Hier vertegenwoordigen we een protocol voor de volautomatische radioactieve labeling van [11C] SNAP-7941 en de analyse van de real-time kinetiek van deze pet-Tracer op P-GP die cellen uitdrukt en niet uitdrukt.
Positron emissie tomografie (PET) is een essentiële moleculaire beeldvormings techniek die inzicht geeft in trajecten en specifieke gerichte radioliganden gebruikt voor in vivo onderzoek. Binnen dit protocol wordt een robuuste en betrouwbare, op afstand bestuurde radio synthese van [11C] SNAP-7941, een antagonist van de melanin-concentratie hormoonreceptor 1, beschreven. De radio synthese begint met de geproduceerde cyclotron [11c] co2 , die vervolgens verder reageert via een gasfase overgang naar [11c] ch3otf. Vervolgens wordt deze reactieve intermediair geïntroduceerd in de precursor oplossing en vormt de respectieve radio Tracer. Chemische en de radiochemische zuiverheid worden bepaald door middel van RP-HPLC, routinematig geïmplementeerd in het radiofarmaceutische kwaliteitscontroleproces. Daarnaast wordt de molaire activiteit berekend omdat het noodzakelijk is voor de volgende real-time kinetische onderzoeken. Bovendien wordt [11C] SNAP-7941 toegepast op MDCKII-WT-en Mdckii-hMDR1-cellen voor het evalueren van de impact van p-Glycoproteïne-expressie (p-GP) op celaccumulatie. Om deze reden wordt de P-GP die de cellijn uitdrukt (MDCKII-hMDR1) gebruikt zonder of met blokkering voorafgaand aan experimenten door middel van het P-GP substraat (±)-verapamil en de resultaten worden vergeleken met de waargenomen voor de wild type cellen. De algehele experimentele aanpak toont het belang aan van een nauwkeurig tijdbeheer dat essentieel is voor elke preklinische en klinisch studie met behulp van PET-tracers radioactief gelabeld met kortstondige nucliden, zoals Carbon-11 (halfwaardetijd: 20 min).
[11C] SNAP-7941 werd geëvolueerd als de eerste positron emissie tomografie (PET)-Tracer gericht op de melinconcentratie hormoonreceptor 1 (MCHR1)-een receptor voornamelijk betrokken bij de centrale regulering van de eetlust en voedselinname1. Koolstof-11-etikettering van Snap-7941, een goed gekenmerkte MCHR1 antagonist, leverde de authentieke Pet-Tracer2,3,4,5op. Volledig geautomatiseerde radio synthese is echter zeer uitdagend in termen van tijd werkzaamheid en reproduceerbaarheid met de kortstondige radionuclide Carbon-11 die een halfwaardetijd van 20 min.6biedt. De totale synthese tijd moet tot een minimum worden beperkt, en als vuistregel mag niet meer dan 2-3 half-Lives (dat wil zeggen, rond 40-60 min voor koolstof-11)7. In het bijzonder moeten synthese procedures voor radiotracers gericht op receptor systemen met lage expressie dichtheden uitgebreid worden geoptimaliseerd om voldoende opbrengsten en bijgevolg hoge molaire activiteit8te verkrijgen. De synthetische strategie volgt vaak de productie van radionuclide binnen een cyclotron en de release van [11C] co2 aan de synthesizer. Daar wordt [11c] co2 voor het eerst gereduceerd tot [11c] ch4 en vervolgens gereageerd met jodium om [11c] ch3I te leveren via de gasfase methode9,10. Verdere behandeling met Silver triflaat rendementen [11C] ch3otf direct on-line. Daarna wordt deze reactieve koolstof-11 gelabelde intermediair geïntroduceerd in een oplossing die het precursor molecuul bevat. Een geautomatiseerde radio synthese omvat bovendien een zuiveringsproces met semi-preparatieve RP-HPLC, inclusief de daaropvolgende formulering van het product dat geschikt is voor preklinisch onderzoek en klinische studies.
Ongeacht de halfwaardetijd van de radionuclide en de tijds inspanning van de radio synthese, is de farmacokinetische component van een radiofarmaceuticum het meest kritische onderdeel dat moet worden geëvalueerd tijdens de ontwikkeling van de PET-Tracer. In termen van neuroimaging, hersenen binnenkomst van de PET-Tracer is de belangrijkste voorwaarde. Echter, de bloed-hersen barrière (BBB), een “veiligheidsgrens” van de hersenen, spreekt sterk uit effluxtransporters die kleine moleculen kunnen lossen (bijv. PET-tracers) en hun toepasbaarheid efficiënt belemmeren.
Een enorm nadeel tijdens preklinische evaluatie zijn onverwachte interacties naar deze effluxtransporters, die vaak niet worden herkend in in vitro experimenten en die leiden tot falen van de PET-Tracer in vivo, zoals waargenomen voor [11C] SNAP-7941. μPET Imaging bij ratten toonde een lage hersen accumulatie aan, die dramatisch toenam na toediening van de P-GP-remmer tariquidar11. Deze gegevens suggereerden dat [11C] SNAP-7941 een substraat is van dit effluxtransporter systeem dat ligand binding met centrale MCHR1 belemmert. Helaas is er nog steeds een gebrek aan adequate in vitro modellen waardoor de voorspelling van BBB penetratie in een vroeg stadium van Tracer ontwikkeling.
Hier beschrijven we de geautomatiseerde synthese van [11C] SNAP-7941 met behulp van een synthesizer voor Carbon-11 methylations. De nadruk van dit werk is om een overzicht te geven over hoe een opeenvolgende experimentele aanpak te organiseren, met inbegrip van de geautomatiseerde synthese, kwaliteitscontrole en opeenvolgende in vitro evaluatie met de zeer kortstondige nuclide Carbon-11.
Ten eerste worden de belangrijkste stappen voor een succesvolle radio synthese met minimale tijd uitgaven en maximale opbrengst beschreven. Vervolgens wordt een betrouwbare kwaliteitscontroleprocedure ingesteld waardoor de radio Tracer beschikbaar is voor potentiële klinische studies en voldoet aan de criteria van de Europese Farmacopee12. Kwantificering van de molaire concentratie en berekening van de respectieve molaire activiteit is een essentiële eis voor de opeenvolgende kinetische metingen.
Ten slotte wordt een nieuwe en eenvoudige in-vitro methode gepresenteerd die de interacties van [11C] snap-7941 naar de effluxtransporter, P-GP (hMDR1), evalueert. Het voorgestelde kinetische model maakt gebruik van een eenvoudig te hanteren apparaat dat een onmiddellijke interpretatie van gegevens mogelijk maakt en minimale celkweek inspanning vereist13.
De radio synthese van [11C] SNAP-7941 werd vastgesteld op een commerciële synthese module. Vanwege de mogelijkheid om de voorbereidingsprocedure volledig te automatiseren, werd de radiosynthese bewezen betrouwbaar te zijn en werden verbeteringen in de stralingsbescherming van de exploitant gerealiseerd. De voorbereiding van de synthesizer heeft een enorme impact op de kwaliteit van de radio Tracer, vooral in termen van molaire activiteit. Het is dus essentieel om constant te werken onder inerte omstandigheden (bijv. helium atmosfeer) en alle lijnen te spoelen die zich vóór het reactie vaartuig bevinden (doellijn, [11C] ch3I productiecyclus en reactor (Zie Figuur 2)). Bovendien, het verwarmen van de respectieve vallen en ovens voor het begin van de synthese om vocht en atmosferische koolstof te verwijderen verhoogt de molaire activiteit op een voordelige wijze. Vooral de AgOTf kolom, geïmpregneerd met graphitized Carbon, is extreem gevoelig voor vochtigheid. Zelfs kleine hoeveelheden van elke bron van vocht verstoren de omzetting van [11c] ch3I naar [11c] ch3otf. Voor aanvang van de synthese moeten de [11c] co2 -trap en de [11c] ch3I-val opnieuw op kamertemperatuur worden afgekoeld om de daaropvolgende overvulling mogelijk te maken. Bovendien, het is aanbevolen om het ontbinden van de voorloper kort voor aanvang van de synthese en de basis rechtstreeks in de precursor oplossing toe te voegen.
De kwaliteitscontrole voor radiotracers van Carbon-11 moet rationeel worden ontworpen voor een continue en snelle workflow. De belangrijkste parameters voor celkweek studies zijn echter radiochemische zuiverheid en molaire activiteit om geldige resultaten te verkrijgen. De juiste beoordeling van de molaire activiteit vereist een robuuste analytische HPLC-methode en de ijkcurve moet het concentratiebereik van het eindproduct bestrijken. Het uitdagende deel voor radiotracers is om een concentratie te bereiken boven de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) als gevolg van kleine hoeveelheden, die worden geproduceerd tijdens de radio synthese. Vandaar dat de kunst is om de balans te vinden tussen hoge molaire activiteiten om te voorkomen dat de receptor verzadiging en hoog genoeg concentraties nog in staat zijn om het niet-radioactieve signaal te kwantificeren.
[11C] SNAP-7941 werd bevestigd als een krachtig substraat van de humane P-GP Transporter, omdat er geen accumulatie werd waargenomen in de onbehandelde of door het voertuig behandelde MDCKII-hMDR1 cellen als gevolg van een snelle Efflux. Zowel de experimentele set-ups (MDCKII-WT of voorgeblokkeerde MDCKII-hMDR1-cellen) hadden daarentegen vergelijkbare resultaten (accumulatie van [11C] SNAP-7941), wat de veelzijdigheid van deze in vitro assay ondersteunt. MDCKII-hMDR1 cellen zijn zeer geschikt voor LigandTracer experimenten als gevolg van hun stabiele transfectie, snelle groei en aanhoudende tegen afschuiving stress veroorzaakt door de roterende cel cultuur schotel. Het ontbreken van [11C] SNAP-7941 opname in de rat en muizenhersenen kan daarom optreden veroorzaakt door Efflux door de P-GP Transporter. Vanwege de transfectie van Canine niercellen met de Human multi Drug Resistance proteïne 1 (hMDR-1, P-GP), is de voorspellende waarde van deze methode voor effluxtransporter binding bij de mens hoog, wat gunstig is in termen van een toekomstige klinische toepassing. Tot dusver werd de selectiviteit van andere effluxtransporter echter niet geverifieerd. Daarom kunnen andere cellijnen worden gebruikt, waarbij verschillende prominente effluxtransporters worden uitgesproken als het borstkanker resistentie proteïne (BCRP) of meervoudige resistentie proteïne-1 (MRP-1), om interacties naar deze transporters te bestuderen. De methode is in vergelijking met klassieke accumulatie of transport assays zeer eenvoudig en geeft onmiddellijk kwalitatieve resultaten. Bovendien is het grootste voordeel dat deze technologie de directe interactie van de PET Tracer en het doelwit in real-time kan evalueren, in tegenstelling tot het conventionele experiment met indirecte kwantificering (meestal verplaatsing). Daarnaast biedt de real-time radioassay software experimentele flexibiliteit (bijv. nuclide verval correctie, meet tijd en posities, enz.) en dus een hoge vrijheid voor gebruikers. Aan de andere kant, beperkingen van de methode omvatten een lage monsterdoorvoer, omdat slechts één cel schotel kan worden gemeten op een tijdstip. Bovendien moeten er nog enkele andere technische en operationele kwesties in aanmerking worden genomen: de beschreven technologie is zeer gevoelig voor achtergrondstraling; stralingsbronnen moeten dus op afstand worden bewaard en de nadruk moet worden gelegd op de achtergrond meting voorafgaand aan het experiment. Een andere kwestie met betrekking tot experimenten bij hogere temperaturen dan kamertemperatuur, is de verwarming van de hellende steun: verdamping van het celkweekmedium kan de detector beïnvloeden. In plaats van te verwarmen, wordt het hele apparaat bij voorkeur in de incubator geplaatst. Bovendien is de methode beperkt tot aanhandige cellijnen. Door de rotatie van de cel cultuur schotel, shear stressgevoelige cellen kunnen loskoppelen van het gerecht, wat kan leiden tot ongeldige resultaten.
Niettemin, als de experimenteerder aandacht besteedt aan deze kleine nadelen, levert de methode snelle en betrouwbare resultaten voor de analyse van het kinetische gedrag van preklinische PET-tracers.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van T. Zenz en A. Krcal. Verder danken we K. Pallitsch voor de voorbereiding van de AgOTf en H. Spreitzer voor de distributie van de precursor.
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
[11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
g-spectrometer | g-spectrometer | ||
Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
In vitro experiments | |||
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
(±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |