Her repræsenterer vi en protokol for fuldautomatiseret radioaktiv mærkning af [11C] SNAP-7941 og analysen af real-time kinetikken af denne Pet-Tracer på P-GP udtrykker og ikke-udtrykker celler.
Positron emission tomografi (PET) er en essentiel Molekylær billedbehandlings teknik, der giver indsigt i veje og brugerspecifikke målrettede radioligands til in vivo-undersøgelser. Inden for denne protokol beskrives en robust og pålidelig fjernstyret radio syntese af [11C] SNAP-7941, en antagonist til melanin koncentrerende hormonreceptor 1. Den radio syntese starter med Cyclotron produceret [11c] co2 , der efterfølgende yderligere reageret via en gas-fase overgang til [11c] ch3OHF. Derefter, dette reaktive mellemprodukt er introduceret til forløberen løsning og danner den respektive radiotracer. Kemisk såvel som den radiokemiske renhed bestemmes ved hjælp af RP-HPLC, der rutinemæssigt gennemføres i den radiofarmaceutiske kvalitetskontrolproces. Desuden er den molære aktivitet beregnes som det er en nødvendighed for følgende real-time kinetiske undersøgelser. Desuden anvendes [11C] SNAP-7941 på MDCKII-WT-og Mdckii-hMDR1-celler til at evaluere virkningen af p-glykoprotein (p-GP)-ekspression på celle akkumulering. Derfor anvendes p-GP-ekspression celle linjen (mdckii-hMDR1) enten uden eller med blokering før eksperimenter ved hjælp af p-GP-substrat (±)-verapamil, og resultaterne sammenlignes med dem, der observeres for dværg cellerne. Den overordnede eksperimentelle tilgang viser vigtigheden af en præcis tidsstyring, som er afgørende for alle prækliniske og kliniske studier med brug af PET-røbestoffer, der er radioaktivt mærket med kortlivede nuklider, såsom carbon-11 (Half-Life: 20 min).
[11C] SNAP-7941 blev udviklet som den første Positron emission tomografi (PET)-Tracer rettet mod melanin-koncentrerende hormonreceptor 1 (MCHR1)-en receptor primært involveret i den centrale regulering af appetit og fødeindtagelse1. Carbon-11 mærkning af snap-7941, en velkarakteriseret MCHR1 antagonist, gav den autentiske Pet-Tracer2,3,4,5. Fuldautomatiseret røntgen syntese er imidlertid yderst udfordrende med hensyn til tidseffektivitet og reproducerbarhed med den kortlivede radionukleid Carbon-11, der tilbyder en halveringstid på 20 min6. Den samlede syntese tid bør holdes på et minimum, og som en tommelfingerregel bør ikke overstige 2-3 halveringstiden (dvs. omkring 40-60 min for Carbon-11)7. Især, syntese procedurer for aktive målretning receptorsystemer med lav ekspression tætheder skal være grundigt optimeret til at opnå tilstrækkelige udbytter og dermed høj molær aktivitet8. Den syntetiske strategi følger ofte produktionen af radionukleider inden for en Cyclotron og frigivelse af [11C] co2 til synthesizeren. Der, [11c] co2 er først reduceret til [11c] ch4 og derefter reagerede med jod til at give [11c] ch3jeg via gas-fase metode9,10. Yderligere behandling med sølv triflat udbytter [11C] ch3OTF direkte on-line. Bagefter introduceres dette reaktive Carbon-11-mærkede mellemprodukt i en opløsning, der indeholder forstadiet molekyle. En automatiseret røntgen syntese omfatter desuden en rensningsproces med semi-præparativ RP-HPLC, herunder efterfølgende formulering af produktet, der egner sig til prækliniske og kliniske studier.
