Technisch aspect van de geautomatiseerde synthese en real-time kinetische evaluatie van [¹¹C] SNAP-7941

Summary

Hier vertegenwoordigen we een protocol voor de volautomatische radioactieve labeling van [¹¹C] SNAP-7941 en de analyse van de real-time kinetiek van deze pet-Tracer op P-GP die cellen uitdrukt en niet uitdrukt.

Abstract

Positron emissie tomografie (PET) is een essentiële moleculaire beeldvormings techniek die inzicht geeft in trajecten en specifieke gerichte radioliganden gebruikt voor in vivo onderzoek. Binnen dit protocol wordt een robuuste en betrouwbare, op afstand bestuurde radio synthese van [¹¹C] SNAP-7941, een antagonist van de melanin-concentratie hormoonreceptor 1, beschreven. De radio synthese begint met de geproduceerde cyclotron [¹¹c] co₂ , die vervolgens verder reageert via een gasfase overgang naar [¹¹c] ch₃otf. Vervolgens wordt deze reactieve intermediair geïntroduceerd in de precursor oplossing en vormt de respectieve radio Tracer. Chemische en de radiochemische zuiverheid worden bepaald door middel van RP-HPLC, routinematig geïmplementeerd in het radiofarmaceutische kwaliteitscontroleproces. Daarnaast wordt de molaire activiteit berekend omdat het noodzakelijk is voor de volgende real-time kinetische onderzoeken. Bovendien wordt [¹¹C] SNAP-7941 toegepast op MDCKII-WT-en Mdckii-hMDR1-cellen voor het evalueren van de impact van p-Glycoproteïne-expressie (p-GP) op celaccumulatie. Om deze reden wordt de P-GP die de cellijn uitdrukt (MDCKII-hMDR1) gebruikt zonder of met blokkering voorafgaand aan experimenten door middel van het P-GP substraat (±)-verapamil en de resultaten worden vergeleken met de waargenomen voor de wild type cellen. De algehele experimentele aanpak toont het belang aan van een nauwkeurig tijdbeheer dat essentieel is voor elke preklinische en klinisch studie met behulp van PET-tracers radioactief gelabeld met kortstondige nucliden, zoals Carbon-11 (halfwaardetijd: 20 min).

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 werd geëvolueerd als de eerste positron emissie tomografie (PET)-Tracer gericht op de melinconcentratie hormoonreceptor 1 (MCHR1)-een receptor voornamelijk betrokken bij de centrale regulering van de eetlust en voedselinname¹. Koolstof-11-etikettering van Snap-7941, een goed gekenmerkte MCHR1 antagonist, leverde de authentieke Pet-Tracer^2,3,4,5op. Volledig geautomatiseerde radio synthese is echter zeer uitdagend in termen van tijd werkzaamheid en reproduceerbaarheid met de kortstondige radionuclide Carbon-11 die een halfwaardetijd van 20 min.⁶biedt. De totale synthese tijd moet tot een minimum worden beperkt, en als vuistregel mag niet meer dan 2-3 half-Lives (dat wil zeggen, rond 40-60 min voor koolstof-11)⁷. In het bijzonder moeten synthese procedures voor radiotracers gericht op receptor systemen met lage expressie dichtheden uitgebreid worden geoptimaliseerd om voldoende opbrengsten en bijgevolg hoge molaire activiteit⁸te verkrijgen. De synthetische strategie volgt vaak de productie van radionuclide binnen een cyclotron en de release van [¹¹C] co₂ aan de synthesizer. Daar wordt [¹¹c] co₂ voor het eerst gereduceerd tot [¹¹c] ch₄ en vervolgens gereageerd met jodium om [¹¹c] ch₃I te leveren via de gasfase methode^9,10. Verdere behandeling met Silver triflaat rendementen [¹¹C] ch₃otf direct on-line. Daarna wordt deze reactieve koolstof-11 gelabelde intermediair geïntroduceerd in een oplossing die het precursor molecuul bevat. Een geautomatiseerde radio synthese omvat bovendien een zuiveringsproces met semi-preparatieve RP-HPLC, inclusief de daaropvolgende formulering van het product dat geschikt is voor preklinisch onderzoek en klinische studies.

Ongeacht de halfwaardetijd van de radionuclide en de tijds inspanning van de radio synthese, is de farmacokinetische component van een radiofarmaceuticum het meest kritische onderdeel dat moet worden geëvalueerd tijdens de ontwikkeling van de PET-Tracer. In termen van neuroimaging, hersenen binnenkomst van de PET-Tracer is de belangrijkste voorwaarde. Echter, de bloed-hersen barrière (BBB), een "veiligheidsgrens" van de hersenen, spreekt sterk uit effluxtransporters die kleine moleculen kunnen lossen (bijv. PET-tracers) en hun toepasbaarheid efficiënt belemmeren.

Een enorm nadeel tijdens preklinische evaluatie zijn onverwachte interacties naar deze effluxtransporters, die vaak niet worden herkend in in vitro experimenten en die leiden tot falen van de PET-Tracer in vivo, zoals waargenomen voor [¹¹C] SNAP-7941. μPET Imaging bij ratten toonde een lage hersen accumulatie aan, die dramatisch toenam na toediening van de P-GP-remmer tariquidar¹¹. Deze gegevens suggereerden dat [¹¹C] SNAP-7941 een substraat is van dit effluxtransporter systeem dat ligand binding met centrale MCHR1 belemmert. Helaas is er nog steeds een gebrek aan adequate in vitro modellen waardoor de voorspelling van BBB penetratie in een vroeg stadium van Tracer ontwikkeling.

Hier beschrijven we de geautomatiseerde synthese van [¹¹C] SNAP-7941 met behulp van een synthesizer voor Carbon-11 methylations. De nadruk van dit werk is om een overzicht te geven over hoe een opeenvolgende experimentele aanpak te organiseren, met inbegrip van de geautomatiseerde synthese, kwaliteitscontrole en opeenvolgende in vitro evaluatie met de zeer kortstondige nuclide Carbon-11.

Ten eerste worden de belangrijkste stappen voor een succesvolle radio synthese met minimale tijd uitgaven en maximale opbrengst beschreven. Vervolgens wordt een betrouwbare kwaliteitscontroleprocedure ingesteld waardoor de radio Tracer beschikbaar is voor potentiële klinische studies en voldoet aan de criteria van de Europese Farmacopee¹². Kwantificering van de molaire concentratie en berekening van de respectieve molaire activiteit is een essentiële eis voor de opeenvolgende kinetische metingen.

Ten slotte wordt een nieuwe en eenvoudige in-vitro methode gepresenteerd die de interacties van [¹¹C] snap-7941 naar de effluxtransporter, P-GP (hMDR1), evalueert. Het voorgestelde kinetische model maakt gebruik van een eenvoudig te hanteren apparaat dat een onmiddellijke interpretatie van gegevens mogelijk maakt en minimale celkweek inspanning vereist¹³.

Protocol

Let op: in het volgende protocol zijn meerdere stappen betrokken die behandeling en manipulatie van radioactiviteit vereisen. Het is belangrijk dat elke stap in overeenstemming is met de afdeling stralingsveiligheid van het Instituut en de respectieve nationale wetgever. Het is verplicht om blootstelling aan ioniserende straling voor de betrokken exploitanten tot een minimum te beperken volgens het ALARA-principe ("zo laag als redelijkerwijs haalbaar").

1. tijdbeheer en planning van het experiment

Opmerking: de korte halfwaardetijd van Carbon-11 vereist een nauwkeurig tijdbeheer om het verlies van radioactiviteit te minimaliseren (Figuur 1). Het is belangrijk dat elke betrokken persoon zijn verantwoordelijkheidsgebied en het tijdstip van de respectieve actie kent. Voor het opzetten van een real-time kinetische experiment van [¹¹C] SNAP-7941 zijn ongeveer vier personen nodig voor een soepel proces.

1. Organiseer een producer voor [¹¹C] SNAP-7941.
2. Informeer de exploitant van de kwaliteitscontrole die de specificatie evaluatie uitvoert, de berekening van de massaconcentratie en de molaire activiteit van de begintijd van de synthese.
3. Houd de real-time kinetische experimenteerder klaar voor verdunning berekening en het uitvoeren van het experiment.
4. Instrueer de runner voor het overbrengen van de radioactiviteit naar de respectieve plaats op het respectieve tijdstip.

2. geautomatiseerde synthese van [¹¹C] SNAP-7941 voor preklinisch gebruik

1. Voorbereiding van de synthesizer (figuur 2).
   1. Schakel de synthesizer in, vereiste technische gassen (helium en waterstof) en de synthesizer Control software Tracerlab. Selecteer de respectieve synthese volgorde snap.
   2. Was v1-v3 eenmaal met water en tweemaal met aceton via de reactor en de HPLC-klep, hetzij op de belasting of Injecteer de positie in de lus afval fles.
   3. Droog alle bijbehorende lijnen in en uit de reactor via de injectie klep met een continue helium stroom geactiveerd via V18.
   4. Verwarm de [¹¹c] l₃I-val en de [¹¹c] ch₃OTf-val onder een helium stroom van 100 ml · min^-1 tot 200 °C via V24, V25, V29, V15, v9, V17 en V32/V33 met vrijstaande reactor.
   5. Controleer hetzelfde traject voor lekkages (met aangesloten reactor) met een helium debiet van 100 mL · min^-1. Dichtheid is gegarandeerd wanneer de stroom daalt tot onder de 4 mL · min^-1.
   6. Schakel de HPLC-pomp (5-10 mL · min^-1) in en was de HPLC-leidingen en de injectie klep met acetonitril/water (50/50, v/v) en de HPLC-lijnen met het HPLC-oplosmiddel via V14 in de lamp.
   7. Leeg de lamp via V11 en V12 in de afval fles met een helium stroom via V19. Was de respectievelijke lijnen met water uit V6 weer via V11 en V12 met een helium stream via V18.
   8. Was V5 met ethanol en v4 met water via V11 en V12 in de product Collection VIAL (PCV) met behulp van een helium stroom via V18, dan leeg de PCV via V13 in de afval fles met een helium stroom via V20.
   9. Schakel de HPLC-pomp uit, schakel over naar het oplosmiddel voor de synthese ((waterig ammoniumacetaat (2,5 g · L^-1)/azijn zuur 97,5/2,5 v/v; pH 3.5)/acetonitril 75/25 v/v), bevestig de semi-preparatieve HPLC-kolom en evenwichts de kolom (debiet van 5 mL · min^-1).
   10. Vul de reagentia in voor de synthese en zuivering: 1,5 mL water (v2), 4,5 mL 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL 96% ethanol (V5), 10 mL water (V6) en 90 mL water (Bulb).
   11. Bevestig een nieuwe lus afval flacon; een productflacon (geëtiketteerd en uitgerust met een beluchting naald) aan V13 en de vloeibare stikstof.
   12. Voorwaarde een SPE-cartridge (Solid phase-extractie) met 10 mL 96% ethanol en 20 mL water en bevestig deze tussen V11 en V12.
   13. Start de pre-run sequentie 20 min voor aanvang van de synthese, bestaande uit het verwarmen van de [¹¹C] co₂ -val tot 400 °c en spoelen van de val met een helium stroom van 50 ml · min^-1via V27 (2 min). Spoel vervolgens de [¹¹C] co₂ -val voor 3 min met waterstofgas (120 ml · min^-1) en koel af tot onder 40 °c.
   14. Los 1 mg precursor op in 400 μL acetonitril (voor DNA-synthese, < 10 H₂O), breng de oplossing over naar de reactie en voeg 5,5 ΜL tbah (264 mg · ml^-1 in methanol) toe. Bevestig de reactor aan zijn respectieve positie.
   15. Sluit de hete cel en zet de onder druk van de hete cel aan.
   16. Bevestig de start van het koelproces van de l₄ -val met vloeibare stikstof tot-75 °c.
   17. Laat de radioactiviteit los wanneer de temperatuur is bereikt.
2. Productie van cyclotron [¹¹C] co₂
   Opmerking: de stappen 2.2.1-2.2.4 worden gelijktijdig uitgevoerd voor de bereiding van de radiosynthese module (Zie ook Figuur 1).
   1. Zet de magneet van de cyclotron aan.
   2. Selecteer het doel ¹¹C-Co₂ en start de Beam 65 μA.
   3. Bevestig het begin van de bestraling door op de knop te drukken Start bestraling
   4. Stop de balk en bevestig het vrijkomen van radioactiviteit in de synthesizer door de knop leveringte duwen, nadat de gewenste hoeveelheid radioactiviteit is bereikt (ca. 120 gbq na 30 min).
3. Uitvoering van de volledig geautomatiseerde radio synthese
   1. Bevestig dat het systeem klaar is om de radioactiviteit te ontvangen en het geautomatiseerde proces te starten
   2. Het volgen van het volgende geautomatiseerde proces.
      1. Controleer of de [¹¹c] co₂ automatisch wordt overgebracht van de cyclotron naar de synthese-eenheid via V26 (ca. 4 min) en dat de [¹¹c] co₂ wordt gevangen op de moleculaire zeef geïmpregneerd met nikkel als katalysator ([ ¹¹ C] CO₂ -val) bij kamertemperatuur.
      2. Spoor als de [¹¹C] co₂ -val automatisch eerst wordt gespoeld met helium (50 ml · min^-1) en vervolgens met waterstofgas (120 ml · min^-1). Merk vervolgens op dat V27 en V25 gesloten zijn en dat de gevangen^[11c] co₂ inclusief het waterstofgas wordt verhit tot 400 °c en dat de gevormde [¹¹c] ch₄ verder wordt getransporteerd naar de voorgekoelde [¹¹c] ch₄ val en gevangen daar.
      3. Monitor dat V10 gesloten is, v9 geopend (naar de jodium kolom) en [¹¹c] ch₄ wordt opnieuw vrijgegeven door de [¹¹c] ch₄ -val langzaam tot 80 °c te verwarmen en in de circulatie eenheid te worden vervoerd met een helium stroom via V10 (uitlaat uitgang). En verder controleren of [¹¹c] ch₄ wordt omgezet in [¹¹c] ch₃i in de circulatie-eenheid, die ongeveer 3 min duurt en de gevormde [¹¹c] ch₃i continu vastzit op de [¹¹c] CH₃ik val.
      4. Zorg ervoor dat de uitlaatklep V16 wordt geopend en de [¹¹C] ch₃I-val wordt verhit tot 90 °c met een stroom helium (20 ml · min^-1) via V24. Hierbij worden mogelijke bijproducten verwijderd en is V16 gesloten.
   3. Bevestig dat de [¹¹C] ch₃I klaar is om in de reactor te worden losgelaten.
   4. Bewaak het volgende geautomatiseerde proces: Controleer of de^[11c]_{CH 3}i-val wordt verhit tot 190 °c en de gevormde [¹¹c] ch₃i wordt in de reactor vrijgegeven via de [¹¹c] ch₃otf-trap (V32 en V33, nog steeds bij 200 ° C), V7 en V8 onder een continue helium stroom (10-25 mL · min^-1, V24). Tijdens dit proces moeten V21 en V23 (uitlaat uitgang) open zijn.
   5. Bevestig dat de radioactiviteit in de reactor is aangekomen, zodra de hoeveelheid radioactiviteit in de reactor niet meer omhoog gaat.
   6. Het volgen van het volgende geautomatiseerde proces en het voorbereiden van handmatige interventie, indien nodig
      1. Controleer of V23, V21 en V8 automatisch worden gesloten en het reactiemengsel wordt verhit tot 75 °C. Na 3 min, observeren als de reactor wordt gekoeld met vloeibare stikstof tot de temperatuur lager is dan 35 °C. Zorg er vervolgens voor dat het reactiemengsel met 1,5 mL water via v2 wordt blust. Tijdens dit proces moeten V21 en V23 (uitlaat uitgang) open zijn.
      2. Spoor als V21 en V23 zijn gesloten en het reactiemengsel wordt overgebracht naar de HPLC-injectie klep door een vloeistof detector in de HPLC-lus (5 mL) te passeren. Als het reactiemengsel automatisch op de HPLC-kolom wordt geïnjecteerd.
   7. Observeer het chromatogram en snijd de product piek handmatig af via de knop piek start. Druk piek einde wanneer het product piek signaal daalt tot onder ongeveer 400 CPS na een retentietijd van ongeveer 8-10 min (debiet: 5 ml · min^-1, Figuur 3).
   8. Zet een extra helium stroom aan om de bollen lediging te versnellen.
   9. Controleren of de gloeilamp leeg is en de afval fles ziet: Controleer of de lamp wordt geleegd via V11, de SPE-cartridge en V12 in het afval met een helium stroom via V19 en een extra helium lijn en als het product op de SPE-cartridge blijft.
   10. Bevestig dat de lamp helemaal leeg is.
   11. Monitoring van het geautomatiseerde proces van SPE-zuivering en productoverdracht
       1. Controleer of de SPE-cartridge met 10 mL water wordt gewassen via V6, V11 en V12 in het afval en of ethanol het product in de PCV verwijdert via V5, V11 en V12. Tot slot, observeren als 0,9% NaCl wordt toegevoegd aan de PCV via v4, V11 en V12 om het product te verdunnen.
       2. Zorg ervoor dat de product oplossing wordt overgebracht via V13 en een steriel filter in de Injectieflacon van het eindproduct met een helium stroom via V20.
   12. Bevestig dat het product volledig is overgebracht.

3. kwaliteitscontrole (QC)

Opmerking: de kwaliteitscontrole van radiofarmaceutica omvat het meten van de volgende parameters:

• Radiochemische zuiverheid en molaire activiteit (RP-HPLC)
• Oplosmiddelresten (gaschromatografie, GC)
• Osmolaliteit (dampdruk osmometer)
• pH (pH-meter)
• γ-spectrum/radionuclide zuiverheid (γ-spectrometer)
• Halfwaardetijd/radionuclide zuiverheid (dosis Kalibrator)

Alle fysisch-chemische parameters worden bepaald vóór de vrijgave van het product en de waarden moeten in het gedefinieerde kwaliteitsparameter bereik liggen.

1. Bereiding van de kwaliteitscontrole apparatuur
   1. Start de bereiding 30 min vóór het einde van de synthese.
   2. Bereid een conische injectieflacon in een lood afgeschermde container en een afgeschermde spuit van 1 mL met een bijgevoegde naald.
   3. Bereid een referentiestandaard oplossing van SNAP-7941 (10 μg · mL^-1) in water voor HPLC.
   4. Schakel de pH-meter, de gaschromatograaf en de gebruikte gassen, de osmometer en alle componenten van de HPLC in.
   5. Schakel de HPLC-controle software in en selecteer de specifieke kolom en de respectieve methode voor [¹¹C] SNAP-7941 (mobiele fase: (water/azijnzuur 97,5/2,5 v/v; 2,5 g. L^-1 ammoniumacetaat; pH 3.5)/acetonitril 70/30 v/v; debiet: 1 ml · min ^-1) en schrijf een voorbeeld lijst met twee metingen (standaard en product). Start de methode voor conditionering van de kolom.
   6. Injecteer na 10 minuten conditionering 20 μL van de SNAP-7941-referentieoplossing met een Hamilton-spuit en start de analyse-run.
   7. Was de Hamilton spuit tweemaal met acetonitril en water na injectie.
   8. Start de GC-besturingssoftware en schrijf de voorbeeld lijst.
2. Kwaliteitscontrole uitvoeren
   1. Meet de absolute radioactieve opbrengst van het product na het einde van de synthese en breng 100 μL van het product over in een reactieflacon met de bereide met lood afgeschermde spuit voor kwaliteitscontrole.
      Opmerking: alle gegevens die zijn verkregen van de kwaliteitscontrole moeten worden gedocumenteerd in overeenstemming met de nationale voorschriften.
   2. Analytische HPLC: meet de radiochemische zuiverheid en chemische zuiverheid en Informeer de persoon die de leiding heeft over de celkweek experimenten onmiddellijk van de resultaten.
      1. Trek 40 μL van het QC-monster en Injecteer het in de HPLC. Start de hardloopsessie door de arm van de injectie klep te verplaatsen van de lading naar het injecteren (Figuur 3).
         Opmerking: tijdens de run (8 min) kunnen andere metingen van het protocol worden uitgevoerd om zo veel mogelijk verval te voorkomen.
      2. Open het chromatogram en integreer alle pieken in het radioactiviteitskanaal. Vergelijk de retentietijd van het product (5,0-7,0 min) met de retentietijd van de referentiestandaard. Vergelijk het gebied onder de curve in procenten van alle geïntegreerde pieken. De product piek moet meer dan 95% (radiochemische zuiverheid) van de totale geïntegreerde gebieden (radiokanaal) zijn.
      3. Integreer het signaal in het UV-kanaal om de chemische zuiverheid te bepalen. De belangrijkste onzuiverheid is meestal de precursor SNAP acid op 2.8-3.5 min. De concentratie van [^NATC] SNAP-7941 wordt berekend op basis van de kalibratiecurve na integratie. Bereken de concentratie van SNAP-7941 in μmol · mL^-1 en bepaal de molaire activiteit door middel van de volgende vergelijking:
         
   3. Voor gaschromatografie, breng 20 μL van het kwaliteitscontrole monster in een speciale glazen injectieflacon aan. Plaats deze in de autosampler en start de meting. Nadat de meting is voltooid, opent u het chromatogram en schrijft u het aantal automatisch geïntegreerde pieken af. Het monster mag niet meer dan 410 ppm acetonitril en 10% ethanol bevatten.
   4. Osmolaliteit: plaats een papiervoorbeeldschijf op de speciale holle en breng 10 μL van het monster. Druk op de knop sluiten voor het meten van de osmolaliteit. Na 3 minuten geeft het toestel de osmolaliteit weer die in een bereik van 190-500 mosm · kg^-1moet liggen.
   5. pH: was de elektrode met water. Meet de pH door de elektrode in het monster te steken. De pH moet in een bereik van 5.0-8.5. Was de elektrode na het meten opnieuw en plaats de elektrode in de referentie-pH-oplossing.
   6. γ-spectrum: plaats het QC-monster in de γ-spectrometer, open de controlerende software en start de meting. Stop de meting en noteer de gemeten energie die 511 keV (Range 420-520 keV) moet zijn. Open het menu bestand en veilig het bestand met de respectieve batchnummer. Herinner het opgeslagen spectrum in de speciale software en print het spectrum.
   7. Half-Life: meet de activiteit van het QC-monster tweemaal met behulp van de dosis kalibrator. Noteer de respectievelijke tijdstippen en bereken de halveringstijd van de exponentiële.
3. Release
   1. Nadat alle parameters zijn getest en de resultaten in overeenstemming zijn met de richtlijnen van de Oostenrijkse autoriteiten, laat u de radio Tracer los. De exploitant moet de juistheid van de gegevens ondertekenen.

