提供热支持来恢复速度, 直到小鼠再次移动。
Representative Results
我们在10只昆明小鼠身上重复了这个过程 (雄性 n = 5, 雌性 n = 5, 体重25.4±2.0 克)。有九个程序在右侧成功。一个案件在3次尝试之内失败了在右边和血液收集成功在左边。时间过程 (从穿刺到获得所需的血量) 在 30-126秒 (平均684±26.4 秒) 之间。采血量设置为200Μl 左右 (平均 203±11.6μl)。血液收集在1到4次尝试之内成功了。血液采样成功在第一次尝试在两只小鼠和在一次小鼠的4次尝试以后;取样在其他小鼠身上进行了2-3 次尝试。所有数据见表 1。所有动物在血液取样后30分钟内存活和恢复。在所有观察到的参数中, 性别之间没有明显差异 (表 1)。
图 1: 腹腔内注射全身麻醉请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 鼠标的仰角位置.请注意, 边缘和鼠标之间的距离为2-4 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 操作人员手的穿刺部位和姿势.请注意, 右手无名指向后移动, 形成负压。左手被放置在穿刺部位的侧面, 以固定皮肤和皮下组织。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 锁骨下静脉、锁骨骨和胸骨上窝的位置.锁骨下静脉在锁骨下的锁骨下 , 在上胸骨窝入上腔静脉。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 手术过程中容器壁与针头的关系.(A) 当针头向前移动时, 锁骨下静脉的壁相互附着, 因此不能抽血。(B) 在向后拔针的同时 , 墙壁彼此分开 , 血液可以。请点击这里查看此图的较大版本.
| 变量 | 共计 (10) | 男性 (n捕捞 5) | 女 (n=5) | P 值 |
| 体重 (g) | 25.3±2。2 | 25.3±3。0 | 25.4±1。3 | 0.926 |
| 血量 (μL) | 203.0±11。6 | 208±13。0 | 1988±8。4 | 0.187 |
| 时间路线 | 684±26。4 | 70.6±35。1 | 662.±18。0 | 0.809 |
| 提款 | 2.3±0。9 | 2.4±1。1 | 2.2±0。8 | 0.760 |
| 所有观测参数、所有 P 值和 gt;0.05 均无显著性别差异。 | ||||
表 1: 观察到的性别参数
Discussion
本报告是以往通过大鼠11层下静脉穿刺进行血液取样研究的延伸.由于老鼠是最常用的研究动物, 看看这种技术是否也能应用于老鼠, 这将是很有价值的。挑战来自于锁骨下静脉的直径相对较小。
在目前的研究中, 我们发现小鼠锁骨下穿刺是一种可行、可靠的采血方式。与传统的方法, 如尾静脉切割或眼眶血液收集相比, 目前的方法不存在伦理问题。所有动物在这个过程后生存了没有液体补充剂大约200μl 的血液提取, 并且动物可用于进一步的实验研究。从理论上讲, 每次总样本量提取不能超过循环血总量的 1 0%, 成年动物的总体积为 5 5 至 7 0 mlkg 体重5。对于本研究中使用的小鼠 (21.6-28.3 克), 最大体积提取量应在200μl 左右。因此, 我们将每只老鼠的血液采样量设置在200μl 左右。无法测量血压、心率和其他压力参数是本报告的主要局限性。
充足的全身麻醉是保证穿刺成功的另一个重要问题。小鼠在穿刺过程中应保持安静, 以避免被针头伤害血管的风险。我们发现, 五巴比妥钠在 60 mgkg 的全身麻醉可以满足理想的麻醉深度。此代理的缺点是恢复时间相对较长 (平均约 30分钟)。在一些研究所, 吸入异氟醚的恢复时间很短, 应考虑作为替代麻醉选择15。
锁骨下静脉的位置如图 4所示。由于静脉的薄壁和低压, 在针头向前移动时, 锁骨下静脉的前壁和后壁会在针头的压力下相互附着 (图 5A)。当慢慢向后取出柱塞时 , 连接的壁将自发分离 , 针尖可以进入血管的真正腔 , 血液可以在持续的负压入注射器 (图 5B) 。使用真空血液收集系统16也可能有利于血液采集。由于小鼠锁骨下静脉的直径相对较小, 即使是有经验的操作人员也可能出现故障。对于新手, 我们建议在大鼠中穿刺锁骨下静脉, 如报告11。在大鼠多次成功穿刺后, 小鼠锁骨下静脉穿刺成功率可显著提高。确保确切的穿刺位置只是锁骨骨中间的尾端。针头向上移动, 颅骨向上移动到上胸骨窝是保证成功穿刺的其他关键点。
总之, 锁骨下静脉穿刺是一种安全有效的小鼠采血方法。该方法除尾静脉切割和后眼眶丛吸血外, 还具有可行性、安全性, 适用于小鼠在多个时间点的观测研究。
Disclosures
未声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金81670269、81500355号和81670269赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
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