Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att ta blodprover från den subclavia venen av möss.
Abstract
Musen är den främsta däggdjurs modellen för att studera sjukdomar hos människor och människors hälsa. Blod provs insamling från möss är dock utmanande i forsknings arbetet. Svans blod insamling är en populär metod när en liten mängd blod prov behövs. Orbital artär kan övervägas om en stor mängd blod behövs men denna blod insamlings metod har etiska frågor. Tidigare visade vi genomförbarheten och säkerheten av blod prov insamling genom subclavia ven punktering hos råttor, och här undersöker vi om denna metod kan användas i möss. Vi rapporterar att denna metod är säker och praktisk för blod insamling hos möss. Blod insamling genom subclavia ven punktering hos möss kan vara en bekväm metod i dagliga forsknings arbeten.
Introduction
Blod prov insamling från möss är viktigt i de flesta forsknings laboratorier. Konventionella metoder för blod insamling hos möss är svans skärning när mindre än 100 μL av provet behövs1. Men, om mer än 100 μL blod krävs vid en nonterminal tid punkt, retroorbital, submandibular blödning eller submental blod insamling är de mest allmänt anses tekniker2. I vissa fall, den jugular ven kateterisering genom ett kirurgiskt snitt antogs som en alternativ metod3.
Trots ovanstående metoder är skadliga för möss. Såvitt vi vet är retroorbital-metoden inte allmänt accepterad på grund av den potentiella risken för komplikationer4,5. Operation relaterade trauma inte bara sker i det synliga området6,7, men också djupt inne i omlopps bana6. Dessutom är submandibular blod insamling stressigt8 och kan associeras med överdriven blödning2,9. Baserat på vår tidigare forskning10,11, här introducerar vi en ny strategi för blod insamling från subclavia ven hos möss. Säkerheten, genomförbarheten, och erhållna blod volym med denna teknik presenteras och diskuteras.
Protocol
Denna studie godkändes av central South University etik kommittén för djur forskning från andra Xiangya Hospital (Changsha, Kina). Manuskriptet utarbetades enligt ANLÄND (Animal Research: rapportering av in vivo experiment) rikt linjer12.
1. material och djur
- Förbered material som krävs: 75% etanol, tejp, epileringsmedel, 2 mL tub, 1,0 mL spruta i samband med nål (26G), elektronisk skala, Heparin och saltlösning (se material tabell).
- Djur: Förbered 10 Kunming möss, 6-8 veckor gamla och väger 21,6-28,3 g (se tabell över material). Underhåll möss i enlighet med hand boken för skötsel och användning av försöks djur13.
2. anestesi och djur positionering
- Väg musen för att beräkna den erforderliga doseringen av anestesi medel.
- Injicera natriumpentobarbital (60 mg/kg) genom intraperitoneal injektion för att inducera generell anestesi14 (figur 1). Applicera en steril ögon smörjning salva i början av förfarandet för att förhindra skador på exponerade ögon.
Obs: möss anses vara tillräckligt bedövade när visar ingen motor svar på testning av pedal abstinens reflex, svans nypa, eller buken huden nypa. - Placera musen i Operations bordet i en liggande position och 2-4 cm bort från kanten av bordet för att under lätta åder punktering (figur 2). Fäst armar och ben i en bekväm position som visas i figur 2. Ingen intubation eller mekanisk ventilation behövs i hela proceduren.
- Applicera epilering agent runt infraclavicular utrymme med en bomulls pinne.
- Tre minuter senare, tvätta epilering agent med en våt bomulls pinne för att ta bort pälsen och eventuell synlig smuts.
- Sterilisera infraclavicular utrymme med 75% etanol och sedan torka med ren gasväv.
3. subclavian åder punktering och blod insamling
- Identifiera placeringen av nyckelbenet ben och överlägsen Sternal fossa med ett finger.
- Lokalisera punkteringsstället nära mitten av nyckelbenet ben och stjärtfenan till den. Placera det vänstra pekfingret lateralt till punkteringsstället att fixa huden och subkutan vävnad (figur 3).
- Flytta nålen uppåt och cranially mot den överlägsna Sternal fossa. När nålen kommer in i subkutan vävnad, flytta ring fingret på höger hand bakåt för att bilda ett negativt tryck (figur 3).
Obs: under detta steg bör positionen för operatörens högra hand vara något lägre än Operations bordet för att få nålen att röra sig uppåt och överlägset horisontal planet. Det är därför djuret placeras nära kanten av bordet. - Flytta sprutan framåt 3-4 mm men sluta om det inte finns någon blod avrinning i sprutan. Sedan sakta dra tillbaka sprutan och hålla ett negativt tryck i den. I de flesta fall skulle blodet komma in i sprutan när du drar tillbaka.
- När blodet kommer in i sprutan, fixera sprutan och behåll det negativa trycket tills önskad volym (200 μL) blod samlas i sprutan.
- Efter blod insamling, dra upp punkteringsnålen och tryck på punkteringsstället med en bomullstuss något i 1-2 minuter för att stoppa blödningen. Sedan, tillbaka möss till buren.
Obs: ibland kunde man inte få blod vid sitt första försök. Justera nålens riktning i sidled och upprepa steg 3.3-3.5. Om 3 försök Miss lyckas med att få blod prov, Byt till den andra sidan. - Överför blod provet till ett hepariniserat rör.
4. återhämtning av möss
- Medan pentobarbital anestesi är i kraft, hastighet återhämtning genom att ge värme stöd tills musen rör sig igen.
Representative Results
Vi upprepade detta förfarande i 10 Kunming möss (hane n = 5, hona n = 5, vikt 25,4 ± 2,0 g). Nio förfaranden lyckades på höger sida. Ett fall misslyckades inom 3 försök på höger sida och blod insamling lyckades på vänster sida. Tids förloppet (från punktering till erhållande av erforderlig blod volym) varierade mellan 35-126 sekunder (i genomsnitt 68,4 ± 26,4 s). Blod uppsamlings volymen sattes till cirka 200 μL (i genomsnitt 203 ± 11,6 μL). Blod samling lyckades inom 1 till 4 försök. Blod provs tagningen lyckades på det första försöket på två möss och efter 4 försök med en mus; provtagningen tog 2-3 försök i de andra mössen. Alla data illustrerades i tabell 1. Alla djur överlevde och tillfrisknat inom 30 minuter efter blod provs tagningen. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan könen för alla observerade parametrar (tabell 1).
Figur 1 : Generell anestesi genom intraperitoneal injektion Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Den liggande positionen av musen. Notera avståndet mellan marginal och mus är 2-4 cm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Punkteringsstället och hållning av operatörens händer. Observera att ring fingret på höger hand rör sig bakåt för att bilda ett negativt tryck. Den vänstra handen är placerad i sidled till punkteringsstället att fixa huden och subkutana vävnader. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Placeringen av subclavia ven, nyckelbenet ben och överlägsen Sternal fossa. Den subclavia ven kurser under nyckelbenet ben och rinner ut i den överlägsna Vena Cava under den överlägsna Sternal fossa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Förhållandet mellan kärl väggen och nålen under ingreppet. (A) väggarna i subclavia ven fäster varandra som nålen rör sig framåt, så inget blod kan dras ut. (B) samtidigt dra tillbaka nålen bakåt, väggarna åtskilda från varandra och blodet kunde dras ut. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Variabel | Totalt (n = 10) | Hane (n = 5) | Hona (n = 5) | P-värde |
| Kropps vikt (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 |
| Blod volym (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 |
| Tid kurs (er) | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 |
| Uttag | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 |
| Det fanns inga signifikanta köns skillnader för alla observerade parametrar, P-värde > 0,05. | ||||
Tabell 1: observerade parametrar mellan könen
Discussion
Denna rapport utgör en förlängning av tidigare forskning om blod prov tagning genom subclavia ven punktering hos råttor11. Eftersom musen är den mest använda forsknings djuret, skulle det vara värdefullt att se om denna teknik kan också tillämpas på möss. Utmaningen kommer från den relativt mindre diametern av den subclavia venen.
I den nuvarande forskningen fann vi att subclavia punktering hos möss är ett genomförbart och tillförlitligt sätt att samla blod. Jämfört med konventionella metoder såsom svans ven skärning eller orbital blod insamling, det finns inga etiska frågor av den nuvarande metoden. Alla djur överlevde efter detta förfarande utan flytande kost tillskott efter cirka 200 μL av blod utvinning, och djur skulle kunna användas för ytterligare experimentella studier. Teoretiskt sett kunde den totala prov volymens extraktion inte uppgå till mer än 10% av den totala cirkulerande blod volymen varje gång och den totala volymen av ett vuxet djur är 55 till 70 mL/kg kropps vikt5. För möss som används i denna forskning (21,6-28,3 g), bör den maximala volymen extraktion vara runt 200 μL. Vi ställer därför in blod provs beloppet runt 200 μL för varje mus. Oförmågan att mäta blod tryck, hjärt frekvens, och andra stress parametrar är de viktigaste begränsningarna i denna rapport.
Tillräcklig generell anestesi är en annan viktig fråga för att garantera framgången för punkteringen. Mössen bör förbli tysta under punkteringsprocessen för att undvika risken för att skada kärlet genom nålen. Vi fann att pentobarbital natrium vid 60 mg/kg för generell anestesi kunde tillfredsställa ideal djup anestesi. En nackdel med denna agent är den relativt långa återhämtnings tiden (i genomsnitt ca 30 minuter). I vissa institut används isofluran inandning för den korta återhämtnings tiden och bör tas i beaktande som ett alternativt anestesi val15.
Placeringen av subclavia ven visas i figur 4. På grund av den tunna väggen och lågt tryck i venen, den främre och bakre väggen i subclavia ven skulle fästa vid varandra under trycket av en nål medan nålen rör sig framåt (figur 5a). Medan dra tillbaka kolven långsamt bakåt, kommer de bifogade väggarna separera spontant, och spetsen av nålen kan komma in i den sanna kaviteten av kärlet och blod kan rinna in i sprutan under ihållande negativt tryck (Figur 5b). Användning av ett vakuum blod insamlings system16 kan också gynna blod samlingen. På grund av den relativt lilla diametern hos mössen subclavia ven, det kan finnas misslyckanden även för en erfaren operatör. För en nybörjare, vi rekommenderar subclavia ven punktering hos råttor som rapporterades11. Efter flera lyckade punkteringsförsök hos råttor kunde framgångs graden av subclavia venpunktering hos möss förbättras avsevärt. Se till att den exakta punkteringsstället är bara stjärtfenan till mitten av nyckelbenet ben. Nålen rör sig uppåt och kranial till den överlägsna Sternal fossa är andra viktiga punkter för att garantera en lyckad punktering.
Sammanfattnings vis, subclavia ven punktering är en säker och effektiv metod för blod insamling hos möss. Förutom svans ven skärning och retro-orbital plexus blod insamling, denna metod är genomförbar, säker, och lämplig för observationella undersökningar vid flera tidpunkter i möss.
Disclosures
Ingen deklarerad.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidraget från National Natural Science Foundation i Kina nr 81670269, nr 81500355 och nr 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