4. evaluatie van interacties naar de P-GP Transporter

1. Celcultuur
   1. Start de laminaire luchtstroom (LAF) van de werkbank en reinig de Bank ten minste 15 minuten voordat u begint te werken.
   2. Meng het celkweekmedium onder steriele omstandigheden in de LAF met 10% FCS (50 mL) en 0,5% van de antibiotica (2,5 mL) met een steriele volumetrische pipet met behulp van een geautomatiseerd Pipetteer hulpmiddel.
   3. Thaw MDCKII-hMDR1 en MDCKII-WT cellen en cultiveren in een T75 of T175 celkweek kolf 10-14 dagen vóór de experimenten onder aseptische condities (LAF).
   4. Verander het medium op de volgende dag om alle niet-aanhandige en apoptotische cellen te verwijderen.
   5. Vervang elke drie dagen het medium met verse één (12 mL voor de T75 en 23 mL voor de T175 celkweek kolf).
   6. Splits de cellen op basis van het tijdschema van experimenten op verse kolven of op celcultuurgerechten bij een samenvloeiing van 80% om dubbelgroei te voorkomen.
2. Celvoorbereiding voor experimenten
   1. Splits de cellen twee dagen voor experimenten en zaaizaad in een concentratie van 2,5 x 10⁵ cellen per 2 ml in een schuin vlak van een celkweek schotel (Figuur 4). Gebruik een automatische celteller of een Neubauer-telkamer om de cellen te tellen en de juiste kloof verhouding te berekenen.
   2. Verwijder het medium één dag voor de experimenten, was de cellen op de kweek schaal met 4 mL DPBS en voeg verse 5 mL celkweekmedium toe. Plaats de schaal horizontaal in de incubator.
   3. Was de cellen met DPBS ten minste 0,5 h voor experimenten en vervang met 2 mL FBS vrije medium. Onderzoek de samenvloeiing en celmorfologie met een microscoop.
3. Het uitvoeren van de experimenten in drie verschillende opstellingen.
   1. Gebruik de Petri schaal voor de experimenten zoals beschreven in 4.2.3.
   2. Behandel de cellen voor 0,5 h voor experimenten met 10 μM (±)-verapamil hydrochloride.
   3. Voeg 0,98 μL verapamil-stamoplossing (20,4 mM (±)-verapamil-hydrochloride in DMSO) toe. De uiteindelijke DMSO-inhoud is ≤ 0,05% tijdens de behandeling.
   4. Inincuberen de cellen voor 0,5 h met de voertuig bediening (DMSO). Gebruik hetzelfde volume als gebruikt voor de medicamenteuze behandeling.
4. Experimenten van de real-time assay (voor alle drie de opstellingen)
   1. Schakel het apparaat in, de computer en zorg ervoor dat ze correct zijn aangesloten en open vervolgens de besturingssoftware.
   2. Kies de optie één doel , Ontgrendel de sjabloon en pas de volgende instelling aan:
      Aantal posities: 2 (twee)
      Detectie tijd (SEC): 3 (drie)
      Detectie vertragingstijd (n): 2 (twee)
      Naam van de eerste fase: Baseline
   3. Plaats de celkweek schaal in de schuine ondersteuning van het apparaat, zorg ervoor dat de celpool zich aan de onderzijde bevindt en bedekt met celkweekmedium.
   4. Start de knop uitvoeren via Start . Het systeem vraagt om het bestand op te slaan. Kies een bestandsnaam en een opslag pad. Het bedieningscentrum verschijnt en de basislijn meting begint (de celkweek schotel ondersteuning begint te roteren).
   5. Selecteer onder andere opties:
      Tijdschaal: minuten
      Nuclide correctie: Carbon-11
   6. Vink alle vakjes aan onder curven in grafiek (achtergrond (rood), doel (blauw) en doel minus achtergrond (zwart)).
   7. Verkrijg kwaliteitscontrole parameters: molaire activiteit [GBq. μmol^-1] en activiteitsconcentratie [MBq.ml^-1] aan het einde van de synthese.
   8. Bereken het respectieve Tracer volume voor 15 nM van [^NATC] SNAP-7941 in het assay volume van 2 ml.
      
      
   9. Bereid de pipet voor op het respectieve volume en een aliquot van het [¹¹C] SNAP-7941 product in een lood afscherming.
   10. Klik op uitvoeren onderbreken in het venster van het bedieningscentrum. Wacht tot de schotel rotatie stopt en de zijbalk met de titel gepauzeerd en de volgende fase optreedt.
   11. Open het deksel van het real-time kinetische apparaat. Draai de kweek schotel ondersteuning 90 ° naar links. Voeg het berekende volume Tracer toe en draai terug naar de beginpositie. Sluit vervolgens de deksel van het apparaat. Druk onmiddellijk op de knop Doorgaan voor het starten van het experiment.
   12. Beëindig het experiment na 20 minuten door onderbreken te selecteren en vervolgens de uitvoering te beëindigen (druk op uitvoeren in de balk aan de zijkant).
5. Gegevensanalyse en-verwerking met behulp van een statistiek software
   1. Open de real-time besturingssoftware. Klik op geopende bestanden om de vereiste kinetiek op te roepen. De kinetiek wordt geïllustreerd in het Control Center-venster.
   2. Kies door met de rechtermuisknop direct op de kinetiek- export curvente klikken. Sla het tekstbestand met de onbewerkte gegevens op. Open het Statistiekprogramma en plak het onbewerkte gegevensbestand van real-time experimenten.
   3. Begin met de tijd (x-as) bij toevoeging van radio Tracer (exclusief achtergrond meting) en Normaliseer tot een procent signaal van de maximale CPS (tellingen per seconde).
   4. Laad alle genormaliseerde gegevens naar een nieuw GraphPad Prism-bestand.
   5. Bereken de gemiddelde waarden en de standaarddeviatie.
   6. Illustreer de verkregen gegevens als grafiek waarin de afwijking (verhogingspercentage) van de Tracer-opname van alle drie de ingestelde ups wordt aangegeven.

Representative Results

De volledig geautomatiseerde radio synthese van [¹¹c] SNAP-7941 leverde 5,7 ± 2,5 gbq (4,6 ± 2,0% bij EOB, 14,9 ± 5,9% op basis van [¹¹c] ch₃otf; n = 10) van het geformuleerde product. De totale synthese duurde ongeveer 40 minuten, waarbij 15 minuten nodig waren voor de bereiding van [¹¹C] ch₃otf via de gasfase methode, nog eens 5 minuten nodig waren voor radioactieve labeling van de precursor, gevolgd door 10 min van semi-preparatief RP-HPLC-zuivering en 10 min voor de C18-cartridge Solid phase-extractie en-formulering. Vervolgens werd een kleine hoeveelheid (ca. 100-200 μL) afgeleverd aan de persoon die verantwoordelijk was voor de kwaliteitscontrole, terwijl de originele productflacon met de gebruiksklare Tracer werd doorgegeven aan de experimenteerder van de real-time kinetische analyse.

De kwaliteitscontrole werd binnen 10 minuten na het einde van de synthese voltooid. De molaire activiteit was in een bereik van 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10) en de radiochemische zuiverheid was altijd > 95%. Alle andere parameters (pH, osmolaliteit, residuele oplosmiddelen) voldeed aan de vrijgave criteria. Voor de real-time kinetische assay werden drie verschillende experimentele opstellingen gekozen: (A) behandelde en niet-behandelde (voertuig) MDCKII-WT-cellen, (B) niet behandeld of behandeld met voertuig MDCKII-hMDR1 cellen en (C) de laatste cellijn met blokkering voorafgaand aan de real-time kinetische assay van de transporter met (±)-verapamil. Het toepassen van [¹¹C] SNAP-7941 op de wild type CELLIJN MDCKII-WT (p-GP niet-uitdrukken) en Mdckii-HMDR1 (p-GP uitdrukken) toont een ander kinetische gedrag, omdat er een snelle accumulatie is in de wild type cellijn, terwijl er geen accumulatie werd waargenomen voor de MDCKII-hMDR1 cellen. Echter, het blokkeren van de P-GP Efflux Transporter inMDCKII-hMDR1 cellen met (±)-verapamil leidde tot een vergelijkbare real-time kinetische zoals reeds gezien voor de wild type cellijn (Figuur 5).

Figuur 1: overzicht van de werkstroom. Werkstroom van de radio synthese, kwaliteitscontrole en prestaties van de real-time kinetische meting van [¹¹C] SNAP-7941. De zwarte pijlen geven de transportwijze van de radioactiviteit aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Radiosynthetische schema van de geautomatiseerde synthesizer. Schakel circuit van de geautomatiseerde synthesizer, beginnend met de circulatie-eenheid voor [¹¹c] ch₃I/[¹¹c] ch₃otf productie, reactor voor de invoering van de activiteit in de precursor oplossing en SPE-zuivering (SPE = vaste fase extractie; PCV = productverzameling flacon). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: representatieve chromatogrammen van de volledig geautomatiseerde radio synthese van [¹¹C] snap-7841. De semi-preparatieve RP-HPLC-chromatogram wordt aan de bovenzijde en de analytische na zuivering op de bodem geïllustreerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: celkweek schotel voorbereiding voor real-time experimenten. Stap 1 omvat de zaaien van 2,5 x 10⁵ tot 1 x 10⁶ afhankelijk van het celtype en de groeisnelheid. Vervolgens wordt het cultuur gerecht in een schuin vlak (ongeveer 30-45 °) geplaatst. Daarom kan het meegeleverde metalen apparaat of de deksel van een celkweek schotel in de incubator worden gebruikt om de schuine positie van het gerecht te stabiliseren. De dag na (24 h) wordt het schaaltje horizontaal aangepast en wordt er een vers celkweekmedium toegevoegd om het celoppervlak volledig te bedekken. Op de dag van het experiment, cel levensvatbaarheid en samenvloeiing worden onderzocht. Volgens het experimentele protocol worden de cellen gewassen met DPBS, het medium wordt vervangen door serumvrij medium (2 mL), en het cultuur gerecht wordt verplaatst naar een schuine positie tot aan het begin van de experimenten. Voortaan kunnen de cellen met de remmer of het voertuig worden behandeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: real-time kinetische metingen van [¹¹C] SNAP-7941. Representatieve real-time kinetiek van [¹¹C] snap-7941 worden weergegeven in drie verschillende set-ups: met behulp van mdckii-WT-cellen; MDCKII-hMDR1 cellen zijn vooraf geblokkeerd met (±)-verapamil als P-GP remmer en MDCKII-hMDR1 cellen zonder verstopping. De y-as illustreert de mate van toename van de voorgeblokkeerde MDCKII-hMDR1-en WT-cellen in vergelijking met de resultaten van respectievelijk de onbehandelde of door het voertuig behandelde MDCKII-MDR1 cellen (geen opname, 0%). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De radio synthese van [¹¹C] SNAP-7941 werd vastgesteld op een commerciële synthese module. Vanwege de mogelijkheid om de voorbereidingsprocedure volledig te automatiseren, werd de radiosynthese bewezen betrouwbaar te zijn en werden verbeteringen in de stralingsbescherming van de exploitant gerealiseerd. De voorbereiding van de synthesizer heeft een enorme impact op de kwaliteit van de radio Tracer, vooral in termen van molaire activiteit. Het is dus essentieel om constant te werken onder inerte omstandigheden (bijv. helium atmosfeer) en alle lijnen te spoelen die zich vóór het reactie vaartuig bevinden (doellijn, [¹¹C] ch₃I productiecyclus en reactor (Zie Figuur 2)). Bovendien, het verwarmen van de respectieve vallen en ovens voor het begin van de synthese om vocht en atmosferische koolstof te verwijderen verhoogt de molaire activiteit op een voordelige wijze. Vooral de AgOTf kolom, geïmpregneerd met graphitized Carbon, is extreem gevoelig voor vochtigheid. Zelfs kleine hoeveelheden van elke bron van vocht verstoren de omzetting van [¹¹c] ch₃I naar [¹¹c] ch₃otf. Voor aanvang van de synthese moeten de [¹¹c] co₂ -trap en de [¹¹c] ch₃I-val opnieuw op kamertemperatuur worden afgekoeld om de daaropvolgende overvulling mogelijk te maken. Bovendien, het is aanbevolen om het ontbinden van de voorloper kort voor aanvang van de synthese en de basis rechtstreeks in de precursor oplossing toe te voegen.

De kwaliteitscontrole voor radiotracers van Carbon-11 moet rationeel worden ontworpen voor een continue en snelle workflow. De belangrijkste parameters voor celkweek studies zijn echter radiochemische zuiverheid en molaire activiteit om geldige resultaten te verkrijgen. De juiste beoordeling van de molaire activiteit vereist een robuuste analytische HPLC-methode en de ijkcurve moet het concentratiebereik van het eindproduct bestrijken. Het uitdagende deel voor radiotracers is om een concentratie te bereiken boven de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) als gevolg van kleine hoeveelheden, die worden geproduceerd tijdens de radio synthese. Vandaar dat de kunst is om de balans te vinden tussen hoge molaire activiteiten om te voorkomen dat de receptor verzadiging en hoog genoeg concentraties nog in staat zijn om het niet-radioactieve signaal te kwantificeren.

[¹¹C] SNAP-7941 werd bevestigd als een krachtig substraat van de humane P-GP Transporter, omdat er geen accumulatie werd waargenomen in de onbehandelde of door het voertuig behandelde MDCKII-hMDR1 cellen als gevolg van een snelle Efflux. Zowel de experimentele set-ups (MDCKII-WT of voorgeblokkeerde MDCKII-hMDR1-cellen) hadden daarentegen vergelijkbare resultaten (accumulatie van [¹¹C] SNAP-7941), wat de veelzijdigheid van deze in vitro assay ondersteunt. MDCKII-hMDR1 cellen zijn zeer geschikt voor LigandTracer experimenten als gevolg van hun stabiele transfectie, snelle groei en aanhoudende tegen afschuiving stress veroorzaakt door de roterende cel cultuur schotel. Het ontbreken van [¹¹C] SNAP-7941 opname in de rat en muizenhersenen kan daarom optreden veroorzaakt door Efflux door de P-GP Transporter. Vanwege de transfectie van Canine niercellen met de Human multi Drug Resistance proteïne 1 (hMDR-1, P-GP), is de voorspellende waarde van deze methode voor effluxtransporter binding bij de mens hoog, wat gunstig is in termen van een toekomstige klinische toepassing. Tot dusver werd de selectiviteit van andere effluxtransporter echter niet geverifieerd. Daarom kunnen andere cellijnen worden gebruikt, waarbij verschillende prominente effluxtransporters worden uitgesproken als het borstkanker resistentie proteïne (BCRP) of meervoudige resistentie proteïne-1 (MRP-1), om interacties naar deze transporters te bestuderen. De methode is in vergelijking met klassieke accumulatie of transport assays zeer eenvoudig en geeft onmiddellijk kwalitatieve resultaten. Bovendien is het grootste voordeel dat deze technologie de directe interactie van de PET Tracer en het doelwit in real-time kan evalueren, in tegenstelling tot het conventionele experiment met indirecte kwantificering (meestal verplaatsing). Daarnaast biedt de real-time radioassay software experimentele flexibiliteit (bijv. nuclide verval correctie, meet tijd en posities, enz.) en dus een hoge vrijheid voor gebruikers. Aan de andere kant, beperkingen van de methode omvatten een lage monsterdoorvoer, omdat slechts één cel schotel kan worden gemeten op een tijdstip. Bovendien moeten er nog enkele andere technische en operationele kwesties in aanmerking worden genomen: de beschreven technologie is zeer gevoelig voor achtergrondstraling; stralingsbronnen moeten dus op afstand worden bewaard en de nadruk moet worden gelegd op de achtergrond meting voorafgaand aan het experiment. Een andere kwestie met betrekking tot experimenten bij hogere temperaturen dan kamertemperatuur, is de verwarming van de hellende steun: verdamping van het celkweekmedium kan de detector beïnvloeden. In plaats van te verwarmen, wordt het hele apparaat bij voorkeur in de incubator geplaatst. Bovendien is de methode beperkt tot aanhandige cellijnen. Door de rotatie van de cel cultuur schotel, shear stressgevoelige cellen kunnen loskoppelen van het gerecht, wat kan leiden tot ongeldige resultaten.

Niettemin, als de experimenteerder aandacht besteedt aan deze kleine nadelen, levert de methode snelle en betrouwbare resultaten voor de analyse van het kinetische gedrag van preklinische PET-tracers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)