Summary
Ici, nous présentons un protocole pour prélever des échantillons sanguins de la veine subclavienne des souris.
Abstract
La souris est le principal modèle de mammifères pour l’étude des maladies humaines et de la santé humaine. Cependant, la collecte d’échantillons de sang de souris est difficile dans les travaux de recherche. La collecte de sang de queue est une méthode populaire quand une petite quantité d’échantillon sanguin est nécessaire. L’artère orbitale pourrait être envisagée si une grande quantité de sang est nécessaire, mais cette méthode de prélèvement sanguin a des problèmes éthiques. Autrefois, nous avons démontré la faisabilité et la sécurité de la collecte des échantillons de sang par ponction de veine sous-clavière chez le rat, et nous étudions ici si cette méthode pourrait être utilisée chez la souris. Nous rapmettons que cette méthode est sûre et pratique pour la collecte de sang chez la souris. La collecte de sang par la perforation de la veine subclavienne chez la souris peut être une méthode pratique dans les travaux de recherche quotidiens.
Introduction
La collecte des échantillons sanguins de souris est essentielle dans la plupart des laboratoires de recherche. Les approches conventionnelles pour la collecte de sang chez les souris sont la coupe de la queue lorsque moins de 100 μL d’échantillon est nécessaire1. Cependant, si plus de 100 μl de sang sont nécessaires à un point de temps non terminal, les techniques de prélèvement rétroorbital, de saignement sous-mandibulaire ou de sang mentonnier sont les plus couramment considérées2. Dans certaines occasions, le cathétérisme de la veine jugulaire par une incision chirurgicale a été adopté comme méthode alternative3.
Néanmoins, les méthodes ci-dessus sont nuisibles pour les souris. Au meilleur de notre connaissance, la méthode rétroorbitale n’est pas largement acceptée en raison du risque potentiel de complications4,5. Le traumatisme lié à l’opération se produit non seulement dans la zone visible6,7, mais aussi au fond de l’orbite6. En outre, la collecte de sang sous-mandibulaire est stressante8 et pourrait être associée à un saignement excessif de2,9. Sur la base de nos recherches antérieures10,11, nous introduisons ici une nouvelle stratégie de prélèvement sanguin de la veine subclavienne chez la souris. La sécurité, la faisabilité et le volume sanguin obtenu avec cette technique sont présentés et discutés.
Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université centrale du Sud pour la recherche animale du second Xiangya Hospital (Changsha, Chine). Le manuscrit a été préparé selon les directives d’arrivée (recherche animale: rapports d’expériences in vivo)12.
1. matériel et animal
- Préparer les matériaux requis: 75% éthanol, ruban adhésif, agent d’épilation, tube de 2 mL, seringue de 1,0 mL reliée à l’aiguille (26G), à l’échelle électronique, à l’héparine et à la solution saline (voir tableau des matériaux).
- Animaux: Préparez 10 souris Kunming, âgées de 6-8 semaines et pesant 21,6 à 28,3 g (voir tableau des matériaux). Maintenir les souris conformément au guide pour l’entretien et l’utilisation des animaux de laboratoire13.
2. anesthésie et positionnement des animaux
- Peser la souris pour calculer la posologie requise de l’agent anesthésique.
- Injecter du pentobarbital de sodium (60 mg/kg) par injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie générale14 (figure 1). Appliquez une pommade de lubrification oculaire stérile au début de la procédure pour éviter d’endommager les yeux exposés.
Remarque: les souris sont considérées comme suffisamment anesthésiées lorsqu’elles ne montrent aucune réponse motrice à l’essai du réflexe de retrait de la pédale, du pincement de queue ou de la pincée abdominale. - Placez la souris dans la table d’opération en position décubitus dorsal et à 2-4 cm du bord de la table pour faciliter la perforation veineuse (figure 2). Fixez les membres dans une position confortable comme illustré à la figure 2. Aucune intubation ou ventilation mécanique n’est nécessaire dans l’ensemble de la procédure.
- Appliquez un agent épilateur autour de l’espace infraclaviculaire avec un coton-tige.
- Trois minutes plus tard, lavez l’agent épilateur avec un coton-tige humide pour enlever la fourrure et toute saleté visible.
- Stériliser l’espace infraclaviculaire avec 75% d’éthanol puis sécher avec de la gaze propre.
