यहाँ, हम की पूरी तरह से स्वचालित रेडियो लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करते हैं [11C]SNAP-7941 और पी-जी पी पर इस पीईटी-ट्रेसर की वास्तविक समय गतिजता का विश्लेषण व्यक्त करने और गैर-एक्सप्रैक्टेड कोशिकाओं.
Positron उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) एक आवश्यक आणविक इमेजिंग तकनीक रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और विवो जांच में के लिए विशिष्ट लक्षित radioligands का उपयोग कर रहा है. इस प्रोटोकॉल के भीतर, एक मजबूत और विश्वसनीय रिमोट-नियंत्रित रेडियोसिंथेसिस [11C]SNAP-7941, मेलेनिन-संकेंद्रित हार्मोन रिसेप्टर 1 के लिए एक विरोधी, वर्णित है. रेडियोसिंथेसिस cyclotron का उत्पादन के साथ शुरू होता है [11C]CO2 जो बाद में आगे एक गैस चरण संक्रमण के माध्यम से प्रतिक्रिया व्यक्त की है [11C]CH3OTf. उसके बाद, इस प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती अग्रदूत समाधान करने के लिए पेश किया है और संबंधित radiotracer रूपों. रासायनिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियोकेमिकल शुद्धता आरपी-HPLC के माध्यम से निर्धारित कर रहे हैं, नियमित रूप से radiopharmaceutical गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया में लागू किया. इसके अतिरिक्त, मोलर गतिविधि की गणना की जाती है क्योंकि यह निम्नलिखित वास्तविक समय गतिज जांच के लिए एक आवश्यकता है। इसके अलावा, सेल संचय पर पी ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) अभिव्यक्ति के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एमडीसीकेआई-डब्ल्यूटी और एमडीसीकेआई-एचएमडीआर1 कोशिकाओं पर11सीजेडस्नैप-7941 लागू किया जाता है। इस कारण से, पी-जीपी व्यक्त सेल लाइन (MDCKII-hMDR1) या तो बिना या पी-जीपी सब्सट्रेट के माध्यम से प्रयोगों से पहले अवरुद्ध के साथ प्रयोग किया जाता है ($)-verapamil और परिणाम wildtype कोशिकाओं के लिए मनाया लोगों की तुलना में कर रहे हैं। समग्र प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक सटीक समय प्रबंधन के महत्व को दर्शाता है कि हर preclinical और नैदानिक अध्ययन के लिए आवश्यक है पीईटी अनुरेखकों का उपयोग कर इस तरह के कार्बन-11 के रूप में nuclides, (आधा जीवन: 20 मिनट).
[11सी] SNAP-7941 पहले positron उत्सर्जन टोमोग्राफी के रूप में विकसित किया गया था (पीईटी)-मेलेनिन केंद्रित हार्मोन रिसेप्टर 1 (MCHR1) को लक्षित – एक रिसेप्टर मुख्य रूप से भूख और भोजन का सेवन1के केंद्रीय विनियमन में शामिल . कार्बन-11 SNAP-7941 की लेबलिंग, एक अच्छी तरह से विशेषता MCHR1विरोधी, प्रामाणिक पीईटी-ट्रेकर 2,3,4,5मिले. हालांकि, पूरी तरह से स्वचालित रेडियोसिंथेसिस समय प्रभावकारिता और अल्पकालिक रेडियोन्यूक्लाइड कार्बन-11 के साथ reproducibility के मामले में अत्यधिक चुनौतीपूर्ण है 20 मिनट6के एक आधा जीवन की पेशकश की. समग्र संश्लेषण समय एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए, और अंगूठे के एक नियम के रूप में 2-3 आधा जीवन से अधिक नहीं होना चाहिए (यानी, कार्बन-11 के लिए लगभग 40-60 मिनट)7. विशेष रूप से, कम अभिव्यक्ति घनत्व के साथ रिसेप्टर प्रणालियों को लक्षित करने वाले रेडियोट्रेसर्स के लिए संश्लेषण प्रक्रियाओं को पर्याप्त पैदावार प्राप्त करने के लिए बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया जाना चाहिए और इसके परिणामस्वरूप उच्च मोलर गतिविधि8। सिंथेटिक रणनीति अक्सर एक cyclotron के भीतर radionuclide उत्पादन इस प्रकार है और की रिहाई [11C$CO2 सिंथेसाइज़र के लिए. वहाँ, [11C]CO2 पहले [11C]CH4 करने के लिए कम है और बाद में आयडीन के साथ प्रतिक्रिया की उपज के लिए [11C]CH3मैं गैस चरण विधि 9 के माध्यम से 9,10. चांदी triflate पैदावार के साथ आगे उपचार [11C]CH3OTf सीधे ऑन लाइन. बाद में, इस प्रतिक्रियाशील कार्बन-11 लेबल मध्यवर्ती पूर्ववर्ती अणु युक्त एक समाधान में पेश किया है. एक स्वचालित रेडियो संश्लेषण के अतिरिक्त पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन के लिए उपयुक्त उत्पाद के बाद के निर्माण सहित अर्द्ध-पूर्वात्मक आरपी-HPLC के साथ एक शुद्धि प्रक्रिया शामिल है।
रेडियोन्यूक्लाइड के आधे जीवन और रेडियोसिंथेसिस के समय के प्रयास के बावजूद, रेडियोफार्मेस्यूटिक के फार्माकोकाइनेटिक पीईटी-ट्रेसर विकास के दौरान मूल्यांकन किया जाना सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। न्यूरोइमेजिंग के संदर्भ में, पीईटी-ट्रेसर के मस्तिष्क प्रविष्टि मुख्य शर्त है। हालांकि, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), मस्तिष्क की एक “सुरक्षा सीमा”, अत्यधिक efflux ट्रांसपोर्टरों कि छोटे अणुओं अनलोड कर सकते हैं व्यक्त करता है (उदा., पीईटी-ट्रेसर) और कुशलता से उनकी प्रयोज्यता में बाधा.
पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के दौरान एक बड़ी कमी इन efflux ट्रांसपोर्टरों, जो अक्सर इन विट्रो प्रयोगों में अपरिचित हैं और विवो में पीईटी-ट्रेसर की विफलता के लिए अग्रणी की ओर अप्रत्याशित बातचीत कर रहे हैं, के रूप में के लिए मनाया $11C$SNAP-7941. चूहों में पीईटी इमेजिंग कम मस्तिष्क संचय का प्रदर्शन किया, जो नाटकीय रूप से पी-जीपी अवरोधक टैरिकिदार11के प्रशासन के बाद वृद्धि हुई। इन आंकड़ों से पता चलता है कि $11सीजेडस्नैप-7941 इस efflux ट्रांसपोर्टर प्रणाली का एक सब्सट्रेट है जो केंद्रीय MCHR1 के लिए बंधन ligand impeding है। दुर्भाग्य से, वहाँ अभी भी जांचक विकास के एक प्रारंभिक चरण में BBB प्रवेश की भविष्यवाणी को सक्षम करने के इन विट्रो मॉडल में पर्याप्त की कमी है.
यहाँ, हम कार्बन-11 मिथाइलेशन के लिए एक सिंथेसाइज़र का उपयोग करके [11C]SNAP-7941 के स्वचालित संश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस काम का जोर कैसे स्वचालित संश्लेषण सहित एक लगातार प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को व्यवस्थित करने के लिए पर एक सिंहावलोकन देने के लिए है, गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लगातार इन विट्रो मूल्यांकन में बहुत कम रहते nuclide कार्बन-11 के साथ.
सबसे पहले, कम से कम समय व्यय और अधिकतम उपज के साथ एक सफल रेडियो संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन कर रहे हैं. फिर, एक विश्वसनीय गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया की स्थापना की है रेडियोट्रैकर संभावित नैदानिक अध्ययन के लिए उपलब्ध बनाने और यूरोपीय फार्माकोपोइया12के मानदंडों को पूरा. मोलर सांद्रता का परिमाणीकरण और संबंधित मोलर क्रियाकलाप की गणना क्रमिक गतिज मापन के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है।
अंत में, इनविट्रो विधि का मूल्यांकन करने में एक नया और सीधा[11C]SNAP-7941 efflux ट्रांसपोर्टर, पी-जीपी (hMDR1) की ओर बातचीत प्रस्तुत की है। प्रस्तावित गतिज मॉडल एक आसान करने के लिए संभाल डिवाइस है कि एक तत्काल डेटा व्याख्या की अनुमति देता है और कम से कम सेल संस्कृति प्रयास13की आवश्यकता का उपयोग करता है.
एक वाणिज्यिक संश्लेषण मॉड्यूल पर की रेडियो संश्लेषण [11C]SNAP-7941 स्थापित किया गया था। पूरी तरह से तैयारी की प्रक्रिया को स्वचालित करने की संभावना के कारण, रेडियोसंश्लेषण विश्वसनीय होने के लिए सबूत, और ऑपरेटर के विकिरण संरक्षण के बारे में सुधार हासिल किए गए थे। सिंथेसाइज़र की तैयारी विशेष रूप से मोलर गतिविधि के मामले में, रेडियोट्रैकर की गुणवत्ता पर एक भारी प्रभाव पड़ता है। इस प्रकार, यह लगातार अक्रिय परिस्थितियों (उदा., हीलियम वातावरण) के तहत काम करने के लिए आवश्यक है, और प्रतिक्रिया पोत से पहले स्थित सभी लाइनों फ्लश करने के लिए (लक्ष्य रेखा, [11C]CH3I उत्पादन चक्र और रिएक्टर (चित्र 2) देखें)। इसके अलावा, नमी और वायुमंडलीय कार्बन को दूर करने के लिए संश्लेषण के शुरू होने से पहले संबंधित जाल और ओवन हीटिंग मोलर गतिविधि लाभप्रद बढ़ जाती है। विशेष रूप से AgOTf स्तंभ, graphitized कार्बन के साथ गर्भवती, आर्द्रता के लिए बेहद संवेदनशील है. नमी के किसी भी स्रोत की भी मामूली मात्रा में [11C]CH3I से $11C]CH3OTf के रूपांतरण को परेशान करते हैं। संश्लेषण शुरू करने से पहले, [11C]CO2 जाल और [11C]CH3मैं जाल कमरे के तापमान को फिर से ठंडा किया जा करने के लिए बाद में फँसाने सक्षम करने के लिए. इसके अलावा, यह संश्लेषण शुरू करने से पहले शीघ्र ही अग्रदूत भंग करने के लिए और सीधे अग्रदूत समाधान में आधार जोड़ने के लिए सिफारिश की है.
कार्बन-11 रेडियोट्रेसर के लिए गुणवत्ता नियंत्रण को एक सतत और तेजी से कार्यप्रवाह के लिए तर्कसंगत रूप से डिजाइन किया जाना चाहिए। हालांकि, सेल संस्कृति के अध्ययन के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर रेडियोकेमिकल शुद्धता और मोलर गतिविधि मान्य परिणाम प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। मोलर गतिविधि का सही मूल्यांकन एक मजबूत विश्लेषणात्मक HPLC विधि की आवश्यकता है और अंशांकन वक्र अंतिम उत्पाद की एकाग्रता रेंज को कवर किया है. रेडियोट्रेसर्स के लिए चुनौतीपूर्ण हिस्सा विकिरण संश्लेषण के दौरान उत्पादित कर रहे हैं, जो छोटी मात्रा के कारण परिमाणीकरण (LOQ) की सीमा से ऊपर एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए है. इसलिए, कला रिसेप्टर संतृप्ति और उच्च पर्याप्त सांद्रता से बचने के लिए उच्च मोलर गतिविधियों के बीच संतुलन अभी भी गैर-रेडियोएक्टिव संकेत मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने के लिए है।
[11सी] SNAP-7941 मानव पी-जी पी ट्रांसपोर्टर का एक शक्तिशाली सब्सट्रेट होने की पुष्टि की गई थी, क्योंकि तेजी से efflux के कारण अनुपचारित या वाहन द्वारा उपचारित MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं में कोई संचय नहीं देखा गया था। इसके विपरीत, दोनों प्रयोगात्मक सेट अप (MDCKII-WT या पूर्व अवरुद्ध MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं) इसी तरह के परिणाम प्रदान की (की संचय [11C]SNAP-7941), इन विट्रो परख में इस की बहुमुखी प्रतिभा का समर्थन. MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं उनके स्थिर transfection, तेजी से विकास और घूर्णन सेल संस्कृति पकवान की वजह से कतरनी तनाव के खिलाफ लगातार के कारण LigandTracer प्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त हैं। चूहे और चूहों के मस्तिष्क में11सीजेडSNAP-7941 तेज की कमी इसलिए पी-जी पी ट्रांसपोर्टर के माध्यम से efflux के कारण हो सकता है. मानव बहु दवा प्रतिरोध प्रोटीन 1 (hMDR-1, पी-जी.पी) के साथ कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं के transfection के कारण, मनुष्यों में efflux ट्रांसपोर्टर बाध्यकारी के लिए इस विधि का भविष्य कहनेवाला मूल्य उच्च है, जो एक भविष्य नैदानिक आवेदन के मामले में अनुकूल है. हालांकि, अभी तक, अन्य efflux ट्रांसपोर्टर के खिलाफ चयनात्मकता सत्यापित नहीं किया गया था. इसलिए, अन्य सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है, स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP) या एकाधिक प्रतिरोध प्रोटीन-1 (MRP-1) के रूप में विभिन्न प्रमुख efflux ट्रांसपोर्टरों व्यक्त, इन ट्रांसपोर्टरों के प्रति बातचीत का अध्ययन करने के लिए. विधि शास्त्रीय संचय या परिवहन परख बहुत सरल की तुलना में है और तुरंत गुणात्मक परिणाम देता है. इसके अलावा, सबसे बड़ा लाभ यह है कि इस तकनीक पीईटी अनुरेखक और वास्तविक समय में लक्ष्य के प्रत्यक्ष संपर्क के मूल्यांकन में सक्षम बनाता है, अप्रत्यक्ष परिमाणीकरण का उपयोग पारंपरिक प्रयोग के विपरीत (ज्यादातर विस्थापन). इसके अतिरिक्त, वास्तविक समय radioassay सॉफ्टवेयर प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है (जैसे, न्यूक्लाइड क्षय सुधार, समय और पदों को मापने, आदि) और इसलिए, उपयोगकर्ताओं के लिए उच्च स्वतंत्रता. दूसरी ओर, विधि की सीमाओं में एक कम नमूना थ्रूपुट शामिल है, क्योंकि एक समय में केवल एक सेल डिश को मापा जा सकता है। इसके अलावा, कुछ अन्य तकनीकी और परिचालन मुद्दों को ध्यान में रखा जाना चाहिए: वर्णित प्रौद्योगिकी पृष्ठभूमि विकिरण के प्रति बहुत संवेदनशील है; इस प्रकार, विकिरण स्रोतों दूरी पर रखा जाना चाहिए और जोर प्रयोग करने से पहले पृष्ठभूमि माप पर रखा जाना चाहिए. कमरे के तापमान से उच्च तापमान पर प्रयोगों के विषय में एक और मुद्दा, झुका समर्थन के हीटिंग है: सेल संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण डिटेक्टर को प्रभावित कर सकता है. हीटिंग के बजाय, पूरे डिवाइस को अधिमानतः इनक्यूबेटर में रखा जाता है। इसके अलावा, विधि अनुयायी सेल लाइनों तक सीमित है. सेल संस्कृति पकवान के रोटेशन के माध्यम से, कतरनी तनाव संवेदनशील कोशिकाओं पकवान है, जो अमान्य परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से अलग हो सकता है.
फिर भी, यदि प्रयोगकर्ता इन मामूली कमियों पर ध्यान देता है तो विधि पूर्व नैदानिक पीईटी-ट्रेसर्स के गतिज व्यवहार के विश्लेषण के लिए तेजी से और विश्वसनीय परिणाम देती है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम ऑस्ट्रिया ईज़र्ड फंड (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser) द्वारा समर्थित किया गया था। हम टी जेन्ज़ और ए. Krcal के तकनीकी समर्थन के लिए आभारी हैं. इसके अलावा, हम AgOTf और एच Spreitzer के अग्रदूत के वितरण के लिए तैयार करने के लिए के Pallitsch धन्यवाद.
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
[11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
g-spectrometer | g-spectrometer | ||
Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
In vitro experiments | |||
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
(±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |