Summary
Her præsenterer vi en protokol til at tage blodprøver fra subclavian vene af mus.
Abstract
Musen er den forreste pattedyr model for at studere menneskelige sygdomme og menneskers sundhed. Men, blodprøve indsamling fra mus er udfordrende i forskning arbejde. Hale blodindsamling er en populær metode, når en lille mængde blodprøve er nødvendig. Orbital arterien kunne overvejes, hvis en stor mængde blod er nødvendig, men denne blod indsamlingsmetode har etiske spørgsmål. Tidligere, vi demonstreret gennemførligheden og sikkerheden af blodprøve indsamling gennem subclavian vene punktering i rotter, og her undersøger vi, om denne metode kan bruges i mus. Vi rapporterer, at denne metode er sikker og praktisk for blod opsamling i mus. Blod opsamling gennem subclavian venepunktur i mus kan være en bekvem metode i daglige forskning værker.
Introduction
Blodprøve samling fra mus er afgørende i de fleste forskningslaboratorier. De konventionelle tilgange til blod opsamling i mus er hale skæring, når mindre end 100 μL af prøven er nødvendig1. Men hvis der er behov for mere end 100 μL blod på et ikke-terminale tidspunkt, er retroorbital, submandibulær blødning eller submental blod opsamling de hyppigst forekommende teknikker2. I nogle tilfælde blev den jugulære vene kateterisering gennem et kirurgisk indsnit vedtaget som en alternativ metode3.
Ikke desto mindre, de ovennævnte metoder er skadelige for mus. Efter vores bedste overbevisning, den retroorbital metode er ikke almindeligt accepteret på grund af den potentielle risiko for komplikationer4,5. Operation relaterede traumer ikke kun sker i det synlige område6,7, men også dybt inde i kredsløb6. Desuden er submandibulær blod opsamling stressende8 og kan være forbundet med overdreven blødning2,9. Baseret på vores tidligere forskning10,11, her introducerer vi en ny strategi for blod opsamling fra subclavian vene i mus. Sikkerhed, gennemførlighed, og opnået blodvolumen med denne teknik præsenteres og diskuteres.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af den centrale sydafrikanske Universitets etiske komité for dyreforskning fra det andet Xiangya Hospital (Changsha, Kina). Manuskriptet blev udarbejdet i overensstemmelse med retningslinjerne for "Animal Research: indberetning af in vivo-eksperimenter" ("dyreforsøg")12.
1. materiale og dyr
- Forbered nødvendige materialer: 75% ethanol, tape, epilatorhovedet agent, 2 ml rør, 1,0 ml sprøjte forbundet med nål (26g), elektronisk skala, heparin og saltvand (Se tabel over materialer).
- Dyr: Forbered 10 Kunming-mus, 6-8 uger gamle og vejer 21,6-28.3 g (Se tabel over materialer). Hold mus i overensstemmelse med guide til pleje og brug af forsøgsdyr13.
2. anæstesi og animalsk positionering
- Veje musen til at beregne den nødvendige dosis af bedøvelsesmiddel.
- Injicer natriumpentobarbital (60 mg/kg) gennem intraperitoneal injektion for at inducere generel anæstesi14 (figur 1). Påfør en steril øjen smøre salve ved procedurens begyndelse for at forhindre beskadigelse af udsatte øjne.
Bemærk: mus anses for at være tilstrækkeligt bedøvet, når der ikke viser nogen motor respons på afprøvning af pedal abstinens refleks, hale kniv eller abdominal hud knivspids. - Anbring musen i operationsbordet i en liggende position og 2-4 cm væk fra kanten af bordet for at lette vene punktering (figur 2). Fastgør lemmerne i en behagelig position som vist i figur 2. Der er ikke behov for intubation eller mekanisk ventilation i hele proceduren.
- Påfør epilerende middel omkring det infraclaviculære rum med en vatpind.
- Tre minutter senere, vask epilatorhovedet agent med en våd vatpind til at fjerne pels og eventuelle synlige snavs.