3. ponction veineuse subclavienne et prélèvement sanguin
- Identifiez l’emplacement de l’os de la clavicule et de la fosse sternale supérieure avec un doigt.
- Localisez le site de ponction près du milieu de l’os de la clavicule et caudale à elle. Placer l’index gauche latéralement sur le site de ponction pour fixer la peau et le tissu sous-cutané (figure 3).
- Déplacez l’aiguille vers le haut et la crânienne vers la fosse sternale supérieure. Une fois que l’aiguille pénètre dans le tissu sous-cutané, déplacez l’annulaire de la main droite vers l’arrière pour former une pression négative (figure 3).
Remarque: au cours de cette étape, la position de la main droite de l’opérateur doit être légèrement inférieure à la table d’opération pour faire bouger l’aiguille vers le haut et supérieure au plan horizontal. C’est pourquoi l’animal est placé près du bord de la table. - Déplacez la seringue vers l’avant 3-4 mm mais arrêtez s’il n’y a pas de fuite de sang dans la seringue. Ensuite, tirez lentement la seringue et maintenez la pression négative en elle. Dans la plupart des cas, le sang entrerait dans la seringue lors du retrait.
- Une fois que le sang pénètre dans la seringue, fixez la seringue et maintenez la pression négative jusqu’à ce que le volume requis (200 μL) de sang soit prélevé dans la seringue.
- Après prélèvement sanguin, retirer l’aiguille de perforation et presser légèrement le site de ponction avec un coton-tige pendant 1-2 minutes pour arrêter le saignement. Ensuite, retournez les souris à la cage.
Remarque: occasionnellement, on ne pouvait pas obtenir le sang lors de sa première tentative. Ajustez la direction de l’aiguille latéralement et répétez les étapes 3.3-3.5. Si 3 tentatives ne parviennent pas à obtenir l’échantillon sanguin, passez de l’autre côté. - Transférer l’échantillon sanguin dans un tube hépariné.
4. récupération des souris
- Alors que l’anesthésie pentobarbital est en vigueur, la récupération de la vitesse en fournissant un soutien thermique jusqu’à ce que la souris se déplace à nouveau.
Representative Results
Nous avons répété cette procédure chez 10 souris Kunming (mâle n = 5, femelle n = 5, poids 25,4 ± 2,0 g). Neuf procédures ont réussi sur le côté droit. Un cas a échoué dans les 3 tentatives dans le côté droit et la collecte de sang a réussi sur le côté gauche. Le cours de temps (de la perforation à l’obtention du volume sanguin requis) variait entre 35-126 secondes (moyenne 68,4 ± 26,4 s). Le volume de prélèvement sanguin a été fixé à environ 200 μL (moyenne 203 ± 11,6 μL). La collecte de sang a réussi dans 1 à 4 tentatives. L’échantillonnage sanguin a réussi à la première tentative de deux souris et après 4 tentatives d’une souris; l’échantillonnage a pris 2-3 tentatives chez les autres souris. Toutes les données ont été illustrées dans le tableau 1. Tous les animaux ont survécu et récupérés dans les 30 minutes suivant l’échantillonnage sanguin. Il n’y a pas de différence significative entre les sexes pour tous les paramètres observés (tableau 1).
Figure 1 : Anesthésie générale par injection intrapéritonéale S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : La position décubitus dorsal de la souris. Notez la distance entre la marge et la souris est 2-4 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le site de ponction et la posture des mains de l’opérateur. Notez que l’annulaire de la main droite se déplace vers l’arrière pour former une pression négative. La main gauche est placée latéralement au site de ponction pour fixer la peau et les tissus sous-cutanés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : L’emplacement de la veine subclavienne, de la clavicule et de la fosse sternale supérieure. Les cours de veine sous-clavière sous l’os de la clavicule et s’écoule dans la veine cave supérieure sous la fosse sternale supérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : La relation entre la paroi du navire et l’aiguille pendant la procédure. (A) les parois de la veine subclavienne s’attachent l’une à l’autre à mesure que l’aiguille se déplace vers l’avant, de sorte qu’aucun sang ne peut être prélevé. (B) tout en retirant l’aiguille vers l’arrière, les parois se séparent les unes des autres et le sang peut être prélevé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| variable | Total (n = 10) | Mâle (n = 5) | Femelle (n = 5) | Valeur P |
| Poids corporel (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 |
| Volume sanguin (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 |
| Cours (s) de temps | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 |
| Retraits | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 |
| Il n’y avait pas de différences significatives entre les sexes pour tous les paramètres observés, toutes les valeurs P > 0,05. | ||||
Tableau 1: paramètres observés entre les sexes
Discussion
Ce rapport représente une extension des recherches antérieures sur l’échantillonnage sanguin par la perforation de la veine subclavienne chez le rat11. Comme la souris est l’animal de recherche le plus couramment utilisé, il serait utile de voir si cette technique peut également être appliquée à des souris. Le défi provient du diamètre relativement plus petit de la veine subclavienne.
Dans les recherches actuelles, nous avons constaté que la ponction subclavienne chez la souris est un moyen faisable et fiable de collecter du sang. Par rapport aux méthodes conventionnelles telles que la coupe de veine de queue ou la collecte de sang orbital, il n’y a pas de questions éthiques de la méthode actuelle. Tous les animaux ont survécu après cette procédure sans suppléments liquides après environ 200 μL d’extraction sanguine, et les animaux pourraient être utilisés pour d’autres études expérimentales. Théoriquement, l’extraction totale du volume d’échantillonnage n’a pas pu atteindre plus de 10% du volume sanguin circulant total à chaque fois et le volume total d’un animal adulte est de 55 à 70 mL/kg de poids corporel5. Pour les souris utilisées dans cette recherche (21,6-28,3 g), l’extraction du volume maximal devrait être d’environ 200 μL. Nous avons donc fixé la quantité d’échantillonnage sanguin autour de 200 μL pour chaque souris. L’incapacité de mesurer la pression artérielle, la fréquence cardiaque et d’autres paramètres de stress sont les principales limitations de ce rapport.
Une anesthésie générale suffisante est une autre question importante pour garantir le succès de la ponction. Les souris doivent rester calmes pendant la procédure de perforation pour éviter le risque de blesser le récipient par l’aiguille. Nous avons constaté que le pentobarbital sodique à 60 mg/kg pour l’anesthésie générale pourrait satisfaire la profondeur idéale de l’anesthésie. Un inconvénient de cet agent est le temps de récupération relativement long (moyenne d’environ 30 minutes). Dans certains instituts, l’inhalation d’isoflurane est utilisée pour le temps de récupération court et doit être prise en considération comme choix d’anesthésie alternative15.
L’emplacement de la veine subclavienne est illustré à la figure 4. En raison de la paroi mince et de la faible pression dans la veine, la paroi antérieure et postérieure de la veine subclavienne se rattachait l’une à l’autre sous la pression d’une aiguille pendant que l’aiguille se déplace vers l’avant (figure 5A). Tout en retirant le piston lentement vers l’arrière, les parois attachées se sépareront spontanément, et la pointe de l’aiguille pourrait pénétrer dans la véritable cavité du vaisseau et le sang pourrait s’écouler dans la seringue sous une pression négative soutenue (figure 5B). Utilisation d’un système de prélèvement sanguin sous vide16 pourrait également favoriser la collecte de sang. En raison du diamètre relativement faible de la veine sous-clavière de souris, il peut y avoir des défaillances même pour un opérateur expérimenté. Pour un novice, nous recommandons la ponction veineuse subclavienne chez le rat comme rapporté11. Après plusieurs tentatives de ponction réussies chez les rats, le taux de réussite de la perforation de la veine subclavienne chez la souris pourrait être significativement amélioré. Assurez-vous que l’emplacement exact de la perforation est juste caudale au milieu de l’os de la clavicule. L’aiguille se déplaçant vers le haut et crânien à la fosse sternale supérieure sont d’autres points clés pour garantir une ponction réussie.
En conclusion, la ponction veineuse subclavienne est une méthode sûre et efficace pour la collecte de sang chez la souris. Outre la coupe de veine de queue et la collecte de sang de plexus rétro-orbitale, cette méthode est faisable, sûre, et appropriée pour des recherches observationnelles à plusieurs points de temps chez les souris.
Disclosures
Aucun n’a été déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par la subvention de la National Natural Science Foundation de la Chine no 81670269, no 81500355 et no 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
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