Summary
Aquí, representamos un protocolo para el marcado radioeléctrico totalmente automatizado de [11C]SNAP-7941 y el análisis de la cinética en tiempo real de este PET-tracer en células de expresión y no expresión de P-gp.
Abstract
La tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de imagen molecular esencial que proporciona información sobre las vías y utiliza radioligands específicos para investigaciones in vivo. Dentro de este protocolo, se describe una radiosíntesis controlada remota mente robusta y confiable de [11C]SNAP-7941, un antagonista del receptor de la hormona que concentra la melanina 1. La radiosíntesis comienza con el ciclotrón producido [11C]CO2 que posteriormente se reacciona a través de una transición en fase gaseosa a [11C]CH3OTf. Entonces, este intermedio reactivo se introduce a la solución precursora y forma la radiosonda respectiva. La pureza química y radioquímica se determina por medio de RP-HPLC, implementado rutinariamente en el proceso de control de calidad radiofármaco. Además, la actividad molar se calcula ya que es una necesidad para las siguientes investigaciones cinéticas en tiempo real. Además, [11C]SNAP-7941 se aplica a las células MDCKII-WT y MDCKII-hMDR1 para evaluar el impacto de la expresión de p-glicoproteína (P-gp) en la acumulación celular. Por esta razón, la línea celular de expresión de P-gp (MDCKII-hMDR1) se utiliza sin o con bloqueo antes de los experimentos por medio del sustrato de P-gp (-)-verapamil y los resultados se comparan con los observados para las células de tipo silvestre. El enfoque experimental general demuestra la importancia de una gestión precisa del tiempo que es esencial para cada estudio preclínico y clínico utilizando marcadores PET radiomarcados con nucleidos de corta duración, como el carbono-11 (vida media: 20 min).
Introduction
[11C] SNAP-7941 fue evolucionado como la primera tomografía por emisión de positrones (PET)-trazador dirigido al receptor de la hormona que concentra la melanina 1 (MCHR1) - un receptor principalmente involucrado en la regulación central del apetito y la ingesta de alimentos1. El etiquetado carbono-11 de SNAP-7941, un antagonista bien caracterizado del MCHR1, produjo el auténtico PET-tracer2,3,4,5. Sin embargo, la radiosíntesis totalmente automatizada es muy difícil en términos de eficacia y reproducibilidad del tiempo con el radionúclido de corta duración carbono-11 que ofrece una vida media de 20 min6. El tiempo de síntesis global debe mantenerse al mínimo, y como regla general no debe exceder 2-3 vidas medias (es decir, alrededor de 40-60 min para carbono-11)7. Especialmente, los procedimientos de síntesis para radiosondas dirigidos a sistemas receptores con densidades de baja expresión deben optimizarse ampliamente para obtener rendimientos suficientes y, en consecuencia, una alta actividad molar8. La estrategia sintética a menudo sigue la producción de radionúclidos dentro de un ciclotrón y la liberación de [11C]CO2 al sintetizador. Allí, [11C]CO2 se reduce primero a [11C]CH4 y posteriormente reacciona con yodo para producir [11C]CH3I a través del método de fase gaseosa9,10. El tratamiento posterior con triflato de plata produce [11C]CH3OTf directamente en línea. Después, este intermedio reactivo etiquetado carbono-11 se introduce en una solución que contiene la molécula precursora. Una radiosíntesis automatizada implica además un proceso de purificación con RP-HPLC semipreparativo que incluye la formulación posterior del producto adecuado para estudios preclínicos y clínicos.
Independientemente de la vida media del radionúclido y del esfuerzo de tiempo de la radiosíntesis, la farmacocinética de un radiofármaco es la parte más crítica a evaluar durante el desarrollo del PET-tracer. En términos de neuroimagen, la entrada cerebral del PET-tracer es el principal requisito previo. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BBB), una "frontera de seguridad" del cerebro, expresa altamente transportadores de eflujo que pueden descargar moléculas pequeñas (por ejemplo, PET-tracers) y obstaculizar eficientemente su aplicabilidad.
Un gran inconveniente durante la evaluación preclínica son interacciones inesperadas hacia estos transportadores de eflujo, que a menudo no son reconocidos en experimentos in vitro y que conducen al fracaso del PET-tracer in vivo, como se observó para [11C]SNAP-7941. Las imágenes de PET en ratas demostraron una baja acumulación cerebral, que aumentó drásticamente después de la administración del inhibidor de P-gp tariquidar11. Estos datos sugerían que [11C]SNAP-7941 es un sustrato de este sistema transportador de eflujo que impedía el ligando a la unión al MCHR1 central. Desafortunadamente, todavía hay una falta de modelos in vitro adecuados que permitan la predicción de la penetración de BBB en una etapa temprana del desarrollo del trazador.
Aquí, describimos la síntesis automatizada de [11C]SNAP-7941 utilizando un sintetizador para metilaciones de carbono-11. El énfasis de este trabajo es dar una visión general sobre cómo organizar un enfoque experimental consecutivo que incluya la síntesis automatizada, el control de calidad, así como la evaluación in vitro sucesiva con el muy efímero nuledo carbono-11.
En primer lugar, se describen los pasos clave para una radiosíntesis exitosa con un gasto de tiempo mínimo y un rendimiento máximo. A continuación, se establece un procedimiento de control de calidad fiable que hace que la radiosonda esté disponible para posibles estudios clínicos y cumpla los criterios de la Farmacopea Europea12. La cuantificación de la concentración molar y el cálculo de la actividad molar respectiva es un requisito esencial para las sucesivas mediciones cinéticas.
Por último, se presenta un nuevo y sencillo método in vitro que evalúa las interacciones de [11C]SNAP-7941 hacia el transportador de eflujo, P-gp (hMDR1). El modelo cinético propuesto utiliza un dispositivo fácil de manejar que permite una interpretación inmediata de los datos y requiere un esfuerzo mínimo de cultivo celular13.
Protocol
ADVERTENCIA: En el siguiente protocolo hay múltiples pasos involucrados que requieren manejo y manipulación de la radiactividad. Es importante que cada paso esté de acuerdo con el Departamento de Seguridad Radiológica del instituto y la legislatura nacional respectiva. Es obligatorio minimizar la exposición a la radiación ionizante para los operadores implicados siguiendo el principio ALARA ("Tan bajo como razonablemente alcanzable").
1. Gestión del tiempo y planificación del experimento
NOTA: La corta vida media de carbono-11 requiere una gestión precisa del tiempo para minimizar la pérdida de radiactividad (Figura1). Es importante que cualquier persona involucrada conozca su área de responsabilidad y el punto de tiempo de la acción respectiva. Para la configuración de un experimento cinético en tiempo real de [11C]SNAP-7941, alrededor de cuatro personas son necesarias para un proceso suave.
- Organizar un productor para [11C]SNAP-7941.
- Informar al operador de control de calidad realizando la evaluación de especificaciones, el cálculo de la concentración de masa y la actividad molar de la hora de inicio de la síntesis.
- Sostenga el experimentador cinético en tiempo real listo para el cálculo de dilución y la realización del experimento.
- Indique al corredor para transferir la radiactividad al lugar respectivo en el momento oportuno respectivo.
2. Síntesis automatizada de [11C]SNAP-7941 para uso preclínico
- Preparación del sintetizador (Figura 2).
- Encienda el sintetizador, los gases técnicos necesarios (helio e hidrógeno) y el software de control del sintetizador Tracerlab. Seleccione la referencia ala secuencia de síntesis respectiva .
- Lave el V1-V3 una vez con agua y dos veces con acetona a través del reactor y la válvula HPLC ya sea en carga o inyecte posición en la botella de residuos de bucle.
- Seque todas las líneas asociadas dentro y fuera del reactor a través de la válvula de inyección con un flujo continuo de helio activado a través de V18.
- Calentar la trampa[11C]CH3I, así como la trampa [11C]CH3OTf bajo una corriente de helio de 100 mL-min-1 hasta 200 oC a través de V24, V25, V29, V15, V9, V17 y V32/V33 con reactor separado.
- Compruebe la misma vía en busca de fugas (con reactor conectado) con un flujo de helio de 100 mL-min-1. La estanqueidad está garantizada cuando el flujo cae por debajo de 4 mL-min-1.
- Encienda la bomba HPLC (5-10 mL-min-1) y lave las líneas HPLC y la válvula de inyección con acetonitrilo/agua (50/50, v/v), así como las líneas HPLC con el disolvente HPLC a través de V14 en la bombilla.
- Vacíe la bombilla a través de V11 y V12 en la botella de residuos con un flujo de helio a través de V19. Lave las líneas respectivas con agua de V6 de nuevo a través de V11 y V12 con un flujo de helio a través de V18.
- Lave V5 con etanol y V4 con agua a través de V11 y V12 en el vial de recogida de productos (PCV) utilizando una corriente de helio a través de V18, luego vacíe el PCV a través de V13 en la botella de residuos con un flujo de helio a través de V20.
- Apague la bomba HPLC, cambie al disolvente para la síntesis (acetato de amonio acuoso (2,5 g) L-1)/ácido acético 97,5/2,5 v/v; pH 3.5)/acetonitrilo 75/25 v/v), adjunte la columna HPLC semipreparativa y equilibre la columna (flujo de 5 ml-min-1).
- Rellenar los reactivos para la síntesis y purificación: 1,5 ml de agua (V2), 4,5 ml de 0,9% de NaCl (V4), 0,5 ml de etanol 96% (V5), 10 ml de agua (V6) y 90 ml de agua (bulbo).
- Colocar un nuevo vial de residuos de bucle; un vial de producto (etiquetado y equipado con una aguja de aireación) a V13 y el nitrógeno líquido.
- Condicionar previamente un cartucho SPE (extracción de fase sólida) con 10 ml de etanol al 96% y 20 ml de agua y fijarlo entre V11 y V12.
- Iniciar la secuencia de pre-ejecución 20 min antes de iniciar la síntesis, que consiste en calentar la trampa [11C]CO2 a 400 oC y vaciar la trampa con una corriente de helio de 50 mL-min-1a través de V27 (2 min). A continuación, enjuague previamente la trampa [11C]CO2 durante 3 min con gas hidrógeno (120 mL-min-1) y, finalmente, enfríe hasta menos de 40 oC.
- Disolver 1 mg de precursor en 400 ml de acetonitrilo (para la síntesis de ADN, < 10 H2O), transferir la solución a la reacción y añadir 5,5 l de TBAH (264 mg-ml-1 en metanol). Conecte el reactor a su posición respectiva.
- Cierre la célula caliente y encienda la presión de la célula caliente.
- Confirmar el inicio del proceso de enfriamiento de la trampa CH4 con nitrógeno líquido a -75 oC.
- Libere la radiactividad cuando se alcance la temperatura.
- Producción de ciclotrón de [11C]CO2
NOTA: Los pasos 2.2.1-2.2.4 se llevan a cabo simultáneamente en la preparación del módulo de radiosíntesis (véase también la figura 1).- Encienda el imán del ciclotrón.
- Seleccione el objetivo 11C-CO2 e inicie la viga 65 oA.
- Confirme el inicio de la irradiación pulsando el botón Iniciar irradiación
- Detenga el haz y confirme la liberación de radiactividad en el sintetizador pulsando el botón Entrega,después de alcanzar la cantidad deseada de radiactividad (aprox. 120 GBq después de 30 min).
- Ejecución de la radiosíntesis totalmente automatizada
- Confirme que el sistema está listo para recibir la radiactividad e iniciar el proceso automatizado
- Supervisión del siguiente proceso automatizado.
- Compruebe si el [11C]CO2 se transfiere automáticamente del ciclotrón a la unidad de síntesis a través de V26 (aprox. 4 min) y que el [11C]CO2 está atrapado en el tamiz molecular impregnado de níquel como catalizador ([ 11 C]CO2 trap) a temperatura ambiente.
- Realice un seguimiento si la trampa [11C]CO2 se enjuaga automáticamente con helio (50 mL-min-1) y luego con gas hidrógeno (120 ml-min-1). A continuación, observe que V27 y V25 están cerrados y que el[11C]CO2 atrapado, incluido el gas hidrógeno, se calienta a 400 oC y que el[11C]CH4 formado se transporta posteriormente al preenfriado [11C]CH4 trampa y atrapado allí.
- Monitor de que V10 está cerrado, V9 abierto (hacia la columna de yodo) y [11C]CH4 se libera de nuevo calentando la trampa [11C]CH4 lentamente a 80 oC y transportado a la unidad de circulación con una corriente de helio a través de V10 (salida de escape). Y compruebe aún más si [11C]CH4 se convierte a [11C]CH3I dentro de la unidad de circulación, que dura aprox. 3 min y el formado [11C]CH3I está continuamente atrapado en el [11C] CH3I trampa.
- Asegúrese de que la válvula de escape V16 esté abierta y de que la trampa [11C]CH3I se caliente a 90 oC con una corriente de helio (20 ml-min-1) a través de V24. Por la presente, se eliminan los posibles subproductos y, a continuación, se cierra V16.
- Confirme que el [11C]CH3I está listo para ser liberado en el reactor.
- Supervisar el siguiente proceso automatizado: Compruebe si la trampa [11C]CH3I se calienta a 190 oC y la formada [11C]CH3I se libera en el reactor a través de la trampa [11C]CH3OTf (V32 y V33, todavía a 200o C), V7 y V8 bajo una corriente continua de helio (10-25 ml-min-1, V24). Durante este proceso, V21 y V23 (salida de escape) tienen que estar abiertos.
- Confirme que la radiactividad llegó al reactor, una vez que la cantidad de radiactividad en el reactor ya no está aumentando.
- Seguimiento del siguiente proceso automatizado y preparación para la intervención manual, si es necesario
- Compruebe si V23, V21 y V8 se cierran automáticamente y la mezcla de reacción se calienta a 75 oC. Después de 3 min, observe si el reactor se enfría con nitrógeno líquido hasta que la temperatura esté por debajo de 35 oC. Posteriormente, asegúrese de que la mezcla de reacción se atemple con 1,5 ml de agua a través de V2. Durante este proceso, V21 y V23 (salida de escape) tienen que estar abiertos.
- Realice un seguimiento si V21 y V23 están cerrados y la mezcla de reacción se transfiere a la válvula de inyección HPLC pasando a través de un detector de fluidos al bucle HPLC (5 ml). Realice un seguimiento si la mezcla de reacción se inyecta automáticamente en la columna HPLC.
- Observe el cromatograma y corte manualmente el pico del producto a través del botón Peak start. Presione Peak end cuando la señal de pico del producto caiga por debajo de aproximadamente 400 cps después de un tiempo de retención de alrededor de 8-10 min (flujo: 5 mL-min-1, Figura 3).
- Encienda una corriente de helio adicional para acelerar el vaciado de la bombilla.
- Supervise si la bombilla está vaciando y observe la botella de residuos: Compruebe si la bombilla se vacía a través de V11, el cartucho SPE y V12 en los residuos con una corriente de helio a través de V19 y una línea de helio adicional y si el producto se retiene en el cartucho SPE.
- Confirme que la bombilla está completamente vacía.
- Seguimiento del proceso automatizado de purificación de SPE y transferencia de productos
- Compruebe si el cartucho SPE se lava con 10 ml de agua a través de V6, V11 y V12 en los residuos y si el etanol elude el producto en el PCV a través de V5, V11 y V12. Finalmente, observe si 0.9% NaCl se añade al PCV a través de V4, V11 y V12 para diluir el producto.
- Asegúrese de que la solución del producto se transfiere a través de V13 y un filtro estéril al vial del producto final con una corriente de helio a través de V20.
- Confirme que el producto se ha transferido por completo.
3. Control de calidad (QC)
NOTA: El control de calidad de los radiofármacos incluye la medición de los siguientes parámetros:
- Pureza radioquímica y actividad molar (RP-HPLC)
- Disolventes residuales (cromatografía de gases, GC)
- Osmolalidad (osmómetro de presión de vapor)
- pH (pH-metro)
- Pureza del espectro/radionúclidos (espectrómetro)
- Pureza de vida media/radionúclido (calibrador de dosis)
Todos los parámetros fisicoquímicos se determinan antes de la liberación del producto y los valores deben estar en el rango de parámetros de calidad definido.
- Preparación del equipo de control de calidad
- Iniciar la preparación 30 minutos antes del final de la síntesis.
- Prepare un vial cónico en un recipiente blindado con plomo y una jeringa de 1 ml blindada con una aguja conectada.
- Preparar una solución estándar de referencia de SNAP-7941 (10 g-mL-1) en agua para HPLC.
- Encienda el medidor de pH, el cromatógrafo de gases y los gases usados, el osmómetro y todos los componentes del HPLC.
- Encienda el software de control HPLC y seleccione la columna dedicada y el método respectivo para [11C]SNAP-7941 (fase móvil: (agua/ácido acético 97.5/ 2.5 v/v; 2.5 g.L-1 acetato de amonio; pH 3.5)/acetonitrilo 70/30 v/v; flujo: 1 mL-min-min-min- -1) y escribir una lista de muestra con dos mediciones (estándar y producto). Inicie el método para el acondicionamiento de la columna.
- Inyectar 20 l de la solución de referencia SNAP-7941 con una jeringa Hamilton después de 10 minutos de acondicionamiento e iniciar la ejecución del análisis.
- Lave la jeringa de Hamilton dos veces con acetonitrilo y agua después de la inyección.
- Inicie el software de control GC y escriba la lista de ejemplo.
- Realización de control de calidad
- Mida el rendimiento radiactivo absoluto del producto después del final de la síntesis y transfiera 100 ml del producto a un vial de reacción con la jeringa apantallada con plomo preparada para el control de calidad.
NOTA: Todos los datos obtenidos del control de calidad deben documentarse de acuerdo con la normativa nacional. - HPLC analítico: Mida la pureza radioquímica y la pureza química e informe inmediatamente a la persona a cargo de los experimentos de cultivo celular de los resultados.
- Dibuje 40 l de la muestra de QC e inyecte en el HPLC. Inicie el funcionamiento moviendo el brazo de la válvula de inyección de Cargar a Inyectar (Figura3).
NOTA: Durante la ejecución (8 min), se pueden realizar otras mediciones del protocolo para evitar la mayor decaimiento posible. - Abra el cromatograma e integre todos los picos en el canal de radiactividad. Compare el tiempo de retención del producto (5,0-7,0 min) con el tiempo de retención del estándar de referencia. Compare el área debajo de la curva en porcentaje de todos los picos integrados. El pico del producto tiene que ser superior al 95% (pureza radioquímica) del total de áreas integradas (canal de radio).
- Integre la señal en el canal UV para determinar la pureza química. La impureza principal es generalmente el ácido SNAP precursor en 2.8-3.5 min. La concentración de [natC]SNAP-7941 se calcula a partir de la curva de calibración después de la integración. Calcular la concentración de SNAP-7941 en el archivo-1 y determinar la actividad molar mediante la siguiente ecuación:
- Dibuje 40 l de la muestra de QC e inyecte en el HPLC. Inicie el funcionamiento moviendo el brazo de la válvula de inyección de Cargar a Inyectar (Figura3).
- Para la cromatografía de gases, transfiera 20 ml de la muestra de control de calidad en un vial de vidrio dedicado. Colóquelo en el muestreador automático e inicie la medición. Una vez finalizada la medición, abra el cromatograma y anote los números de picos integrados automáticamente. La muestra no debe contener más de 410 ppm de acetonitrilo y 10% de etanol.
- Osmolalidad: Coloque un disco de muestra de papel en el hueco dedicado y aplique 10 ml de la muestra. Pulse el botón Cerrar para medir la osmolalidad. Después de 3 min, el dispositivo muestra la osmolalidad que tiene que estar en un rango de 190-500 mosm-kg-1.
- pH: Lave el electrodo con agua. Mida el pH colocando el electrodo en la muestra. El pH debe estar en un rango de 5.0-8.5. Lavar el electrodo de nuevo después de la medición y colocar el electrodo en la solución de pH de referencia.
- • Espectro: Coloque la muestra de control de calidad en el espectrómetro, abra el software de control e inicie la medición. Detenga la medición y anote la energía medida que tiene que ser 511 keV (rango 420-520 keV). Abra el menú de archivos y aprueba el archivo con el número de lote respectivo. Recuerde el espectro guardado en el software dedicado e imprima el espectro.
- Vida media: Mida la actividad de la muestra de control de calidad dos veces utilizando el calibrador de dosis. Anote los tiempos respectivos y calcule la vida media del exponencial.
- Mida el rendimiento radiactivo absoluto del producto después del final de la síntesis y transfiera 100 ml del producto a un vial de reacción con la jeringa apantallada con plomo preparada para el control de calidad.
- Lanzamiento
- Una vez probados todos los parámetros y los resultados se ajustan a las directrices de las autoridades austriacas, suelte la radiosonda. El operador tiene que firmar la corrección de los datos.
4. Evaluación de las interacciones hacia el transportador p-gp
- Cultura celular
- Inicie el flujo de aire laminar (LAF) de la mesa de trabajo y limpie el banco al menos 15 minutos antes de empezar a trabajar.
- Mezclar el medio de cultivo celular en condiciones estériles en el LAF con el 10% de FCS (50 ml) y el 0,5% de los antibióticos (2,5 ml) con una pipeta volumétrica estéril utilizando una ayuda de pipeteo automatizada.
- Descongelar las células MDCKII-hMDR1 y MDCKII-WT y cultivar en un matraz de cultivo celular T75 o T175 10-14 días antes de los experimentos en condiciones asépticas (LAF).
- Cambie el medio al día siguiente para eliminar todas las células no adherentes y apoptoticas.
- Sustituya cada tres días el medio por uno fresco (12 ml para el T75 y 23 ml para el matraz de cultivo celular T175, respectivamente).
- Divida las celdas de acuerdo con el cronograma de experimentos en frascos frescos o en platos de cultivo celular sobre una confluencia del 80% para evitar el crecimiento de bicapa.
- Preparación celular para experimentos
- Dividir las células dos días antes de los experimentos y semilla en una concentración de 2,5 x 105 celdas por 2 ml en un plano oblicuo de un plato de cultivo celular (Figura4). Utilice un dispositivo de contador de celdas automático o una cámara de recuento Neubauer para contar las celdas y calcular la relación de división adecuada.
- Retire el medio un día antes de los experimentos, lave las células en el plato de cultivo con 4 ml de DPBS y agregue 5 ml frescos de medio de cultivo celular. Coloque el plato horizontalmente en la incubadora.
- Lavar las células con DPBS al menos 0,5 h antes de los experimentos y reemplazar las 2 ml de medio libre FBS. Examine la confluencia y la morfología celular con un microscopio.
- Realizar los experimentos en tres configuraciones diferentes.
- Utilice la placa Petri para los experimentos como se describe en 4.2.3.
- Tratar las células durante 0,5 h antes de los experimentos con clorhidrato de 10 M(-verapamil.
- Añadir 0,98 l de solución de material verapamilo (20,4 mM (a)-verapamilo clorhidrato en DMSO). El contenido final de DMSO es del 0,05% durante el tratamiento.
- Incubar las celdas durante 0,5 h con el control del vehículo (DMSO). Utilice el mismo volumen que se utiliza para el tratamiento farmacológico.
- Experimentos del ensayo en tiempo real (para las tres configuraciones)
- Encienda el dispositivo, el ordenador y asegúrese de que están conectados correctamente y, a continuación, abra el software de control.
- Elija la opción Un objetivo, desbloquee la plantilla y ajuste la siguiente configuración:
Número de posiciones: 2 (dos)
Tiempo de detección (seg): 3 (tres)
Tiempo de retardo de detección (s): 2 (dos)
Nombre de la primera fase: línea base - Inserte el plato de cultivo celular en el soporte inclinado del dispositivo, asegurándose de que el polo celular está en la parte inferior y cubierto con medio de cultivo celular.
- Inicie la ejecución a través del botón Inicio. El sistema pide guardar el archivo. Elija un nombre de archivo y una ruta de guardado. El centro de control aparece y comienza la medición de línea base (el soporte de la vajilla de cultivo celular comienza a girar).
- Seleccione en Otrasopciones:
Escala de tiempo: minutos
Corrección de nucleidos: carbono-11 - Marque todas las casillas en Curvas en gráfico (fondo (rojo), objetivo (azul) y objetivo menos fondo (negro)).
- Obtener parámetros de control de calidad: actividad molar [GBq.-mol-1] y concentración de actividad [MBq.mL-1] al final de la síntesis.
- Calcule el volumen del trazador respectivo para 15 nM de [natC]SNAP-7941 en el volumen de ensayo de 2 ml.
- Prepare la pipeta al volumen respectivo y una alícuota del producto [11C]SNAP-7941 en un blindaje de plomo.
- Haga clic en Pausar ejecución en la ventana del centro de control. Espere hasta que se detenga la rotación del plato y se produzca la barra lateral con el título Pausado y la siguientefase.
- Abra la tapa del dispositivo cinético en tiempo real. Gire el soporte del plato de cultivo 90o a la izquierda. Agregue el volumen calculado del trazador y vuelva a la posición inicial. A continuación, cierre la tapa del dispositivo. Pulse inmediatamente el botón Continuar para iniciar el experimento.
- Finalice el experimento después de 20 minutos seleccionando pausar y, posteriormente, finalice la ejecución (presione Finalizar ejecución en la barra lateral).
- Análisis y procesamiento de datos mediante un software estadístico
- Abra el software de control en tiempo real. Haga clic en Abrir archivos para recuperar la cinética requerida. La cinética se ilustra en la ventana del centro de control.
- Elija haciendo clic derecho directamente en las curvas de exportaciónde cinética . Guarde el archivo de texto que contiene los datos sin procesar. Abra el programa de estadísticas y pegue el archivo de datos sin procesar de experimentos en tiempo real.
- Comience con el tiempo (eje x) en la adición de radiosonda (excluir la medición de fondo) y normalice a la señal porcentual del CPS máximo (cuentas por segundo).
- Cargue todos los datos normalizados en un nuevo archivo GraphPad Prism.
- Calcular los valores medios y la desviación estándar.
- Ilustre los datos obtenidos como gráfico que muestra la desviación (tasa de aumento) de la toma del trazador de las tres configuraciones.
Representative Results
La radiofensisis totalmente automatizada de [11C]SNAP-7941 produjo 5,7 x 2,5 GBq (4,6 a 2,0% en EOB, 14,9 a 5,9% sobre la base de [11C]CH3OTf; n a 10) del producto formulado. La síntesis global duró alrededor de 40 min, donde se requirieron 15 min para la preparación de [11C]CH3OTf a través del método de fase gaseosa, otros 5 min fueron necesarios para el radioetiquetado del precursor, seguido de 10 min de semi-preparative Purificación RP-HPLC y 10 min para la extracción y formulación de fase sólida del cartucho C18. A continuación, se entregó una pequeña alícuota (aprox. 100-200 l) a la persona responsable del control de calidad, mientras que el vial del producto original que contenía el trazador listo para usar se pasó al experimentador del análisis cinético en tiempo real.
El control de calidad se completó dentro de los 10 minutos después del final de la síntesis. La actividad molar se encontraba en un rango de 72 a 41 GBq/mol (n a 10) y la pureza radioquímica siempre fue > 95%. Todos los demás parámetros (pH, osmolalidad, disolventes residuales) cumplieron con los criterios de liberación. Para el ensayo cinético en tiempo real, se eligieron tres configuraciones experimentales diferentes: (A) células MDCKII-WT tratadas y no tratadas (vehículo), (B) no tratadas o tratadas con células MDCKII-hMDR1 del vehículo y (C) la última línea celular con bloqueo previo al tiempo real ensayo cinético del transportador utilizando el uso de la tecnología de transporte (-verapamil). La aplicación de [11C]SNAP-7941 a la línea celular de tipo silvestre MDCKII-WT (P-gp non-expressing) y MDCKII-hMDR1 (P-gp expressing) muestra un comportamiento cinético diferente, ya que hay una rápida acumulación en la línea celular de tipo salvaje, mientras que no se observó acumulación para las células MDCKII-hMDR1. Sin embargo, el bloqueo del transportador de eflujo P-gp en las células MDCKII-hMDR1 con (-)-verapamil condujo a una cinética en tiempo real comparable como ya se ha visto para la línea celular de tipo salvaje (Figura5).
Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo. Flujo de trabajo de la radiosíntesis, control de calidad y rendimiento de la medición cinética en tiempo real de [11C]SNAP-7941. Las flechas negras indican la forma de transporte de la radiactividad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema radiosintético del sintetizador automatizado. Circuito de conmutación del sintetizador automatizado, comenzando con la unidad de circulación para [11C]CH3I/[11C]CH3Producción de OTf, reactor para la introducción de la actividad en la solución precursora y purificación SPE (SPE ) extracción de fase sólida; PCV - vial de recogida de productos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cromatogramas representativos de la radiosíntesis totalmente automatizada de [11C]SNAP-7841. El cromatograma semi-preparativo RP-HPLC se ilustra en la parte superior y el analítico después de la purificación en la parte inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Preparación de platos de cultivo celular para experimentos en tiempo real. El paso 1 incluye la sembración de 2.5 x 105 hasta 1 x 106 dependiendo del tipo de celda y su tasa de crecimiento. Posteriormente, el plato de cultivo se coloca en un plano oblicuo (aproximadamente 30-45o). Por lo tanto, el aparato de metal suministrado o la tapa de un plato de cultivo celular se puede utilizar en la incubadora para estabilizar la posición de la lancha del plato. Al día siguiente (24 h) el plato se ajusta horizontalmente, y se añade un medio de cultivo celular fresco para cubrir completamente la superficie celular. El día del experimento, se examinan la viabilidad celular y la confluencia. De acuerdo con el protocolo experimental, las células se lavan con DPBS, el medio se sustituye por un medio libre de suero (2 ml), y el plato de cultivo se reposiciona a una posición oblicua hasta el inicio de los experimentos. A partir de ahora, las células pueden ser tratadas con el inhibidor o el vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Mediciones cinéticas en tiempo real de [11C]SNAP-7941. La cinética representativa en tiempo real de [11C]SNAP-7941 se muestra en tres configuraciones diferentes: utilizando células MDCKII-WT; Células MDCKII-hMDR1 prebloqueadas con (-verapamilo como inhibidor de P-gp y células MDCKII-hMDR1 sin obstrucción. El eje Y ilustra la tasa de aumento de las células MDCKII-hMDR1 y WT prebloqueadas en comparación con los resultados de las células MDCKII-MDR1 no tratadas o tratadas por vehículos, respectivamente (sin admisión, 0%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La radiosíntesis de [11C]SNAP-7941 se estableció en un módulo de síntesis comercial. Debido a la posibilidad de automatizar completamente el procedimiento de preparación, la radiofensisis se demuestra que es fiable, y se lograron mejoras en la protección contra la radiación del operador. La preparación del sintetizador tiene un enorme impacto en la calidad de la radiosonda, especialmente en términos de actividad molar. Por lo tanto, es esencial trabajar constantemente en condiciones inertes (por ejemplo, atmósfera de helio) y vaciar todas las líneas situadas antes del recipiente de reacción (línea objetivo, ciclo de producción y reactor[11C]CH3I (véase la figura 2)). Además, calentar las trampas y hornos respectivos antes del inicio de la síntesis para eliminar la humedad y el carbono atmosférico aumenta la actividad molar ventajosamente. Especialmente la columna AgOTf, impregnada con carbono grafitizado, es extremadamente sensible a la humedad. Incluso pequeñas cantidades de cualquier fuente de humedad perturban la conversión de [11C]CH3I a [11C]CH3OTf. Antes de iniciar la síntesis, la trampa [11C]CO2 y la trampa [11C]CH3I tienen que enfriarse a temperatura ambiente de nuevo para permitir la captura posterior. Además, se recomienda disolver el precursor poco antes de iniciar la síntesis y añadir la base directamente en la solución precursora.
El control de calidad de las radiosondas de carbono-11 debe diseñarse racionalmente para un flujo de trabajo continuo y rápido. Sin embargo, los parámetros más importantes para los estudios de cultivo celular son la pureza radioquímica y la actividad molar para obtener resultados válidos. La evaluación correcta de la actividad molar requiere un método HPLC analítico robusto y la curva de calibración debe cubrir el rango de concentración del producto final. La parte difícil para los radiosondas es lograr una concentración por encima del límite de cuantificación (LOQ) debido a pequeñas cantidades, que se producen durante la radiosíntesis. Por lo tanto, el arte es encontrar el equilibrio entre las actividades molares altas para evitar la saturación del receptor y las concentraciones lo suficientemente altas como para seguir siendo capaz de cuantificar la señal no radioactiva.
[11C] Snap-7941 se confirmó que era un sustrato potente del transportador P-gp humano, ya que no se observó acumulación en las células MDCKII-hMDR1 no tratadas o tratadas por vehículodebido de un flujo rápido. Por el contrario, las configuraciones experimentales (células MDCKII-WT o MDCKII-hMDR1 prebloqueadas) proporcionaron resultados similares (acumulación de [11C]SNAP-7941), apoyando la versatilidad de este ensayo in vitro. Las células MDCKII-hMDR1 son muy adecuadas para experimentos LigandTracer debido a su transfección estable, crecimiento rápido y persistente contra el estrés de cizallamiento causado por el plato de cultivo celular giratorio. Por lo tanto, la falta de una ingesta de [11C]SNAP-7941 en el cerebro de ratas y ratones puede ocurrir causada por el eflujo a través del transportador P-gp. Debido a la transfección de las células renales caninas con la proteína de resistencia multifármaco humana 1 (hMDR-1, P-gp), el valor predictivo de este método para la unión del transportador de eflujo en humanos es alto, lo que es favorable en términos de una futura aplicación clínica. Sin embargo, hasta ahora, no se verificó la selectividad frente a otro transportador de eflujo. Por lo tanto, se pueden utilizar otras líneas celulares, expresando diferentes transportadores prominentes de eflujo como la proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) o proteína de resistencia múltiple-1 (MRP-1), para estudiar las interacciones hacia estos transportadores. El método es en comparación con la acumulación clásica o ensayos de transporte muy simple y da resultados inmediatamente cualitativos. Además, la mayor ventaja es que esta tecnología permite evaluar la interacción directa del trazador PET y el objetivo en tiempo real, en contraste con el experimento convencional utilizando cuantificación indirecta (principalmente desplazamiento). Además, el software de radioensayo en tiempo real proporciona flexibilidad experimental (por ejemplo, corrección de descomposición de nucleidos, tiempo de medición y posiciones, etc.) y, por lo tanto, alta libertad para los usuarios. Por otro lado, las limitaciones del método incluyen un bajo rendimiento de la muestra, ya que solo se puede medir una placa de celda a la vez. Además, deben tenerse en cuenta algunas otras cuestiones técnicas y operativas: la tecnología descrita es muy sensible a la radiación de fondo; por lo tanto, las fuentes de radiación deben mantenerse a distancia y se debe hacer hincapié en la medición de fondo antes del experimento. Otro problema relacionado con los experimentos a temperaturas más altas que la temperatura ambiente, es el calentamiento del soporte inclinado: la evaporación del medio de cultivo celular podría afectar al detector. En lugar de calentar, todo el dispositivo se coloca preferentemente en la incubadora. Además, el método se limita a las líneas celulares adherentes. A través de la rotación de la placa de cultivo celular, las células sensibles al estrés cortante pueden desprenderse del plato, lo que puede conducir a resultados no válidos.
Sin embargo, si el experimentador presta atención a estos inconvenientes menores, el método ofrece resultados rápidos y fiables para el análisis del comportamiento cinético de los pet-trazadores preclínicos.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Fondo De Ciencia de Austria (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Agradecemos el apoyo técnico de T. Zenz y A. Krcal. Además, agradecemos a K. Pallitsch la preparación del AgOTf y H. Spreitzer por distribuir el precursor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
| Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
| Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
| Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
| Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
| Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
| NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
| Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
| SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
| Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
| Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
| Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
| Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
| Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
| PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| [11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
| TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
| N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
| Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
| Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
| NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
| Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
| 430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
| Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
| Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
| g-spectrometer | g-spectrometer | ||
| Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
| Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
| Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
| HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
| inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
| Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| In vitro experiments | |||
| DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
| (±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
| DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
| Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
| Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
| LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
| GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
| Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
| Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
References
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![Aspecto técnico de la síntesis automatizada y evaluación cinética en tiempo real de [<sup>11</sup>C]SNAP-7941](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59557.jpg)