- Steriliser det infraclaviculære rum med 75% ethanol, og tør derefter med rent gaze.
3. subclavian venepunktur og blod opsamling
- Identificér placeringen af kravebenet og den overlegne brystbenet fossa med en finger.
- Find punkterings stedet tæt på midten af kravebenet og hale hullet til det. Anbring den venstre pegefinger i sideretningen på punkterings stedet for at fastgøre huden og det subkutane væv (figur 3).
- Flyt nålen opad og cranially mod den overlegne brystbenet fossa. Når nålen kommer ind i det subkutane væv, skal du flytte ringfingeren på højre hånd bagud for at danne et negativt tryk (figur 3).
Bemærk: i dette trin skal placeringen af operatørens højre hånd være lidt lavere end operationsbordet for at få nålen til at bevæge sig opad og overlegen i forhold til det vandrette plan. Derfor er dyret placeret nær kanten af bordet. - Flyt sprøjten frem 3-4 mm, men stop, hvis der ikke er blod dræn i sprøjten. Træk derefter langsomt sprøjten tilbage og hold det negative tryk i den. I de fleste tilfælde, blodet ville komme ind i sprøjten, når du trækker tilbage.
- Når blodet kommer ind i sprøjten, skal du fastgøre sprøjten og opretholde et negativt tryk, indtil den ønskede mængde (200 μL) blod opsamles i sprøjten.
- Efter blod opsamling, trække punkturnålen, og tryk på punkturstedet med en vatpind lidt i 1-2 minutter for at stoppe blødning. Vend derefter musene tilbage til buret.
Bemærk: lejlighedsvis, man kunne ikke få blodet på hans/hendes første forsøg. Juster nålens retning sidelæns, og Gentag trin 3.3-3.5. Hvis 3 forsøg undlader at få blodprøve, skifte til den anden side. - Blodprøven overføres til et hepariniseret rør.
4. mus opsving
- Mens pentobarbital anæstesi er i kraft, hastighed opsving ved at give varme støtte, indtil musen bevæger sig igen.
Representative Results
Vi gentog denne procedure i 10 Kunming mus (mand n = 5, kvindelig n = 5, vægt 25,4 ± 2,0 g). Ni procedurer lykkedes på højre side. En sag mislykkedes inden for 3 forsøg i højre side og blod opsamling lykkedes på venstre side. Tidsforløbet (fra punktering til opnåelse af påkrævet blodvolumen) varierede mellem 35-126 sekunder (gennemsnit 68,4 ± 26,4 s). Blod opsamlings volumenet blev sat til ca. 200 μL (gennemsnit 203 ± 11,6 μL). Blod opsamling lykkedes inden for 1 til 4 forsøg. Blodprøvetagning lykkedes på det første forsøg i to mus og efter 4 forsøg med en mus; prøveudtagningen tog 2-3 forsøg i de andre mus. Alle data blev illustreret i tabel 1. Alle dyr overlevede og genvundet inden for 30 minutter efter blodprøvetagning. Der var ingen signifikant forskel mellem kønnene for alle observerede parametre (tabel 1).
Figur 1 : Generel bedøvelse gennem intraperitoneal injektion Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Den liggende position af musen. Bemærk afstanden mellem margin og mus er 2-4 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Punkterings stedet og arbejdsstilling af operatørens hænder. Bemærk, at ring fingeren på højre hånd bevæger sig bagud for at danne et negativt tryk. Den venstre hånd er placeret lateral til punkturstedet for at fastsætte huden og subkutane væv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Placeringen af subclavian vene, kravebenet knoglen og den overlegne brystbenet fossa. De subclavian vene baner under kravebenet og dræner ind i den overlegne Vena cava under den overlegne brystbenet fossa. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Forholdet mellem fartøjets væg og nål under proceduren. A) væggene i den subclavianske vene fastgøres til hinanden, når nålen bevæger sig fremad, så der ikke kan trækkes blod ud. B) mens nålen trækkes tilbage, adskilles væggene fra hinanden, og blodet kan trækkes ud. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Variabel | I alt (n = 10) | Mand (n = 5) | Kvinde (n = 5) | P-værdi |
| Legemsvægt (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 af |
| Blodvolumen (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 af |
| Tidsforløb (r) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 af |
| Udbetalinger | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 af |
| Der var ingen signifikante kønsforskelle for alle observerede parametre, alle P-værdi > 0,05. | ||||
Tabel 1: observerede parametre mellem kønnene
Discussion
Denne rapport er en udvidelse af tidligere forskning i blodprøvetagning gennem subclavian venepunktur i rotter11. Da musen er den mest almindeligt anvendte forskning dyr, ville det være værdifuldt at se, om denne teknik også kan anvendes på mus. Udfordringen kommer fra den relativt mindre diameter af subclavian vene.
