Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para tirar amostras de sangue da veia subclávia de camundongos.
Abstract
O rato é o principal modelo de mamíferos para estudar doenças humanas e saúde humana. No entanto, coleta de amostras de sangue de camundongos é desafiador no trabalho de pesquisa. A coleta de sangue da cauda é um método popular quando uma pequena quantidade de amostra de sangue é necessária. Artéria orbital pode ser considerada se uma grande quantidade de sangue é necessária, mas este método de coleta de sangue tem problemas éticos. Anteriormente, demonstramos a viabilidade e segurança da coleta de amostras de sangue por punção da veia subclávia em ratos, e aqui investigamos se esse método pode ser utilizado em camundongos. Nós relatamos que este método é seguro e prático para a coleção do sangue nos ratos. A coleta de sangue através da punção da veia subclávia em camundongos pode ser um método conveniente em trabalhos de pesquisa diários.
Introduction
Coleta de amostras de sangue de camundongos é essencial na maioria dos laboratórios de pesquisa. As abordagens convencionais para coleta de sangue em camundongos são o corte da cauda quando menos de 100 μL de amostra é necessária1. No entanto, se mais de 100 μL de sangue forem exigidos em um ponto de tempo não terminal, o sangramento retroorbital, submandibular ou a coleta de sangue submental são as técnicas mais comumente consideradas2. Em algumas ocasiões, o cateterismo da veia jugular por meio de incisão cirúrgica foi adotado como método alternativo3.
No entanto, os métodos acima são prejudiciais para os camundongos. Ao melhor de nosso conhecimento, o método retroorbital não é amplamente aceito por causa do risco potencial de complicações4,5. O trauma relacionado à operação não só acontece na área visível6,7, mas também no fundo da órbita6. Além disso, a coleta de sangue submandibular é estressante8 e pode estarassociada a sangramento excessivo1,9. Com base em nossa pesquisa anterior10,11, apresentamos aqui uma nova estratégia para coleta de sangue a partir da veia subclávia em camundongos. A segurança, a viabilidade, e o volume sanguíneo obtido com esta técnica são apresentados e discutidos.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da Universidade Central do Sul para pesquisa animal do segundo hospital Xiangya (Changsha, China). O manuscrito foi elaborado de acordo com as diretrizes do ARRIVE (pesquisa animal: relato de experimentos in vivo)12.
1. material e animal
- Prepare os materiais necessários: 75% de etanol, fita adesiva, agente epilante, tubo de 2 mL, seringa de 1,0 mL conectada com agulha (26G), balança eletrônica, heparina e soro fisiológico (ver tabela de materiais).
- Animais: Prepare 10 camundongos Kunming, com 6-8 semanas de idade e pesando 21,6-28,3 g (ver tabela de materiais). Manter camundongos de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório13.
2. anestesia e posicionamento dos animais
- Pesar o mouse para calcular a dosagem necessária de agente anestésico.
- Injetar pentobarbital sódico (60 mg/kg) através de injeção intraperitoneal para induzir anestesia geral14 (Figura 1). Aplique uma pomada de lubrificação ocular estéril no início do procedimento para evitar danos aos olhos expostos.
Nota: os ratos são considerados suficientemente anestesiados quando não mostram nenhuma resposta motora ao teste do reflexo de retirada do pedal, pitada de cauda ou pitada de pele abdominal. - Coloque o mouse na mesa de operação em uma posição supina e 2-4 cm de distância da borda da mesa para facilitar a punção da veia (Figura 2). Fixar os membros em uma posição confortável como mostrado na Figura 2. Não é necessária intubação ou ventilação mecânica em todo o procedimento.
- Aplique o agente epilante em torno do espaço infraclavicular com um cotonete.
- Três minutos depois, lave o agente depilatório com um cotonete de algodão molhado para remover a pele e qualquer sujeira visível.
- Esterilize o espaço infraclavicular com 75% de etanol e depois seque com gaze limpa.
3. punção da veia subclávia e coleta de sangue
- Identifique a localização do osso da clavícula e da fossa esternal superior com um dedo.
- Localize o local de punção perto do meio do osso da clavícula e caudal para ele. Colocar o dedo indicador esquerdo lateral no local da punção para fixar a pele e o tecido subcutâneo (Figura 3).
- Mova a agulha para cima e cranialmente em direção à fossa esternal superior. Uma vez que a agulha entra no tecido subcutâneo, mova o dedo anelar da mão direita para trás para formar uma pressão negativa (Figura 3).
Nota: durante esta etapa, a posição do righthand do operador deve ser ligeiramente mais baixa do que a tabela de operação para fazer a agulha mover-se para cima e superior ao plano horizontal. É por isso que o animal é colocado perto da borda da mesa. - Mova a seringa para a frente 3-4 mm, mas pare se não houver dreno de sangue na seringa. Em seguida, lentamente, retirar a seringa e manter a pressão negativa nele. Na maioria das vezes, o sangue iria entrar na seringa quando o desenho de volta.
- Uma vez que o sangue entra na seringa, fixar a seringa e manter a pressão negativa até que o volume necessário (200 μL) de sangue é coletado na seringa.
- Após a coleta de sangue, retire a agulha de punção e pressione o local da punção com um cotonete ligeiramente por 1-2 minutos para parar o sangramento. Então, devolva os ratos para a gaiola.
Nota: ocasionalmente, não se conseguiu obter o sangue na sua primeira tentativa. Ajuste a direção da agulha lateralmente e repita as etapas 3.3-3.5. Se 3 tentativas não conseguirem obter amostra de sangue, mude para o outro lado. - Transfira a amostra de sangue para um tubo heparinizado.
4. recuperação de camundongos
- Enquanto a anestesia pentobarbital está em vigor, velocidade de recuperação, proporcionando suporte de calor até que o mouse está se movendo novamente.
Representative Results
Repetimos este procedimento em 10 camundongos Kunming (masculino n = 5, feminino n = 5, peso 25,4 ± 2,0 g). Nove procedimentos sucederam no lado direito. Um caso falhou dentro de 3 tentativas no lado direito e a coleção do sangue sucedeu no lado esquerdo. O curso de tempo (de punção para obtenção do volume sanguíneo exigido) variou entre 35-126 segundos (média de 68,4 ± 26,4 s). O volume de coleta de sangue foi fixado em cerca de 200 μL (média de 203 ± 11,6 μL). A coleção do sangue sucedeu dentro de 1 a 4 tentativas. A amostragem do sangue sucedeu na primeira tentativa em dois ratos e após 4 tentativas em um rato; a amostragem tomou 2-3 tentativas nos outros ratos. Todos os dados foram ilustrados na tabela 1. Todos os animais sobreviveram e recuperaram dentro de 30 minutos após a amostragem de sangue. Não houve diferença significante entre os sexos para todos os parâmetros observados (tabela 1).
Figura 1 : Anestesia geral através de injeção intraperitoneal Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : A posição supina do mouse. Observe a distância entre a margem eo mouse é 2-4 cm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : O local de punção e a postura das mãos do operador. Note que o dedo anelar da mão direita se move para trás para formar a pressão negativa. A mão esquerda é colocada lateralmente ao local da punção para fixar a pele e os tecidos subcutâneos. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : A localização da veia subclávia, clavícula óssea e fossa esternal superior. A veia subclávia percorre o osso da clavícula e drena para a veia cava superior a fossa esternal superior. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : A relação entre a parede do vaso e a agulha durante o procedimento. (A) as paredes da veia subclávia se unem à medida que a agulha avança, de modo que nenhum sangue pode ser retirado. (B) ao retirar a agulha para trás, as paredes se separam umas das outras e o sangue pode ser retirado. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Variável | Total (n = 10) | Masculino (n = 5) | Fêmea (n = 5) | Valor de P |
| Peso corporal (g) | 25,3 ± 2,2 | 25,3 ± 3,0 | 25,4 ± 1,3 | 0,926 |
| Volume sanguíneo (μL) | 203,0 ± 11,6 | 208 ± 13,0 | 198 ± 8,4 | 0,187 |
| Curso (s) de tempo | 68,4 ± 26,4 | 70,6 ± 35,1 | 66,2 ± 18,0 | 0,809 |
| Retiradas | 2,3 ± 0,9 | 2,4 ± 1,1 | 2,2 ± 0,8 | 0,760 |
| Não houve diferenças significativas de sexo para todos os parâmetros observados, todos os valores de P > 0,05. | ||||
Tabela 1: parâmetros observados entre os sexos
Discussion
Este relato representa uma extensão da pesquisa prévia sobre a amostragem de sangue através da punção da veia subclávia em ratos11. Como o mouse é o animal de pesquisa mais comumente usado, seria valioso para ver se esta técnica também pode ser aplicada a camundongos. O desafio vem do diâmetro relativamente menor da veia subclávia.
Na presente pesquisa, verificou-se que a punção subclávia em camundongos é uma forma viável e confiável de coletar sangue. Em comparação com os métodos convencionais, como o corte da veia da cauda ou a coleta de sangue orbital, não há questões éticas do presente método. Todos os animais sobreviveram após este procedimento sem suplementos líquidos após cerca de 200 μL de extração de sangue, e os animais podiam ser usados para estudos experimentais posteriores. Teoricamente, a extração total do volume amostral não pôde atingir mais de 10% do volume sanguíneo circulante total de cada vez e o volume total de um animal adulto é de 55 a 70 mL/kg de peso corporal5. Para os camundongos utilizados nesta pesquisa (21,6-28,3 g), a extração do volume máximo deve ser de cerca de 200 μL. Assim, definimos a quantidade de amostragem de sangue em torno de 200 μL para cada rato. A incapacidade de medir a pressão arterial, frequência cardíaca e outros parâmetros de estresse são as principais limitações deste relatório.
Anestesia geral suficiente é outra questão importante para garantir o sucesso da punção. Os camundongos devem permanecer quietos durante o procedimento de punção para evitar o risco de ferir o vaso pela agulha. Nós encontramos que o sódio de pentobarbital em 60 MGS/quilograma para a anestesia geral poderia satisfazer a profundidade ideal da anestesia. Uma desvantagem deste agente é o tempo de recuperação relativamente longo (média de cerca de 30 minutos). Em alguns institutos, a inalação de isoflurano é utilizada para o curto tempo de recuperação e deve ser levada em consideração como escolha alternativa de anestesia15.
A localização da veia subclávia é mostrada na Figura 4. Por causa da parede fina e baixa pressão na veia, a parede anterior e posterior da veia subclávia se anexaria um ao outro a pressão de uma agulha, enquanto a agulha está se movendo para a frente (Figura 5a). Ao retirar o êmbolo lentamente para trás, as paredes anexadas se separarão espontaneamente, e a ponta da agulha pode entrar na verdadeira cavidade do vaso e o sangue pode drenar para a seringa pressão negativa sustentada (Figura 5b). O uso de um sistema de coleta de sangue a vácuo16 também pode favorecer a coleta de sangue. Devido ao diâmetro relativamente pequeno da veia subclávia dos ratos, pode haver falhas mesmo para um operador experiente. Para um novato, nós recomendamos a punctura da veia subclávia nos ratos como relatado11. Após várias tentativas de punção com sucesso em ratos, a taxa de sucesso da punção da veia subclávia em camundongos poderia ser significativamente melhorada. Certifique-se de que o local exato de punção é apenas caudal para o meio do osso da clavícula. A agulha que se move para cima e craniano para a fossa esternal superior são outros pontos-chave para garantir uma punção bem-sucedida.
Em conclusão, a punção da veia subclávia é um método seguro e efetivo para coleta de sangue em camundongos. Além do corte da veia da cauda e da coleta do sangue do plexo retro-orbital, este método é viável, seguro, e apropriado para pesquisas observacionais em diversos pontos do tempo nos ratos.
Disclosures
Nenhum declarou.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão da Fundação Nacional da ciência natural da China no. 81670269, no. 81500355 e no. 81500226.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C |
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