Summary
Здесь мы представляем протокол, чтобы взять пробы крови из подключичной вены мышей.
Abstract
Мышь является передовой моделью млекопитающих для изучения болезней человека и здоровья человека. Тем не менее, сбор образцов крови от мышей является сложной задачей в исследовательской работе. Сбор крови хвоста является популярным методом, когда требуется небольшое количество образца крови. Орбитальная артерия может быть рассмотрена, если требуется большое количество крови, но этот метод сбора крови имеет этические проблемы. Ранее мы продемонстрировали осуществимость и безопасность сбора образцов крови путем пункции подключичной вены у крыс, и здесь мы исследуем, можно ли использовать этот метод у мышей. Мы сообщаем, что этот метод является безопасным и практичным для сбора крови у мышей. Сбор крови через прокол подключичной вены у мышей может быть удобным методом в ежедневных исследовательских работах.
Introduction
Сбор образцов крови у мышей имеет важное значение в большинстве исследовательских лабораторий. Обычные подходы для сбора крови у мышей является хвост резки, когда менее 100 мкл образца требуется1. Однако, если требуется более 100 мкл крови на нетерминальной временной точке, то ретроорбитальные, поднижнечелюстно-челюстно-кровяной крови являются наиболее часто рассматривыываенними методами2. В некоторых случаях, яремной вены катетеризации через хирургический разрез был принят в качестве альтернативного метода3.
Тем не менее, вышеуказанные методы вредны для мышей. Насколько нам известно, ретроорбитальный метод широко не принимается из-за потенциального риска осложнений4,5. Операции, связанные травмы не только происходит в видимой области6,7, но и глубоко внутри орбиты6. Кроме того, подмандибулярный сбор крови является стрессовым8 и может быть связан с чрезмерным кровотечением2,9. Основываясь на нашем предшествующее исследование10,11, здесь мы представляем новую стратегию для сбора крови из подключичной вены на мышах. Безопасность, осуществимость, и полученный объем крови с этим методом представлены и обсуждаются.
Protocol
Это исследование было одобрено Комитетом центрального Южного университета по этике исследований животных из второй больницы сангья (Чанша, Китай). Рукопись была подготовлена по ПРИБЫТИИ (исследования животных: отчетность в экспериментах в естественных условиях) руководящие принципы12.
1. материальные и животные
- Подготовьте необходимые материалы: 75% этанола, клейкую ленту, эпиляции, 2 мл трубки, 1,0 мл шприца, связанного с иглой (26G), электронную шкалу, гепарин и солевой раствор (см. таблицу материалов).
- Животные: Подготовьте 10 Куньмин мышей, 6-8 недель и весом 21.6-28.3 g (см. таблицу материалов). Поддержание мышей в соответствии с руководством по уходу и использованию лабораторных животных13.
2. анестезия и позиционирование животных
- Взвешивание мыши для расчета требуемой дозы обезболивающего агента.
- Впрыснуть натрия Пентобарбитал (60 мг/кг) через интраперитонеальная инъекцию, чтобы побудить общей анестезии14 (рис. 1). Применить стерильные мазь смазки глаза в начале процедуры, чтобы предотвратить повреждение подвергаются глаза.
Примечание: мыши считаются достаточно обезболиваются при показе без двигателя ответ на тестирование педаль рефлекс снятия, хвост щепотку, или брюшной щепотку кожи. - Поместите мышь в таблице операций в положении лежа и 2-4 см от края стола, чтобы облегчить прокол Вены (рис. 2). Закрепите конечности в удобном положении, как показано на рисунке 2. Никакая интубации или механическая вентиляция не необходимы в всей процедуре.
- Нанесите эпиляции на инфаклакулярный космический тампон с ватным тампоном.
- Три минуты спустя, мыть эпиляции агента с мокрой ватным тампоном, чтобы удалить мех и любой видимой грязи.
- Стерилизовать инфлалавкулярного пространства с 75% этанола, а затем сухой с чистой марлей.
3. пункция подключичной вены и сбор крови
- Определите местонахождение кости ключицы и превосходной ямки с пальцем.
- Найдите место прокола близко к середине кости ключицы и прихвостни к нему. Положите левый указательный палец сбоку к месту прокола, чтобы зафиксировать кожу и подкожную ткань (рис. 3).
- Переместите иглу вверх и краниально к превосходящей стернальной ямке. Как только игла попадает в подкожную ткань, переместите безымянный палец правой руки назад, чтобы сформировать негативное давление (Рисунок 3).
Примечание: на этом этапе положение правой руки оператора должно быть несколько ниже, чем в таблице операций, чтобы сделать иглу двигаться вверх и выше горизонтальной плоскости. Именно поэтому животное помещается рядом с краем стола. - Переместите шприц вперед 3-4 мм, но остановить, если нет утечки крови в шприц. Затем медленно вернуть шприц и сохранить негативное давление в нем. В большинстве случаев, кровь войдет в шприц при составлении назад.
- После того, как кровь поступает в шприц, исправьте шприц и поддерживайте негативное давление до тех пор, пока в шприце не будет собран необходимый объем крови (200 мкл).
- После сбора крови, снять пункцию иглы, и нажмите на месте прокола с ватным тампоном немного в течение 1-2 минут, чтобы остановить кровотечение. Затем верните мышей в клетку.
Примечание: изредка, одно не смогло получить кровь на его/ее первой попытке. Отрегулируйте направление иглы сбоку и повторите шаги 3,3-3.5. Если 3 попытки не в состоянии получить образец крови, переключиться на другую сторону. - Перенесите образец крови в гепаринизированный тюбик.
4. мыши восстановления
- Хотя пентобарбитальной анестезии в силе, скорость восстановления, обеспечивая тепловую поддержку, пока мышь движется снова.
Representative Results
Мы повторили эту процедуру в 10 Куньмин мышей (мужчины n = 5, женщины n = 5, вес 25,4 ± 2,0 г). Девять процедур удалось на правой стороне. Один случай потерпел неудачу в пределах 3 попыток в правой стороне и собрание крови преуспетое на левой стороне. Время курса (от пункции до получения необходимого объема крови) колебался между 35-126 секунды (в среднем 68,4 ± 26,4 s). Объем сбора крови составлял около 200 мкл (в среднем 203 ± 11,6 мкл). Сбор крови удалось в течение 1 до 4 попыток. Пробы крови преуспели на первой попытке в 2 мышах и после 4 попыток в одной мыши; выборка приняла 2-3 попыток в других мышей. Все данные были проиллюстрированы в таблице 1. Все животные выжили и восстановились в течение 30 минут после взятия пробы крови. Не существует существенной разницы между полами по всем наблюдаемым параметрам (Таблица 1).
Рисунок 1 : Общая анестезия через интраперитонеальная инъекцию Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : В положении лежа мыши. Обратите внимание, что расстояние между маржой и мышью составляет 2-4 см. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 : Место прокола и поза рук оператора. Обратите внимание, что безымянный палец правой руки перемещается назад, чтобы сформировать негативное давление. Левая рука размещается сбоку от места прокола, чтобы зафиксировать кожу и подкожную ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4 : Расположение подключичной вены, кости ключицы и превосходной ямки. Подключичной вены курсы под кости ключицы и стоков в превосходную полую вену под начальника стернал ямки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 5 : Связь между стенкой сосуда и иглой во время процедуры. А) стены подключичной вены прикрепляются друг к другу по мере движения иглы вперед, так что кровь не может быть нарисована. (B) при выводе иглы назад, стены отделены друг от друга, и кровь может быть нарисована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
| Переменной | Всего (n = 10) | Мужчина (n = 5) | Женский (n = 5) | P значение |
| Масса тела (г) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 |
| Объем крови (мкл) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 |
| Время курса (ы) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 |
| Снятия | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 |
| Существовали никаких существенных различий пола для всех наблюдаемых параметров, все P значение > 0. | ||||
Таблица 1: наблюдаемые параметры между полами
Discussion
Этот отчет представляет собой продолжение предыдущих исследований по выборке крови через пункцию подключичной вены у крыс11. Как мышь является наиболее часто используемых исследований животного, было бы полезно увидеть, если этот метод может быть применен и к мышам. Проблема исходит из относительно меньшего диаметра подключичной вены.
В настоящем исследовании, мы обнаружили, что подпункция птиц в мышей является реальным и надежным способом сбора крови. По сравнению с обычными методами, такими как резка хвостовых вен или Орбитальная кровоснабжение, не существует этических проблем настоящего метода. Все животные выжили после этой процедуры без жидких добавок после около 200 мкл крови, и животные могут быть использованы для дальнейших экспериментальных исследований. Теоретически, общий объем извлечения выборки не может достигать более 10% от общего объема циркулирующего крови каждый раз, и общий объем взрослого животного составляет от 55 до 70 мл/кг массы тела5. Для мышей, используемых в этом исследовании (21.6-28.3 g), максимальная объем добычи должно быть около 200 мкл. Таким образом, мы установили забор крови около 200 мкл для каждой мыши. Неспособность измерить кровяное давление, частоту сердечных сокращений и другие параметры стресса являются основными ограничениями этого отчета.
Достаточно общей анестезии является еще одним важным вопросом, чтобы гарантировать успех пункции. Во время процедуры прокола мыши должны оставаться спокойными, чтобы избежать риска травмирования сосуда иглой. Мы обнаружили, что Пентобарбитал натрия в 60 мг/кг для общей анестезии может удовлетворить идеальную глубину анестезии. Недостатком этого агента является относительно длительное время восстановления (в среднем около 30 минут). В некоторых институтах вдыхания изофлуран используется для короткого времени восстановления и должны быть приняты во внимание в качестве альтернативного выбора анестезии15.
Местонахождение подключичной вены показано на рисунке 4. Из-за тонкой стены и низкого давления в Вене передняя и задняя стенки подключичной вены прикрепляются друг к другу под давлением иглы, в то время как игла движется вперед (рис. 5A). В то время как снятие плунжера медленно назад, прикрепленные стены отделятся спонтанно, и кончик иглы может войти в истинную полость сосуда и кровь может стечь в шприц под устойчивым отрицательным давлением (Рисунок 5B). Использование вакуумной системы сбора крови16 также может способствовать сбору крови. Из-за относительно небольшого диаметра мыши подключичной вены, не может быть неудачи даже для опытного оператора. Для новичка, мы рекомендуем подкол в подключичной вен крыс, как сообщили11. После нескольких успешных попыток прокола у крыс, успех скорость пункции подключичной вены у мышей может быть значительно повышена. Убедитесь, что точное местоположение прокола просто хвостовой к середине кости ключицы. Игла движется вверх и черепной к превосходной ямки являются другие ключевые моменты, чтобы гарантировать успешное прокол.
В заключении, пункция подключичной вены является безопасным и эффективным методом сбора крови у мышей. Помимо резки хвостовой Вены и ретро-орбитального сплетения крови, этот метод является осуществимым, безопасным и подходящим для обсервационных исследований в нескольких временных точках у мышей.
Disclosures
Никто не объявлен.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом национального фонда естественных наук Китая No 81670269, No 81500355 и No 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