I den nuværende forskning, fandt vi, at subclavian punktering i mus er en gennemførlig og pålidelig måde at indsamle blod. Sammenlignet med de konventionelle metoder såsom hale vene skæring eller orbital blodindsamling, der er ingen etiske spørgsmål af den nuværende metode. Alle dyr overlevede efter denne procedure uden væsketilskud efter ca. 200 μL blod ekstraktion, og dyr kunne anvendes til yderligere eksperimentelle undersøgelser. Teoretisk set kunne den totale udsugning af prøvevolumen ikke nå op på mere end 10% af det totale cirkulerende blodvolumen hver gang, og det samlede rumfang af et voksent dyr er 55 til 70 mL/kg legemsvægt5. For de mus, der anvendes i denne forskning (21,6-28,3 g), bør den maksimale volumen ekstraktion være omkring 200 μL. Vi indstiller således blod prøvetagningsmængden omkring 200 μL for hver mus. Den manglende evne til at måle blodtryk, puls og andre stress parametre er de vigtigste begrænsninger i denne rapport.
Tilstrækkelig generel anæstesi er et andet vigtigt spørgsmål for at sikre en vellykket punktering. Musene skal forblive tavse under punkterings proceduren for at undgå risikoen for at beskadige beholderen ved nålen. Vi fandt, at pentobarbital natrium på 60 mg/kg for generel anæstesi kunne tilfredsstille ideelle dybde af anæstesi. En ulempe ved denne agent er den relativt lange restitutidstid (i gennemsnit ca. 30 minutter). I nogle institutter, isofluran inhalation anvendes til den korte restitueringstiden og bør tages i betragtning som en alternativ anæstesi valg15.
Placeringen af subclavian vene er vist i figur 4. På grund af den tynde væg og lavt tryk i vene, vil den forreste og bageste væg af subclavian vene binde sig til hinanden Undertrykket af en nål, mens nålen bevæger sig fremad (figur 5a). Mens stemplet trækkes langsomt bagud, adskilles de vedlagte vægge spontant, og spidsen af nålen kan trænge ind i skibets sande hulrum, og blodet kan løbe ind i sprøjten under vedvarende negativt tryk (figur 5b). Brug af et vakuum blod indsamlingssystem16 kan også favorisere blod indsamlingen. På grund af den relativt lille diameter af musene subclavian vene, kan der være fejl selv for en erfaren operatør. For en novice, anbefaler vi subclavian venepunktur i rotter som rapporteret11. Efter flere vellykkede punktering forsøg i rotter, kunne succesraten for subclavian venepunktur i mus blive signifikant forbedret. Sørg for, at den nøjagtige punkterings placering er lige hale til midten af kravebenet. Nålen bevæger sig opad og kranie til den overlegne brystbenet fossa er andre vigtige punkter for at sikre en vellykket punktering.
Afslutningsvis, subclavian venepunktur er en sikker og effektiv metode til blod opsamling i mus. Udover hale vene skæring og retro-orbital plexus blod opsamling, denne metode er gennemførlig, sikker, og velegnet til observationsundersøgelser på flere tidspunkter i mus.
Disclosures
Ingen erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskuddet fra National Natural Science Foundation i China No. 81670269, No. 81500355 og No. 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
