Här representerar vi ett protokoll för den helautomatiserade radiomärkningen av [11C] SNAP-7941 och analysen av realtids kinetiken hos detta PET-Tracer på P-gp-uttryck och icke-uttryckande celler.
Positron emissions tomografi (PET) är en viktig molekylär avbildning teknik som ger insikter i vägar och använda specifika riktade radioligander för in vivo utredningar. Inom detta protokoll beskrivs en robust och tillförlitlig fjärrstyrd radiosyntes av [11C] SNAP-7941, en antagonist till melanin-koncentrationsinreceptorn 1. Radiosyntesen börjar med cyklotron produceras [11c] Co2 som därefter ytterligare reagerat via en gas-fasövergång till [11c] CH3OTf. Därefter introduceras denna reaktiva intermediär till föregångaren lösningen och bildar respektive radiotracer. Kemisk såväl som den radiokemiska renhet bestäms med hjälp av RP-HPLC, rutinmässigt genomförs i den radioaktiva läkemedel kvalitetskontrollprocessen. Dessutom är molar aktiviteten beräknas eftersom det är en nödvändighet för följande realtids kinetiska undersökningar. Dessutom, [11C] SNAP-7941 appliceras på MDCKII-WT och Mdckii-hMDR1 celler för att utvärdera effekten av p-glykoprotein (p-GP) uttryck på cellackumulering. Av denna anledning, p-GP uttrycker cellinjer (mdckii-hMDR1) används antingen utan eller med blockering före experiment med hjälp av p-gp substrat (±)-verapamil och resultaten jämförs med de som observerats för vildtyp celler. Den övergripande experimentella metoden visar vikten av en exakt Tidshantering som är nödvändig för varje preklinisk och klinisk studie med hjälp av PET-spår som radiomärkts med kortlivade nuklider, såsom kol-11 (halveringstid: 20 min).
[11C] SNAP-7941 utvecklades som den första positron emissions tomografi (PET)-Tracer inriktning melanin-koncentration hormonreceptor 1 (MCHR1)-en receptor huvudsakligen involverad i den centrala regleringen av aptit och födointag1. Carbon-11 märkning av Snap-7941, en väl karaktäriserad MCHR1 antagonist, gav den autentiska PET-Tracer2,3,4,5. Men helt automatiserad radio syntes är mycket utmanande när det gäller tid effektivitet och reproducerbarhet med den kortlivade radionukliden Carbon-11 erbjuder en halveringstid på 20 min6. Den totala syntes tiden bör hållas till ett minimum, och som en tumregel bör inte överstiga 2-3 halveringstider (dvs., cirka 40-60 min för kol-11)7. I synnerhet måste syntes procedurer för radiotracers riktade mot receptorsystem med låg uttrycks täthet i stor utsträckning optimeras för att erhålla tillräcklig avkastning och därmed hög molar aktivitet8. Den syntetiska strategin följer ofta radionuklidproduktionen inom en cyklotron och frisättningen av [11C] Co2 till syntet. Där, [11c] Co2 reduceras först till [11c] CH4 och därefter reagerade med jod för att ge [11c] CH3i via gas-fas metod9,10. Ytterligare behandling med silver triflate avkastning [11C] CH3OTf direkt on-line. Efteråt introduceras denna reaktiva kol-11-märkta intermediär i en lösning som innehåller föregångaren molekylen. En automatiserad radiosyntes innebär dessutom en reningsprocess med semi-Preparative RP-HPLC inklusive efterföljande formulering av produkten lämpar sig för prekliniska och kliniska studier.
Oberoende av halveringstiden för radionukliden och tidsinsatsen för radiosyntesen, är farmakokinetiken för ett radioaktivt läkemedel den mest kritiska delen som ska utvärderas under utvecklingen av PET-Tracer. När det gäller neuroimaging, hjärnan inträde av PET-Tracer är den viktigaste förutsättningen. Emellertid, blod-hjärnbarriären (BBB), en “säkerhet gränsen” av hjärnan, uttrycker mycket effluxtransportörer som kan lasta små molekyler (t. ex., PET-tracers) och effektivt hämma deras tillämplighet.
En stor nackdel under preklinisk utvärdering är oväntade interaktioner mot dessa effluxtransportörer, som ofta är okända i in vitro-experiment och leder till fel på PET-Tracer in vivo, som observerats för [11C] SNAP-7941. μPET Imaging hos råttor visade låg hjärn ansamling, vilket ökade dramatiskt efter administrering av P-gp-hämmare tariquidar11. Dessa data föreslog att [11C] SNAP-7941 är ett substrat för detta effluxtransportörsystem som hindrar ligand-bindning till centrala MCHR1. Tyvärr finns det fortfarande en brist på adekvata in vitro-modeller som möjliggör förutsägelse av BBB penetration i ett tidigt skede av spår utveckling.
Här beskriver vi den automatiserade syntesen av [11C] SNAP-7941 med hjälp av en synthesizer för kol-11-metyleringar. Tyngdpunkten i detta arbete är att ge en överblick över hur man organiserar en på varandra följande experimentella tillvägagångssätt, inklusive automatiserad syntes, kvalitetskontroll samt successiva in vitro-utvärdering med mycket kortlivade nuklid Carbon-11.
Först beskrivs de viktigaste stegen för en lyckad radiosyntes med minimal tidsförbrukning och maximal avkastning. Därefter inrättas ett tillförlitligt kvalitetskontroll förfarande som gör radiotracer tillgänglig för potentiella kliniska studier och som uppfyller kriterierna i Europeiska farmakopén12. Kvantifiering av molar koncentrationen och beräkning av respektive molar aktivitet är ett väsentligt krav för de successiva kinetiska mätningarna.
Slutligen presenteras en ny och enkel in vitro-metod som utvärderar [11C] Snap-7941s interaktioner mot effluxtransportören, P-gp (hMDR1). Den föreslagna kinetiska modellen använder en lätt att hantera enhet som möjliggör en omedelbar data tolkning och kräver minimal cellkultur ansträngning13.
Radiosyntesen av [11C] SNAP-7941 fastställdes på en kommersiell syntes modul. På grund av möjligheten att helt automatisera förberedelse förfarandet, röntgen syntes säkras för att vara tillförlitlig, och förbättringar avseende strålskydd av operatören uppnåddes. Beredningen av synthesizer har en enorm inverkan på kvaliteten på radiotracer, särskilt när det gäller molar aktivitet. Det är därför viktigt att hela tiden arbeta under inerta förhållanden (t. ex. helium atmosfären) och att spola alla linjer som ligger före reaktionskärlet (mållinjen, [11C] CH3I produktionscykel och reaktor (se figur 2)). Dessutom uppvärmning av respektive fällor och ugnar innan början av syntesen för att ta bort fukt och Atmosfäriskt kol ökar molar aktiviteten fördel. Speciellt den AgOTf kolumnen, impregnerad med grafitiserat kol, är extremt känslig för fukt. Även mindre mängder av någon fukt källa stör omvandlingen av [11c] CH3I till [11c] CH3OTf. Innan syntesen inleds måste [11c] Co2 -fällan och [11c] CH3I-fällan kylas ner till rumstemperatur igen för att möjliggöra efterföljande svällning. Dessutom rekommenderas att man löser upp föregångaren strax innan syntesen påbörjas och att basen läggs direkt in i prekursorlösningen.
Kvalitetskontrollen för kol-11-radiotracers måste vara rationellt utformad för ett kontinuerligt och snabbt arbetsflöde. Emellertid, de viktigaste parametrarna för cellkulturstudier är radiokemisk renhet och molar aktivitet för att få giltiga resultat. Korrekt utvärdering av molar aktiviteten kräver en robust analytisk HPLC-metod och kalibreringskurvan måste täcka koncentrationsintervallet för slutprodukten. Den utmanande delen för radiotracers är att uppnå en koncentration över kvantifieringsgränsen (LOQ) på grund av små mängder, som produceras under radio syntesen. Därför är konsten att hitta balansen mellan hög molar aktiviteter för att undvika receptor mättnad och tillräckligt höga koncentrationer för att fortfarande kunna kvantifiera icke-radioaktiva signalen.
[11C] SNAP-7941 bekräftades vara ett potent substrat för den humana P-gp transportör, eftersom ingen ackumulering observerades i obehandlad eller vehikel-behandlade MDCKII-hMDR1 celler på grund av snabb efflux. Däremot gav både experimentella uppställningar (MDCKII-WT eller förblockerade MDCKII-hMDR1-celler) liknande resultat (ackumulering av [11C] SNAP-7941), vilket stödde mångsidigheten hos denna in vitro-analys. MDCKII-hMDR1 celler är mycket lämpliga för LigandTracer experiment på grund av deras stabila transfektion, snabb tillväxt och ihållande mot skjuvning stress orsakad av roterande cellkultur skålen. Avsaknaden av [11C] SNAP-7941 upptag i råtta och möss hjärnan kan därför förekomma orsakad av efflux genom P-gp transportör. På grund av transfektion av hundarnas njurceller med humant multiresistent protein 1 (hMDR-1, P-gp), det prediktiva värdet av denna metod för efflux transporter bindning hos människor är hög, vilket är gynnsamt i form av en framtida klinisk tillämpning. Men hittills har selektiviteten mot andra effluxtransporter inte verifierats. Därför, andra cellinjer kan användas, uttrycker olika framstående effluxtransportörer som Breast Cancer resistens protein (BCRP) eller multipel resistens protein-1 (MRP-1), att studera interaktioner mot dessa transportörer. Metoden är i jämförelse med klassisk ackumulering eller transportanalyser mycket enkel och ger omedelbart kvalitativa resultat. Dessutom är den största fördelen att denna teknik möjliggör utvärdering av direkt interaktion av PET Tracer och målet i realtid, i motsats till konventionella experiment med indirekt kvantifiering (mestadels förskjutning). Dessutom ger realtid radioassay programvara experimentell flexibilitet (t. ex., nuklid förfall korrigering, mäta tid och positioner, etc.) och därför, hög frihet för användare. På andra sidan, begränsningar av metoden inkluderar en låg provgenomströmning, eftersom endast en cell skålen kan mätas i taget. Dessutom bör man ta hänsyn till några andra tekniska och operativa frågor: den beskrivna tekniken är mycket känslig för bakgrundsstrålning. strålnings källorna bör därför hållas på avstånd och tyngdpunkten bör läggas på bakgrunds mätningen före experimentet. En annan fråga som rör experiment vid högre temperaturer än rumstemperatur, är uppvärmningen av det lutande stödet: avdunstning av cell odlingsmediet kan påverka detektorn. I stället för uppvärmning placeras hela enheten företrädesvis i inkubatorn. Dessutom är metoden begränsad till adherenta cellinjer. Genom rotation av cellkultur skålen kan skjuvningskänsliga celler lossna från skålen, vilket kan leda till ogiltiga resultat.
Ändå, om försöksledaren uppmärksammar dessa mindre nackdelar metoden ger snabba och pålitliga resultat för analys av det kinetiska beteendet hos prekliniska PET-tracers.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Vi är tacksamma för teknisk support av T. Zenz och A. Krcal. Dessutom tackar vi K. Pallitsch för beredning av AgOTf och H. Spreitzer för distribution av föregångaren.
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
[11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
g-spectrometer | g-spectrometer | ||
Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
In vitro experiments | |||
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
(±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |