Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [¹¹C] SNAP-7941

Summary

Burada, [¹¹C] SNAP-7941 tam otomatik radiolabelling ve P-GP ifade ve non-ifade HÜCRELERI Bu Pet-Tracer gerçek zamanlı kinetiği analizi için bir protokol temsil eder.

Abstract

Pozitron emisyon tomografisi (PET), Ways ve In vivo araştırmaları için spesifik hedeflenen radioligands kullanarak yol anlayışları sağlayan temel bir moleküler görüntüleme tekniktir. Bu protokol içinde, [¹¹C] SNAP-7941, melanin-konsantre hormon reseptörü 1 için bir antagonisti olan sağlam ve güvenilir bir uzaktan kumandalı radyosentezi açıklanmıştır. Radyosentez, [11 c] ch₃OTF 'e bir gaz fazı geçişi yoluyla daha sonra tepki gösteren [¹¹c]Co₂ ' ye üretilen siklotron ile başlar. Daha sonra, bu reaktif ara öncü çözüme tanıtıldı ve ilgili radyotracer oluşturur. Kimyasal ve radyokimyasal saflık, RP-HPLC ile belirlenir, rutin olarak radyoopharmaceutical kalite kontrol sürecinde uygulanır. Ayrıca, molar etkinliği aşağıdaki gerçek zamanlı kinetik araştırmalar için bir zorunluluk olduğu gibi hesaplanır. Ayrıca, [¹¹C] SNAP-7941, p-glycoprotein (p-GP) ifadesinin hücre birikiminde etkisini değerlendirmek için MDCKıı-WT ve Mdckıı-hMDR1 hücrelerine uygulanır. Bu nedenle, P-GP ifade hücre hattı (MDCKıı-hMDR1) ya olmadan ya da P-GP substrat (±)-verapamil yoluyla deneyler öncesinde engelleme ile kullanılır ve sonuçlar wildtype hücreler için gözlenen olanlar ile karşılaştırıldığında. Genel deneysel yaklaşım, karbon-11 (Half-Life: 20 dk) gibi kısa ömürlü çekirdeklerle radyülatif PET izleyiciler kullanarak her preklinik ve klinik çalışma için gerekli olan kesin bir zaman yönetimi önemini göstermektedir.

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 ilk pozitron emisyon tomografi (PET) olarak gelişti-Tracer melanin-konsantre hormon reseptörü hedefleyen 1 (MCHR1)-bir reseptör özellikle iştah ve gıda alımı merkezi düzenlenmesi dahil¹. Karbon-11 Snap-7941 etiketlemesi, iyi karakterize MCHR1 antagonisti, otantik Pet-Tracer^2,3,4,5vermiştir. Ancak, tam otomatik radyosentezi kısa ömürlü radiyonüklid karbon-11 ile zaman etkinliği ve yeniden Üretilebilirlik açısından son derece zorlu bir yarı ömrü sunan 20 dk⁶. Genel sentezi zaman en az tutulması gereken, ve başparmak bir kural olarak 2-3 yarı hayatlarını aşmamalıdır (yani, yaklaşık 40-60 dk Carbon-11 için)⁷. Özellikle, düşük ifade yoğunluklarına sahip reseptör sistemlerini hedefleyen radyotraclar için sentezleme prosedürleri, yeterli verim elde etmek ve dolayısıyla yüksek molar aktivitesi⁸için kapsamlı bir şekilde optimize edilmelidir. Sentetik strateji genellikle bir siklotron içinde radiyonüklid üretimini takip ve synthesizer [¹¹C] Co₂ serbest. Orada, [¹¹c] Co₂ ilk olarak [11 c] ch₄ ' e düşürüldü ve daha sonra [¹¹c] ch₃I ile gaz fazı yöntemi^9,10 yoluyla verim için iyot ile reaksiyona gelmiştir. Gümüş triflat verimleri ile daha fazla tedavi [¹¹C] ch₃OTF doğrudan on-line. Daha sonra, bu reaktif karbon-11 etiketli ara preüror molekül içeren bir çözüm haline getirilmiştir. Otomatik radyosentezi Ayrıca, preklinik ve klinik çalışmalar için uygun ürünün sonraki formülasyonu da dahil olmak üzere yarı Preparatif RP-HPLC ile bir arıtma süreci içerir.

Radyonüklid 'in yarı ömrü ve radyosentezi zaman çabası ne olursa olsun, bir radyoopharmaceutical farmakokinetik PET-Tracer gelişimi sırasında değerlendirilmek üzere en kritik parçasıdır. Nörogörüntüleme açısından, PET-Tracer beyin giriş ana önkoşuldur. Ancak, kan beyin bariyeri (BBB), beynin bir "güvenlik sınırı", son derece küçük molekülleri boşaltabilir "effluks" taşıyıcıları ifade (örneğin, PET-tracers) ve verimli bir şekilde uygulanabilirliği engelliyor.

Preklinik değerlendirme sırasında büyük bir dezavantajı bu "effluks" taşıyıcıları, genellikle in vitro deneylerde tanınmayan ve pet-Tracer In vivo başarısızlık önde gelen beklenmeyen etkileşimler, [¹¹C] Snap-7941 için gözlenen gibi. Ratlarda μPET görüntüleme düşük beyin birikimi göstermiştir, hangi P-GP inhibitörü tariquidar uygulamadan sonra dramatik artış¹¹. Bu veriler, [¹¹C] Snap-7941, bu "effluks" taşıyıcı sisteminin MCHR1 merkezine bağlayan ligand bağlayıcı bir substrat olduğunu önerdi. Ne yazık ki, hala izleme gelişimi erken bir aşamada BBB penetrasyon tahmin sağlayan yeterli in vitro modelleri eksikliği vardır.

Burada, Carbon-11 metilasyonları için bir synthesizer kullanarak [¹¹C] SNAP-7941 otomatik sentezi açıklanmaktadır. Bu çalışmanın vurgu, otomatik sentez, kalite kontrolü ve çok kısa ömürlü çekirdekler Carbon-11 ile ardışık in vitro değerlendirme de dahil olmak üzere ardışık deneysel bir yaklaşım düzenlemek için nasıl bir genel bakış vermesidir.

İlk olarak, en az zaman harcaması ve maksimal verim ile başarılı bir radyosentez için önemli adımlar açıklanmıştır. Daha sonra, güvenilir bir kalite kontrol prosedürü biyodağılımın potansiyel klinik çalışmalar için kullanılabilir hale ayarlamak ve Avrupa Pharmacopoeia¹²kriterlerini karşılayan. Molar konsantrasyonunun ölçülmesini ve ilgili molar aktivitesinin hesaplanması, ardışık kinetik ölçümler için gerekli bir gerekliliktir.

Son olarak, yeni ve basit bir in vitro yöntemi değerlendirmek [¹¹C] Snap-7941 ' in "effluks" taşıyıcı karşı etkileşimleri, P-GP (hMDR1), sunulmaktadır. Önerilen kinetik model hemen veri yorumu sağlayan ve minimum hücre kültürü çaba¹³gerektiren bir kolay tanıtıcı cihaz kullanır.

Protocol

DIKKAT: aşağıdaki protokolde, radyoaktivite işleme ve manipülasyon gerektiren birden fazla adım bulunmaktadır. Her adımın, enstitünün radyasyon güvenliği departmanı ve ilgili ulusal yasama organı ile anlaşmada olması önemlidir. ALARA ("makul derecede ulaşılabilen") ilkesinin ardından yer alan operatörler için iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmanın en aza indirilmesi zorunludur.

1. zaman yönetimi ve deney planlaması

Not: karbon-11 ' in kısa yarı ömrü, radyoaktivite kaybını en aza indirmek için doğru zaman yönetimi gerektirir (Şekil 1). İlgili herhangi bir kişinin sorumluluk alanını ve ilgili eylemin zaman noktasını bildiği önemlidir. [¹¹C] SNAP-7941 gerçek zamanlı kinetik deneyinin ayarlanması için, düzgün bir süreç için yaklaşık dört kişi gereklidir.

1. [¹¹C] SNAP-7941 için bir yapımcı düzenleyin.
2. Kalite kontrol operatörü belirtimi değerlendirme, kütle konsantrasyonu ve sentez başlangıç zamanı molar aktivitesinin hesaplanması gerçekleştirmek bildirin.
3. Gerçek zamanlı kinetik deneyleri seyreltme hesaplaması için hazır tutun ve deneyi gerçekleştirme.
4. Radyoaktivite ilgili zaman noktasında ilgili yere transfer için Runner talimat.

2. preklinik kullanım için [¹¹C] SNAP-7941 otomatik sentezi

1. Synthesizer hazırlanması (Şekil 2).
   1. Synthesizer, gerekli Teknik gazlar (helyum ve hidrojen) ve synthesizer kontrol yazılımı Tracerlabaçın. İlgili sentez sırası Snapseçin.
   2. Yıkama V1-V3 bir kez su ile ve iki kez aseton ile reaktör ve HPLC Vana ya yük veya döngü atık şişe içine pozisyon enjekte.
   3. Tüm ilişkili hatları içine ve dışına reaktör üzerinden kuru bir sürekli helyum akışı ile enjeksiyon vana ile V18 üzerinden aktive.
   4. Isı [¹¹c] ch₃ı Trap yanı sıra [¹¹c] ch₃otf Trap altında bir helyum akışı 100 ml · Min^-1 kadar 200 °C üzerinden v24, v25, v29, v15, V9, v17 ve V32/V33 müstakil reaktör ile.
   5. 100 mL · min^-1helyum akışına sahip sızıntı (bağlı reaktör ile) için aynı yolu kontrol edin. Akış 4 mL altında düştüğünde sıkışma garantisi · Min^-1.
   6. HPLC pompasını açın (5-10 mL · min^-1) ve HPLC hatlarını ve enjeksiyon vanasını Asetonitril/su (50/50, v/v) ile HPLC çözücüleri ile v14 yoluyla ampul içine yıkayın.
   7. V19 ve V12 üzerinden bir helyum akışı ile bir çöp şişesi içine ampul boş. Bir helyum akışına v18 ile v11 ve V12 üzerinden V6 'dan su ile ilgili hatları yıkayın.
   8. Wash v5 ile etanol ve v4 ile su ile v11 ve V12 ürün toplama şişesi IÇINE (PCV) ile bir helyum akışı kullanarak V18, sonra boş PCV üzerinden v13 ile çöp şişesi ile bir helyum akışı ile V20.
   9. HPLC pompasını kapatın, sentezi için çözücüye geçin ((sulu amonyum asetat (2,5 g · L^-1)/asetik asit 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), yarı Preparatif HPLC sütununa takın ve sütunu doğrultma (5 ml akış · Min^-1).
   10. Sentezi ve arıtma için reaktifler doldurun: 1,5 mL su (v2), 4,5 mL 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL% 96 etanol (V5), 10 mL su (V6), ve 90 mL su (ampul).
   11. Yeni bir döngü atık şişe takın; V13 ve sıvı nitrojen için bir ürün şişesi (etiketlenmiş ve havalandırma iğnesi ile donatılmıştır).
   12. Ön koşul bir SPE (katı faz ekstraksiyon) 10 mL% 96 etanol ve 20 mL su ile kartuş ve v11 ve V12 arasında takın.
   13. Sentezi başlatmadan önce, [¹¹C] Co₂ Trap 'i 400 °c ' ye ısıtarak ve 50 ml 'lik helyum akışıyla Trap 'i yıkmadan önceki 20 dakika öncesi Çalıştırma sırasını başlatın · Min^-1Via v27 (2 dak). Sonra, [¹¹C] Co₂ Trap 'i 3 dakika boyunca hidrojen gazı (120 ml · Min^-1) ve sonunda 40 °c ' ye kadar soğutmak için ön yıkama yapın.
   14. 400 μL Asetonitril (DNA sentezi için, < 10 H₂O), reaksiyonda çözüm transferi ve 5,5 μL tbah (264 mg · ml^-1 metanol içinde) ekleyin 1 mg habercisi çözülür. Reaktörü ilgili konumuna takın.
   15. Sıcak hücreyi kapatın ve sıcak hücrenin altında basıncı açın.
   16. CH₄ tuzağı ile sıvı nitrojen-75 °c arası soğutma sürecinin başlamasını onaylayın.
   17. Sıcaklık ulaşıldığında radyoaktivite bırakın.
2. [¹¹C] Co₂ cyclotron üretimi
   Not: adım 2.2.1-2.2.4 radyosentez modülünün hazırlanması için eşzamanlı olarak gerçekleştirilir (Ayrıca bkz. Şekil 1).
   1. Cyclotron mıknatıs açın.
   2. Hedef ¹¹C-Co₂ seçin ve Beam 65 μAbaşlatın.
   3. Düğmeye basarak ışınlama başlangıcımı onaylayın.
   4. Işını durdurun ve düğme teslimatınıiterek Sentezleyicinin içine radyoaktivite salınımı onaylayın, istenilen miktarda radyoaktivite ulaştıktan sonra (yaklaşık 120 gbq sonra 30 dakika).
3. Tam otomatik radyosentezi yürütülmesi
   1. Sistem radyoaktivite almaya hazır olduğunu doğrulayın ve otomatik işlem başlatmak
   2. Aşağıdaki otomatik işlemi izleme.
      1. [¹¹c] Co₂ ' nin siklotron 'dan, v26 (yaklaşık 4 dak) ile sentezi ünitesine otomatik olarak aktarılırsa ve [¹¹c] Co₂ ' nin bir katalizör olarak nikel ile emelenmiş moleküler elek üzerinde sıkışıp kaldıktan sonra kontrol edin ([ ¹¹ ' i C] CO₂ Trap) Oda sıcaklığında.
      2. [¹¹C] Co₂ Trap ilk olarak Helyum (50 ml · Min^-1) ile ve daha sonra hidrojen gazı (120 ml · Min^-1) ile otomatik olarak temizlendi. Daha sonra, v27 ve v25 kapalı olduğunu gözlemlemek ve sıkışmış [¹¹c] Co₂ hidrojen gazı dahil 400 °c ısıtılır ve oluşturulan [¹¹c] ch₄ daha önceden soğutmalı [¹¹c] ch_{4 taşınır} tuzak ve orada kapana kısılmış.
      3. V10 kapalı olduğunu monitör, v9 açıldı (iyot sütuna doğru) ve [¹¹c] ch₄ tekrar 80 °c [¹¹c] ch₄ tuzak ısıtarak serbest bırakılır ve aracılığıyla bir helyum akışı ile dolaşım birimine taşınan V10 (egzoz çıkışı). Ve [11 c]ch₄ ' e dönüştürülürse daha fazla kontroledin [11 c] ch₃ı sirkülasyon ünitesi içinde, hangi son yaklaşık 3 dakika ve biçimlendirilmiş [¹¹c] ch₃ı sürekli sıkışmış [¹¹c] CH₃ı tuzak.
      4. Bu Egzoz valfi V16 açıldığından emin olun ve [¹¹C] ch₃ı tuzak 90 ° c helyum akışı ile ısıtılır (20 ml · Min^-1) ile v24. İşbu belgede olası yan ürünler kaldırılır ve V16 kapalıdır.
   3. [¹¹C] ch₃ı 'nin reaktör içine Serbest bırakılmaya hazır olduğunu onaylayın.
   4. Aşağıdaki otomatik işlemi izleyin: [¹¹c] ch₃i tuzağı 190 °c ' ye ısıtılır ve biçimlendirilmiş [¹¹c] ch 3 ı reaktöriçine [¹¹c] ch₃OTF Trap (V32 ve V33, hala 200 ° ' de serbest bırakılır) kontrol edin C), V7, ve V8 sürekli helyum akışı altında (10-25 mL · min^-1, V24). Bu süreçte, v21 ve V23 (egzoz çıkışı) açık olması gerekir.
   5. Reaktördeki radyoaktivite miktarı artık yükselmiyor bir kez, radyasyon reaktör geldi onaylayın.
   6. Aşağıdaki otomatik işlemin izlenmesi ve gerekirse el ile müdahale için hazırlanıyor
      1. V23, v21 ve V8 otomatik olarak kapalı olup olmadığını kontrol edin ve reaksiyon karışımı 75 °C ' ye ısıtılır. 3 dakika sonra, reaktör sıvı nitrojen ile soğutulur Eğer sıcaklık 35 altında kadar dikkat °C. Daha sonra, reaksiyon karışımı v2 üzerinden 1,5 ml su ile sönme olduğundan emin olun. Bu süreçte, v21 ve V23 (egzoz çıkışı) açık olması gerekir.
      2. V21 ve V23 kapalı olup olmadığını takip edin ve reaksiyon karışımı HPLC döngü (5 mL) içine bir sıvı dedektörü geçerek HPLC enjeksiyon valfi aktarılır. Reaksiyon karışımı otomatik olarak HPLC sütununa enjekte edilirse takip edin.
   7. Kromatogram gözlemleyin ve düğme tepe başlangıcıile ürün zirvesinde manuel olarak keser. Yaklaşık 8-10 dk (akış: 5 mL · min^-1, Şekil 3) bir bekletme süresi sonra ürün tepe sinyali neredeyse 400 CPS altında düştüğünde tepe sonuna basın.
   8. Ampul boşaltmayı hızlandırmak için ek bir helyum akışı açın.
   9. Ampul boşaltılır ve atık şişe gözlemlemek olup olmadığını izleyin: ampul v11 üzerinden boşaltılmış olup olmadığını kontrol edın, SPE Kartuşu ve V12 ile atık içine bir helyum akışı ile v19 ve ek bir helyum hattı ve ürün SPE kartuşu üzerinde korur.
   10. Ampul tamamen boş olduğunu onaylayın.
   11. SPE arıtma ve ürün transferinin otomatik sürecini izleme
       1. SPE kartuşunun V6, v11 ve V12 üzerinden 10 ml su ile yıkanmış olup olmadığını kontrol edin ve etanol, ürünü v5, v11 ve V12 üzerinden PCV 'ye eller. Son olarak, Eğer 0,9% NaCl v4, v11 ve V12 aracılığıyla PCV içine ürün seyreltmeli eklenir dikkat edin.
       2. Ürün çözümünün v13 üzerinden transfer edildiğinden ve V20 üzerinden helyum akışına sahip son ürün şişesinin içine steril bir filtre olduğundan emin olun.
   12. Ürünün tamamen aktarıldığını onaylayın.

3. kalite kontrolü (QC)

Not: radyoopharmaceuticals kalite kontrolü aşağıdaki parametreleri ölçmek içerir:

• Radyokimyasal saflık ve molar aktivitesi (RP-HPLC)
• Kalıntı çözücüler (gaz kromatografi, GC)
• Osmolality (buhar basıncı Osmometre)
• pH (pH-metre)
• γ spektrumlu/radiyonüklid saflık (γ Spektrometre)
• Yarı ömrü/radiyonüklid saflık (doz Kalibratörü)

Tüm fiziko-kimyasal parametreler ürünün yayımlanmasından önce belirlenir ve değerlerin tanımlı kalite parametre aralığında olması gerekir.

1. Kalite kontrol ekipmanlarının hazırlanması
   1. Hazırlık 30 dk önce sentez sonuna başlayın.
   2. Bir kurşun korumalı konteyner ve bağlı bir iğne ile korumalı 1 mL şırınga bir konik şişe hazırlayın.
   3. HPLC için suya ek-7941 (10 μg · mL^-1) başvuru standardı çözümü hazırlayın.
   4. PH Ölçer, gaz kromatografi ve kullanılan gazlar, osmometresi ve HPLC 'nin tüm bileşenlerini açın.
   5. HPLC kontrol yazılımını açın ve özel sütunu ve [¹¹C] SNAP-7941 için ilgili yöntemi seçin (mobil faz: (su/asetik asit 97.5/2,5 v/v; 2,5 g. L^-1 amonyum asetat; pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v; akış: 1 ml · min ^-1) ve iki ölçüm (Standart ve ürün) ile örnek bir liste yazın. Sütunun şartlandırma yöntemini başlatın.
   6. 10 dk Klima sonra Hamilton şırınga ile SNAP-7941 referans çözeltisi 20 μL enjekte ve analiz çalıştırmak başlatın.
   7. Enjeksiyondan sonra Hamilton şırınga Asetonitril ve su ile iki kez yıkayın.
   8. GC denetim yazılımını başlatın ve örnek listesini yazın.
2. Kalite kontrolü gerçekleştirme
   1. Sentez bittikten sonra ürünün mutlak radyoaktif verimi ölçmek ve ürün 100 μL transfer kalite kontrol için hazırlanan kurşun korumalı şırınga ile bir reaksiyon şişesi içine.
      Not: kalite kontrolden elde edilen tüm veriler ulusal yönetmeliklere uygun olarak belgelenmelidir.
   2. Analitik HPLC: radyokimyasal saflığı ve Kimyasal saflığı ölçün ve sonuçların hemen hücre kültürü deneyleri için sorumlu kişi bildirin.
      1. QC-Sample ' a 40 μL çizin ve HPLC 'ye enjekte edilir. Enjeksiyon valfi kolunu yükten enjekte etmek için hareket ettirerek çalıştırın (Şekil 3).
         Not: çalışma sırasında (8 dak), protokolün diğer ölçümleri mümkün olduğunca fazla çürümeye önlemek için gerçekleştirilebilir.
      2. Kromatogram açın ve radyoaktivite kanalındaki tüm doruklarına entegre edin. Ürünün bekletme süresini (5.0-7.0 min) başvuru standardının bekletme süresi ile karşılaştırın. Eğrinin altındaki alanı, tüm tümleşik zirvelerin yüzde cinsinden karşılaştırın. Ürün zirvesinde toplam entegre alanların (radyo kanalı)% 95 ' den fazla (radyokimyasal saflık) olması gerekir.
      3. Kimyasal saflığı belirlemek için UV kanalındaki sinyali entegre edin. Ana saflık genellikle 2.8-3.5 dakikada habercisi Snap asit olduğunu. [^NATC] SNAP-7941 konsantrasyonu, entegrasyon sonrasında kalibrasyon eğrisinden hesaplanır. Μmol · mL^-1 ' te SNAP-7941 konsantrasyonunu hesaplayın ve aşağıdaki denklem vasıtasıyla molar aktivitesini belirleyin:
         
   3. Gaz kromatografi için, özel bir cam şişede 20 μL kalite kontrol örneğini aktarın. Otomatik Örnekleyici içine yerleştirin ve ölçümü başlatın. Ölçüm tamamlandıktan sonra kromatogram açın ve otomatik olarak entegre dorukların numaralarını yazın. Örnek daha fazla 410 ppm Asetonitril ve% 10 etanol içermemelidir.
   4. Osmolality: özel boş bir kağıt örnek disk koymak ve örnek 10 μL uygulayın. Osmolalite ölçümü için Kapat düğmesine basın. 3 dakika sonra, cihaz 190-500 mOsm aralığında olması gereken osmolalitesi görüntüler · kg^-1.
   5. pH: elektrot su ile yıkayın. Numune elektrotunun koyarak pH ölçmek. PH 5.0-8.5 aralığında olmalıdır. Ölçümden sonra elektrotu tekrar yıkayın ve elektrodu referans pH çözümüne yerleştirin.
   6. γ-spektrum: QC numunesini γ spektrometrenin içine koyun, kontrol yazılımını açın ve ölçümü başlatın. Ölçümü durdurun ve 511 keV (Aralık 420-520 keV) olması gereken ölçülen enerjiyi yazın. Dosya menüsünü açın ve ilgili toplu iş numarası ile dosyayı güvenli. Adanmış yazılım kaydedilmiş spektrumunu geri çağırma ve spektrumunu yazdırın.
   7. Yarı ömrü: doz Kalibratörü kullanarak QC örneğinin etkinliğini iki kez ölçün. İlgili zamanları yazın ve üstel yarı ömrünü hesaplayın.
3. Sürüm
   1. Tüm parametreler test edildikten sonra ve sonuçlar Avusturya makamlarının yönergelerine uygun olarak, radiotracer bırakın. İşleç verilerin doğruluğunu imzalamak zorunda.

4. P-GP taşıyıcıya yönelik etkileşimlerin değerlendirilmesi

1. Hücre kültürü
   1. Çalışma masasının laminar hava akışını (LAF) başlatın ve çalışmaya başlamadan önce en az 15 dakika tezgahın temizliği yapın.
   2. Hücre kültürü ortamını, Otomatik Pipetleme yardımıyla steril Volumetrik pipet ile% 10 FCS (50 mL) ve% 0,5 antibiyotik (2,5 mL) ile LAF 'da steril koşullarda karıştırın.
   3. MDCKıı-hMDR1 ve MDCKıı-WT hücrelerini çözün ve aseptik koşullar (LAF) altında yapılan deneylerin 10-14 gün öncesinde T75 veya T175 hücre kültüründe yetiştirin.
   4. Tüm yapışmaz ve apoptotik hücreleri kaldırmak için ertesi gün Orta değiştirin.
   5. Her üç günde bir orta taze bir ile değiştirin (12 mL için T75 ve 23 mL için T175 hücre kültürü Flask, sırasıyla).
   6. Hücreleri, yeni flsorlara veya hücre kültürü yemeklerine, deneylerin zaman zamanlamaya göre% 80 ' lik bir konfluence üzerine ayırarak, fosfolipid büyümesini önlemek için bölünür.
2. Denemeler için hücre hazırlığı
   1. Bir hücre kültürü çanak bir eğik düzlemde 2 mL başına 2,5 x 10⁵ hücre bir konsantrasyonda deneyler ve tohum iki gün önce Hücreleri Böl (Şekil 4). Hücreleri saymak ve uygun bölme oranını hesaplamak için otomatik bir hücre sayacı cihazı veya Neubauer sayım odası kullanın.
   2. Deneyler öncesi orta bir gün çıkarın, 4 mL DPBS ile kültür çanak üzerinde hücreleri yıkayın ve taze ekleyin 5 hücre kültürü orta mL. Tabağı yatay olarak kuluçte yerleştirin.
   3. Deneme öncesi en az 0,5 h DPBS ile hücreleri yıkayın ve 2 mL FBS ücretsiz orta ile değiştirin. Mikroskop ile konfluence ve hücre morfolojisi inceleyin.
3. Üç farklı kurulumda deney yapmak.
   1. 4.2.3 'de açıklandığı gibi deneyler için Petri tabağı kullanın.
   2. 10 μM (±)-verapamil hidroklorür ile deneyler öncesinde 0,5 h için hücreleri tedavi edin.
   3. 0,98 eklemek μL verapamil stok solüsyonu (20,4 mM (±)-verapamil hidroklorür DMSO). Son DMSO içeriği% ≤ 0,05 tedavi sırasında.
   4. 0,5 h için hücreleri araç kontrolü (DMSO) ile kulyatın. İlaç tedavisi için kullanılan aynı hacmi kullanın.
4. Gerçek zamanlı tahlil denemeleri (üç kurulumlar için)
   1. Cihazı, bilgisayarı açın ve doğru bağlandığından emin olun, ardından kontrol yazılımını açın.
   2. Bir hedef seçeneği seçin, şablonun kilidini açın ve aşağıdaki ayarı ayarlayın:
      Pozisyon sayısı: 2 (iki)
      Algılama süresi (sn): 3 (üç)
      Algılama gecikmesi süresi (ler): 2 (iki)
      İlk aşamanın adı: temel
   3. Hücre kutup alt tarafında ve hücre kültürü ortamı ile kaplı olduğundan emin olun, cihazın eğimli destek içine hücreye kültür çanak yerleştirin.
   4. Başlat düğmesi ile çalıştırmayı başlatın. Sistem dosyayı kaydetmek istiyor. Bir dosya adı ve bir kaydetme yolu seçin. Kontrol Merkezi açılır ve taban çizgisi ölçümü başlar (hücre kültürü çanak desteği dönmeye başlar).
   5. Diğer seçenekleraltında seçin:
      Zaman ölçeği: dakika
      Çekirdeklide Düzeltme: Carbon-11
   6. Grafikte eğrileri altındaki tüm kutuları işaretleyin (arka plan (kırmızı), hedef (mavi) ve hedef eksi arka plan (siyah)).
   7. Kalite kontrol parametrelerini edinin: molar aktivitesi [GBq. μmol^-1] ve aktivite konsantrasyonu [MBq.ml^-1] sentezi sonunda.
   8. 2 mL Test hacmine [^NATC] SNAP-7941 15 Nm için ilgili izleyici hacmini hesaplayın.
      
      
   9. Pipeti ilgili hacmine ve [¹¹C] SNAP-7941 ürününün bir kenar kalkanında bulunan bir bileşenine hazırlayın.
   10. Denetim Merkezi penceresinde Çalıştır 'ı tıklatın. Yemek rotasyonu duruncaya kadar bekleyin ve başlık duraklatıldı ve sonraki aşamaile yan çubuk ortaya çıkar.
   11. Gerçek zamanlı kinetik cihazın kapağını açın. Kültür çanak destek 90 ° sola çevirin. Hesaplanan ses seviyesini ekleyin ve başlangıç konumuna geri dönün. Ardından cihazın kapağını kapatın. Denemeyi başlatmak için hemen devam düğmesine basın.
   12. Duraklama seçerek 20 dakika sonra deneyi sonlandırmak ve daha sonra çalıştırmak sonlandırmak (yan çubuğunda End Run tuşuna basın).
5. İstatistik yazılımı kullanarak veri analizi ve işleme
   1. Gerçek zamanlı kontrol yazılımını açın. Gerekli kinetiği geri çağırmak için Açık dosyaları tıklayın. Kinetiği kontrol merkezi penceresinde gösterilmiştir.
   2. Doğrudan kinetik dışa aktarma eğrilerinesağ tıklayarak seçin. Ham verileri içeren metin dosyasını kaydedin. İstatistik programını açın ve gerçek zamanlı deneylerin ham veri dosyasını yapıştırın.
   3. Biyodağılımın ek olarak zaman (x ekseni) ile başlayın (arka plan ölçümü hariç) ve maksimum CPS (saniyede sayar) yüzde sinyali normalleştirmek.
   4. Tüm normalleştirilmiş verileri yeni bir GraphPad Prism dosyasına yükleyin.
   5. Ortalama değerleri ve standart sapma hesaplayın.
   6. Elde edilen verileri, üç ayarında bulunan Tracer alımı 'nın sapma (artış oranı) gösteren grafik olarak gösterir.

Representative Results

[¹¹c] SNAP-7941 ' i n tam otomatik radyosentezi, formüle edilmiş ürünün 5,7 ± 2,5 GBQ (eob 'de 4,6 ±% 2,0, [¹¹c] ch₃OTF; n = 10) temelinde 14,9 ± 5,9% ' i sağladı. Genel sentezi yaklaşık sürdü 40 dk, burada 15 dk hazırlanması için gerekli olduğu [¹¹C] ch₃OTF gaz faz yöntemi ile , başka bir 5 dakika öncesinde radiolabelling için gerekli, sonra 10 dakika yarı hazırlık RP-HPLC arıtma, C18 kartuş katı faz ekstraksiyon ve formülasyonu için 10 dk. Daha sonra, kalite kontrol için sorumlu kişiye küçük bir kısım (yaklaşık 100-200 μL) teslim edildi, ancak kullanıma hazır izleyici içeren orijinal ürün şişesi gerçek zamanlı kinetik analizinin denenmeye geçti.

Sentezi bittikten sonra 10 dakika içinde kalite kontrolü tamamlanmıştır. Molar etkinliği 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10) aralığında ve radyokimyasal saflık her zaman >% 95 idi. Diğer tüm parametreler (pH, osmolalite, kalıntı çözücüler) serbest bırakma kriterlerini yerine getirmiştir. Gerçek zamanlı kinetik tahlil için üç farklı deneysel kurulumlar seçildi: (A) tedavi edilmemiş ve tedavi edilmemiş (araç) MDCKıı-WT hücreleri, (B) araç MDCKıı-hMDR1 hücreleri ile tedavi edilmemiş veya tedavi edilmemiş veya (C) önceki gerçek zamanlı engelleme ile ikinci hücre hattı Transporter (±)-verapamil kullanarak kinetik tahlil. [¹¹C] SNAP-7941 joker karakter hücre satırına MDCKıı-WT (p-GP ifade) ve Mdckıı-HMDR1 (p-GP ifade) uygulaması, joker hücre çizgisine hızlı bir birikim olduğu için farklı bir kinetik davranışı gösterir, ancak hiçbir birikim görülmemiştir MDCKıı-hMDR1 hücreleri için. Ancak, P-GP "effluks" Transporter ınmdckıı-hMDR1 hücrelerini engelleme (±)-verapamil wildtype hücre hattı için zaten görülen karşılaştırılabilir bir gerçek zamanlı kinetik yol açtı (Şekil 5).

Şekil 1: iş akışına genel bakış. [¹¹C] SNAP-7941 gerçek zamanlı kinetik ölçümünün radyosentezi, kalite kontrolü ve performansının çalışma akışı. Siyah oklar radyoaktivitenin taşıma yolunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: otomatik synthesizer Radyosentetik şeması. Otomatik synthesizer anahtarlama devresi, dolaşım ünitesi ile başlayan [¹¹c] ch₃ı/[¹¹c] ch₃OTF üretim, reaktör çözüm ve SPE arıtma içine etkinliğin tanıtımı için (SPE = katı faz ekstraksiyon; PCV = ürün toplama şişesi). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: [¹¹C] Snap-7841 ' in tam otomatik Radyosentezi temsilcisi kromatogramları. Yarı Preparatif RP-HPLC kromatogram üst ve analitik bir alt üzerinde arıtma sonra gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: gerçek zamanlı deneyler Için hücre kültürü çanak hazırlama. Adım 1, hücre tipine ve büyüme hızına bağlı olarak 2,5 x 10⁵ ' e kadar 1 x 10⁶ ' nın tohumlarını içerir. Daha sonra, kültür çanak bir eğik düzlemde yerleştirilir (yaklaşık 30-45 °). Bu nedenle, sağlanan metal aparat veya bir hücre kültürü çanak kapağı tabak eğimli konumunu stabilize etmek için kuluçlaklık kullanılabilir. Sonraki gün (24 saat) çanak yatay olarak ayarlanır ve hücre yüzeyini tamamen kapsayacak şekilde taze hücre kültürü ortamı eklenir. Deney gününde, hücre canlılığı ve konfluence incelenir. Deneysel protokole göre hücreler DPBS ile yıkanır, medyası serum içermeyen orta (2 mL) ile değiştirilir ve kültür yemeği deneylerin başlaması kadar eğik bir pozisyona yeniden yerleştirilir. Bundan sonra, hücreler inhibitör veya araç ile tedavi edilebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 5: [¹¹C] SNAP-7941 gerçek zamanlı kinetik ölçümler. [¹¹C] Snap-7941 temsilcisi gerçek zamanlı kinetiği üç farklı ayarda GÖSTERILIR: mdckıı-WT hücrelerini kullanarak; MDCKıı-hMDR1 hücreleri (±) ile ön bloke-P-GP inhibitörü ve MDCKıı-hMDR1 hücreleri tıkanmadan olarak verapamil. Y ekseni, sırasıyla tedavi edilmemiş veya araç tarafından işlenmiş MDCKıı-MDR1 hücrelerinin sonuçlarına göre önceden engellenen MDCKıı-hMDR1 ve WT hücrelerinin artış hızını gösterir (hiçbir alım, 0%). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

[¹¹C] SNAP-7941 radyosentezi ticari sentez modülünde kurulmuştur. Hazırlık prosedürünü tamamen otomatikleştirmek olasılığı nedeniyle, radyosentez güvenilir olması ve operatörün radyasyon koruması ile ilgili gelişmeler elde edildi. Synthesizer hazırlanması özellikle molar aktivite açısından, radiotracer kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, sürekli olarak inert koşullarda çalışmak (örneğin helyum atmosferi) ve reaksiyon gemisinden önce bulunan tüm hatları (hedef hat, [¹¹C] ch₃I üretim döngüsü ve reaktör) temizlemenin esastır (bkz. Şekil 2)). Dahası, nem ve atmosferik karbon kaldırmak için sentezin başlamadan önce ilgili tuzaklar ve Fırınlar Isıtma avantajlı molar etkinliğini artırır. Özellikle Grafit karbon ile emgili agotf sütun, nem için son derece duyarlıdır. Herhangi bir nem kaynağının bile küçük miktarlarda [¹¹c] ch₃I [¹¹c] ch₃OTF dönüşümü rahatsız. Sentezi başlatmadan önce, [¹¹c] Co₂ tuzağı ve [¹¹c] ch₃ı tuzağı, sonraki bindirmeyi etkinleştirmek için oda sıcaklığına tekrar soğutulması gerekir. Ayrıca, sentezi başlatmadan kısa bir süre önce öncüsünü çözülür ve tabanı doğrudan öncü çözüme eklemesi tavsiye edilir.

Carbon-11 radiotracers için kalite kontrolü, sürekli ve hızlı bir iş akışı için rasyonel olarak tasarlanmalıdır. Ancak, hücre kültürü çalışmaları için en önemli parametreler, geçerli sonuçlar elde etmek için radyokimyasal saflık ve molar aktivitesidir. Molar aktivitesinin doğru değerlendirilmesi için sağlam bir analitik HPLC yöntemi gerekir ve kalibrasyon eğrisi son ürünün konsantrasyon aralığını kapsayacak şekilde gerekir. Radiotracers için zorlu kısmı, radyosentezi sırasında üretilen küçük miktarlarda, miktarın (LOQ) sınırı üzerinde bir konsantrasyon elde etmektir. Bu nedenle, sanat reseptör doygunluk ve yeterince yüksek konsantrasyonları önlemek için yüksek molar faaliyetleri arasındaki dengeyi bulmak için hala radyoaktif olmayan sinyali ölçmek mümkün.

[¹¹C] SNAP-7941, insan P-GP taşıyıcısının güçlü bir substrat olduğu doğrulandı, çünkü hızlı efflux nedeniyle tedavi edilmemiş veya araç tedavi edilen MDCKıı-hMDR1 hücrelerinde hiçbir birikim görülmemiştir. Buna karşılık, hem deneysel set up (MDCKıı-WT veya önceden engellenen MDCKıı-hMDR1 hücreleri) benzer sonuçlar (birikimi sağladı [¹¹C] SNAP-7941), bu in vitro tahlil çok yönlülük destekleyen. MDCKıı-hMDR1 hücreleri istikrarlı transfeksiyon, hızlı büyüme ve dönen hücre kültürü çanak nedeniyle kesme stres karşı kalıcı nedeniyle LigandTracer deneyler için son derece uygundur. Bu nedenle P-GP taşıyıcı aracılığıyla "effluks" nedeniyle ortaya çıkabilir [¹¹C] Snap-7941 sıçan ve fareler beyninde Alım almak eksikliği. İnsan çok ilaç direnci protein 1 ile köpek böbrek hücrelerinin transfeksiyon nedeniyle (hmdr-1, P-GP), insanlarda "effluks" taşıyıcı bağlayıcı için bu yöntemin öngörü değeri yüksek, hangi gelecekteki bir klinik uygulama açısından uygundur. Ancak, şimdiye kadar, diğer "effluks" taşıyıcı karşı seçicilik doğrulanmadı. Bu nedenle, diğer hücre hatları, meme kanseri direnci protein (bcrp) veya birden fazla direnç protein-1 (MRP-1), bu taşıyıcılar doğru etkileşimleri incelemek için farklı belirgin "effluks" taşıyıcıları ifade kullanılabilir. Yöntem klasik birikme veya taşıma ile karşılaştırıldığında çok basit ve hemen niteliksel sonuçlar verir. Dahası, en büyük avantaj, bu teknolojinin, dolaylı ölçüme (çoğunlukla deplasman) kullanarak konvansiyonel denemenin aksine, gerçek zamanlı olarak PET Tracer ve hedefin doğrudan etkileşiminin değerlendirilmesine olanak sağlar. Ayrıca, gerçek zamanlı radyotahlil yazılımı deneysel esneklik sağlar (örneğin, nükle çürümesi düzeltmesi, zaman ve pozisyonlar ölçme, vb.) ve bu nedenle, kullanıcılar için yüksek özgürlük. Diğer tarafta, yöntemin sınırlamaları, aynı anda yalnızca bir hücre çanak ölçülmesi gibi düşük örnek bir verim içerir. Ayrıca, birkaç diğer teknik ve operasyonel sorunlar dikkate alınmalıdır: açıklanan teknoloji çok arka plan radyasyon duyarlıdır; Bu nedenle, radyasyon kaynakları uzaktan tutulmalıdır ve deney öncesinde arka plan ölçümüne vurgu konulmalıdır. Oda sıcaklığından daha yüksek sıcaklıklarda deneyler ile ilgili bir başka sorun, eğimli desteğinin ısıtılması: hücre kültürü ortamının buharlaşma dedektörü etkileyebilir. Isıtma yerine, tüm cihaz tercihen kuluçku içine yerleştirilir. Ayrıca, yöntem yapışıcı hücre hatları ile sınırlıdır. Hücre kültürü çanak dönüşü sayesinde, kesme stres hassas hücreler, geçersiz sonuçlara yol açabilir çanak, ayırabilir.

Yine de, deney bu küçük dezavantajları dikkat ederse yöntemi preklinik PET-tracers kinetik davranış analizi için hızlı ve güvenilir sonuçlar sunar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)