Uanset halveringstiden for radionukliden og den tids indsats, der gøres af radiosyntesen, er farmakokinetikken af et radioaktivt lægemiddel den mest kritiske del, der skal evalueres under udviklingen af PET-Tracer. Med hensyn til Neuro Imaging, er hjernens indtræden af PET-Tracer den vigtigste forudsætning. Men, blod-hjerne barrieren (BBB), en “sikkerhedsgrænse” i hjernen, stærkt udtrykker effluks transportører, der kan losse små molekyler (f. eks Pet-Tracers) og effektivt hæmme deres anvendelighed.
En enorm ulempe under præklinisk evaluering er uventede interaktioner mod disse effluks transportører, som ofte ikke er anerkendt i in vitro eksperimenter og fører til svigt af PET-Tracer in vivo, som observeret for [11C] snap-7941. μPET-billeddannelse hos rotter udviste lav hjerne ophobning, som steg dramatisk efter administration af P-GP-hæmmeren tariquidar11. Disse data tydede på, at [11C] snap-7941 er et substrat for dette effluks-transportørsystem, der hæmmer ligand-binding til central MCHR1. Desværre er der stadig mangel på tilstrækkelige in vitro-modeller gør det muligt at forudsige BBB penetration i en tidlig fase af Tracer udvikling.
Her beskriver vi den automatiserede syntese af [11C] SNAP-7941 ved hjælp af en synthesizer til Carbon-11-methyleringer. Vægten af dette arbejde er at give et overblik om, hvordan man organiserer en fortløbende eksperimentel tilgang, herunder automatiseret syntese, kvalitetskontrol samt successive in vitro-evaluering med den meget kortlivede nuklid Carbon-11.
For det første beskrives de vigtigste trin for en vellykket radio syntese med minimale tids udgifter og maksimal udbytte. Derefter oprettes der en pålidelig kvalitetskontrolprocedure, som gør radio traceren tilgængelig for potentielle kliniske undersøgelser og opfylder kriterierne i den europæiske farmakopé12. Kvantificering af molær koncentrationen og beregning af den pågældende molære aktivitet er et væsentligt krav for de efterfølgende kinetiske målinger.
Endelig præsenteres en ny og ligetil in vitro-metode, der evaluerer [11C] snap-7941’s interaktioner mod effluks-transporter, P-GP (hMDR1). Den foreslåede kinetiske model bruger en nem at håndtere enhed, der tillader en umiddelbar data fortolkning og kræver minimal cellekultur indsats13.
Radio syntesen af [11C] SNAP-7941 blev etableret på et kommercielt syntese modul. På grund af muligheden for fuldt ud at automatisere forberedelses proceduren, den røntgen syntese sikret at være pålidelige, og forbedringer med hensyn til strålingsbeskyttelse af operatøren blev opnået. Fremstillingen af synthesizeren har en enorm indvirkning på kvaliteten af radiotracer, især med hensyn til molær aktivitet. Det er derfor vigtigt konstant at arbejde under inaktive forhold (f. eks. helium atmosfære) og at skylle alle linjer, der er placeret før reaktionsbeholderen (mållinje, [11C] ch3I-produktionscyklussen og-reaktoren (Se figur 2)). Desuden opvarmning af de respektive fælder og ovne før starten af syntesen til at fjerne fugt og atmosfærisk kulstof øger molær aktivitet fordelagtigt. Især AgOTf kolonnen, imprægneret med grafitiseret kulstof, er ekstremt følsom over for fugt. Selv mindre mængder af enhver kilde til fugt forstyrre omdannelsen af [11c] ch3i til [11c] ch3OTF. Før syntesen påbegyndes, skal [11c] co2 -fælden og [11c] LM3i-fælden afkøles til stuetemperatur igen for at muliggøre efterfølgende diffusering. Desuden anbefales det at opløse forstadiet kort før start af syntesen og tilføje basen direkte i forstadiet opløsning.
Kvalitetskontrollen af Carbon-11 aktive skal være rationelt konstrueret til en kontinuerlig og hurtig arbejdsgang. Men de vigtigste parametre for cellekultur undersøgelser er radiokemisk renhed og molær aktivitet for at opnå gyldige resultater. Korrekt evaluering af molær aktiviteten kræver en robust analytisk HPLC-metode, og kalibreringskurven skal dække det færdige produkts koncentrationsområde. Den udfordrende del for aktive er at opnå en koncentration over kvantificeringsgrænsen (LOQ) på grund af små mængder, som produceres under radio syntese. Derfor er kunsten at finde balancen mellem høje molære aktiviteter for at undgå receptor mætning og høj nok koncentrationer til stadig at kunne kvantificere det ikke-radioaktive signal.
[11C] SNAP-7941 blev bekræftet at være et potent substrat af human P-GP-transporter, da der ikke blev observeret nogen akkumulering i de ubehandlede eller køretøjs behandlede MDCKII-hMDR1-celler på grund af Rapid efflux. I modsætning hertil leverede både eksperimentelle opsætninger (MDCKII-WT eller præ-blokerede MDCKII-hMDR1-celler) lignende resultater (akkumulering af [11C] SNAP-7941), hvilket understøtter alsidigheden i denne in vitro-analyse. MDCKII-hMDR1 celler er meget velegnede til LigandTracer eksperimenter på grund af deres stabile transfection, hurtig vækst og vedholdende mod forskydnings stress forårsaget af den roterende cellekultur skål. Manglen på [11C] snap-7941 optagelse i rotter og mus hjernen kan derfor opstå forårsaget af effluks gennem P-GP transporter. På grund af transfektering af hunde nyreceller med human multi drug resistens protein 1 (hmdr-1, P-GP), den forudsigende værdi af denne metode for effluks transporter binding i mennesker er høj, hvilket er gunstigt i form af en fremtidig klinisk anvendelse. Indtil videre er selektiviteten mod andre effluks-transporter imidlertid ikke blevet verificeret. Derfor kan andre cellelinjer anvendes, der udtrykker forskellige prominente effluks transportører som brystkræft resistens protein (bcrp) eller multiple resistens protein-1 (MRP-1), at studere interaktioner mod disse transportører. Metoden er i forhold til klassiske ophobning eller transport assays meget enkel og giver straks kvalitative resultater. Desuden er den største fordel, at denne teknologi muliggør evaluering af direkte interaktion mellem PET-Tracer og målet i realtid, i modsætning til det konventionelle eksperiment ved hjælp af indirekte kvantificering (for det meste forskydning). Desuden giver real-time radioassay software eksperimentel fleksibilitet (f. eks. nuklid henfalds korrektion, måling af tid og positioner osv.) og derfor høj frihed for brugerne. På den anden side, begrænsninger af metoden omfatter en lav prøve gennemløb, da kun én celle parabol kan måles ad gangen. Desuden bør der tages hensyn til et par andre tekniske og driftsmæssige spørgsmål: den beskrevne teknologi er meget følsom over for baggrundsstråling; strålings kilderne bør således holdes på afstand, og der bør lægges vægt på baggrunds målingen forud for forsøget. Et andet spørgsmål vedrørende eksperimenter ved højere temperaturer end stuetemperatur, er opvarmning af skrå støtte: fordampning af cellekulturmedium kan påvirke detektoren. I stedet for opvarmning, hele enheden er fortrinsvis placeret i inkubator. Desuden er metoden begrænset til vedlige cellelinjer. Gennem rotation af cellekulturen parabol, shear stress følsomme celler kan løsne sig fra skålen, hvilket kan føre til ugyldige resultater.
Ikke desto mindre, hvis eksperimententer er opmærksomme på disse mindre ulemper metoden leverer hurtige og pålidelige resultater for analysen af den kinetiske opførsel af prækliniske PET-Tracers.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den østrigske videnskabs fond (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Vi er taknemmelige for den tekniske støtte til T. Zenz og A. Krcal. Desuden takker vi K. Pallitsch for forberedelsen af AgOTf og H. Spreitzer til distribution af forløberen.
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
[11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
g-spectrometer | g-spectrometer | ||
Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
In vitro experiments | |||
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
(±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |