Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En præcis patogen levering og nyttiggørelse system for murine modeller af sekundær bakteriel lungebetændelse

doi: 10.3791/59566 Published: September 21, 2019

Summary

Her præsenterer vi metoder til at forbedre sekundær bakteriel lungebetændelse undersøgelser ved at give en ikke-invasiv rute af instillation i de nedre luftveje efterfulgt af patogen opsving og transkriptionen analyse. Disse procedurer er reproducerbare og kan udføres uden specialiseret udstyr som kanyle, guide ledninger eller fiberoptiske kabler.

Abstract

Sekundære bakterielle pneumonier efter influenza infektioner konsekvent rang i top ti førende dødsårsager i USA. Til dato, murine modeller af co-infektion har været det primære værktøj udviklet til at udforske patologier af både primære og sekundære infektioner. På trods af forekomsten af denne model, er der betydelige forskelle med hensyn til instillation procedurer, dosismængder, og effektivitet er udbredt blandt undersøgelser. Desuden har disse bestræbelser været stort set ufuldstændige i håndteringen af, hvordan patogenet kan have direkte indflydelse på sygdomsprogression efter infektion. Heri giver vi en præcis metode til patogen levering, nyttiggørelse og analyse, der skal anvendes i murine modeller af sekundær bakteriel lungebetændelse. Vi viser, at intratrakeal instillation muliggør en effektiv og præcis levering af kontrollerede volumener direkte og jævnt ind i de nedre luftveje. Lungerne kan exciseres for at inddrive og kvantificere patogenet. Efter excision af de inficerede lunger, vi beskrive en metode til at udtrække høj kvalitet patogen RNA for efterfølgende transkriptional analyse. Denne procedure nyder godt af at være en ikke-kirurgisk metode til levering uden brug af specialiseret laboratorieudstyr og giver en reproducerbar strategi for at undersøge patogenet bidrag til sekundær bakteriel lungebetændelse.

Introduction

Sekundær bakteriel lungebetændelse efter influenza infektion er en førende dødsårsag i USA og et aktivt område af forskning1,2. Trods talrige undersøgelser ved hjælp af murine modeller af sekundær bakteriel lungebetændelse, uoverensstemmelser vedrørende patogen instillation og forhør forbliver3,4,5. Desuden, mens mange tidligere bestræbelser har fokuseret på immunmodulerende virkninger af influenza, der fører til en øget modtagelighed for sekundær bakteriel infektion, nyere data tyder på virulens regulering af bakterielle patogen er en lige bidragyder til etablering af sygdom6,7,8,9. Disse nye data nødvendiggør en mere præcis metode til at udforske sekundær bakteriel lungebetændelse i murine modeller af co-infektion, der letter undersøgelsen af patogenet respons.

Værtsorganismer, der er unikke for influenza-Co-infektions modeller, er bevidst immunkompromitterede af en primær influenza infektion før administration af det sekundære bakterielle middel. For bedst at replikere sygdoms patogenesen observeret i menneskelige værter, er det bydende nødvendigt, at patogenets belastning af både primære og sekundære agenser kontrolleres for at observere de individuelle og kombinatoriske virkninger af hver infektiøs agens. Mest almindeligt, luftvejsinfektioner i mus er blevet etableret gennem en intranasal administration3,4,5,6,10. For så vidt som denne rute er kendt for at være teknisk enkel og kan være hensigtsmæssig i nogle enkelt-agent infektion applikationer, det er uegnet til co-infektion modeller, som instillation procedurer, dosismængder, og effekten er meget Varier inden for publiceret litteratur3,4,5,6.

For at få en mere komplet forståelse af sekundær bakteriel lungebetændelse patogenese, bidrag af både værten og patogenet skal overvejes. Til det formål har vi udviklet en enkel og reproducerbar tilgang til genopretning af levedygtige bakterier og patogen RNA fra inficerede lunger. Denne metode bruger en forenklet, ikke-invasiv intratrakeal instillation procedure efterfulgt af efterfølgende isolering af bakteriel RNA. Den intratrakeal instillation procedure beskrevet heri svarer til tidligere beskrevne metoder og er ikke begrænset til patogen levering11,12,13. Brug af denne særlige procedure fordele ved at være lavpris og kræver ikke brug af specialiseret udstyr såsom kanyle, guide ledninger, eller fiberoptiske kabel; Desuden, fordi denne procedure er ikke-invasiv det forsikrer minimal stress på murine emner, minimerer en inflammatorisk respons fra inokulering mekanik, og giver en effektiv levering rute for infektion af flere. Kort, isofluran bedøvet mus er suspenderet fra fortænderne. Pincet bruges til forsigtigt at gribe tungen efterfulgt af indsættelse af en pre-loaded bøjet, stump-tippet, 21-gauge nål i luftrør og levering af patogenet belastning. Validering af denne procedure påvises ved visuel bekræftelse af farvestof ligeligt fordelt i lunge rummet og nyttiggørelse af bakteriel belastning. Vi viser derefter, hvordan man kan genvinde levedygtige Staphylococcus aureus (S. aureus) fra inficerede lunger og beskrive en reproducerbar metode til at ISOLERE høj kvalitet patogen RNA.

Protocol

Alle metoder er i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhed retningslinjer og blev godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Committee (IACUC) på Montana State University.

1. intratracheal instillation

  1. Forbered et arbejdsområde, der indeholder følgende forsyninger: en intubation platform, en steril 1 mL sprøjte, sterile stumpede pincet, steril 21-gauge stump-tippet nål, og to koniske rør til at opbevare sprøjten og pincet.
    Bemærk: intubation platforme kan købes kommercielt eller konstrueret in-House. Intubations platformen, der anvendes her, blev konstrueret ved hjælp af 0,25 tommer plexiglas. Kort, varme blev påført plexiglas og brættet er bøjet til en omtrentlig 65 ° indvendige vinkel. På den udvendige side af intubations platformen blev to maskinskruer seedet 3 inches fra hinanden, og et gummibånd blev suspenderet mellem de to skruer.
  2. Patogenet inokulum forberedes ved serielt fortynding af prøven, således at den ønskede endelige koncentration opnås i et samlet volumen på 50 μl. Opbevar inokulum på is.
  3. Iført sterile handsker, bøje en 21 G stump-spids nål til ca. 35 °.
    Bemærk: der skal bruges en separat nål til hver mus.
  4. Fastgør den bøjede 21 G stump-tippet nål til en 1 mL sprøjte. Tegn en 100 μL luftpude i sprøjten efterfulgt af 50 μL af smitstoffet. Placer den belastede nål og sprøjte på et sted, der er let tilgængeligt for den dominerende hånd.
  5. Dybt anæstetize en mus ved hjælp af en 4% isofluran/oxygen blanding eller lignende IACUC godkendt metode til anæstesi. Korrekt anæstesidybde er typisk opnås, når respiration satser langsomt til ca 1 indånding per 5 – 8 s og kan bekræftes ved at klemme en vedhæng og observere ingen reaktion fra musen.
    Bemærk: denne metode til anæstesi forudsat en tilstrækkelig bedøvelses periode varighed af ca. 1,5 min. Dette var tilstrækkeligt for medlemmer i vores laboratorium til at lære og udføre denne instillation procedure; Men, andre institutionsmæssigt godkendte anæstesi metoder kan anvendes11,12,13.
  6. Fjern den bedøvede mus fra anæstesi kammeret og suspendere musen på intubation platform fra maxillær incisors.
  7. For at åbne en klar passage ind i luftrøret skal du bruge de stumpede pincet til forsigtigt at forstå og forlænge tungen uden for munden. Overfør tungen fra pincet til tommelfingeren og pegefingeren på den ikke-dominerende hånd.
  8. Bliv ved med at holde tungen i den ikke-dominerende hånd og afhente den forbelastede sprøjte. Peg den bøjede ende af nålen væk fra kroppen og Indsæt nålen i mundhulen til bunden af tungen.
  9. Med nålen i bunden af tungen, forsigtigt vinkel håndleddet for at forårsage et let tryk på nålen væk fra kroppen. Dette trin forsikrer nålen vil blive indsat i luftrør og ikke spiserøret.
  10. Langsomt guide nålen ned i luftrøret; ofte føles en lille flåt som nålen passerer gennem vokal fold. Passere nålen gennem luftrør, indtil svag modstand mærkes som nålen støder på Carina.
  11. Løft nålen lidt i den proksimale retning for at suspendere nålen over Carina. Dette giver mulighed for levering i de to primære bronkier. Tryk injektionssprøjtens stempel helt ned for at levere den smitsomme belastning. Fjern nålen fra luftrøret ved at løfte opad og kassere.
  12. Fjern musen fra intubation platformen ved at trykke gummibåndet, men opretholde holde musen i en opretstående position. Bloker næse luftvejene ved at placere en finger direkte over Nares. Hold denne position i ca. 1 min, eller indtil der observeres flere dybe ånder.
    Bemærk: dette sidste trin sikrer, at den totale inokulum volumen leveres ind i de nedre luftveje.
  13. Returnere musen til sit bur og observere en fuldstændig genopretning fra anæstesi.

2. excision af inficerede lunger

  1. Arbejde i en laminar flow hætte for at opretholde sterilitet, forberede et arbejdsområde med følgende elementer: en skala og steril veje båd, en dissektion platform, en dissektion Kit indeholder saks og pincet, steril RNase-fri PBS, og steril gaze.
  2. Euthanize en inficeret mus med CO2 eller lignende IACUC godkendt metode til eutanasi.
  3. Placer en inficeret mus på en dissektion platform og fastgør musen ved hjælp af stifter i slutningen af hver appendage. Spray musen med ethanol for at hjælpe med at opretholde sterilitet af arbejdsflader.
  4. Begynd ved Umbilicus, brug et par pincet til at løfte huden og lave et snit op til bunden af luftrør. Fatte huden på hver side af den oprindelige Incision, trække huden væk fra kroppen og skære gennem væv forbindelser.
    Bemærk: det kan være nyttigt at lave flere laterale snit på tværs af huden for at afsløre mere af thorax regionen.
  5. Starter ved bunden af xiphoid proces, lave et lille snit med den hensigt at punktere membranen. Dette resulterer i en stigning i trykket i brysthulen, der får lungerne til at trække sig tilbage. Med lungerne tilbagetrukket fortsætte indsnittet for at frigøre membranen.
  6. Fjern ribbenene ved at lave et snit langs begge sider af ribburet. Dette vil fuldt ud udsætte thorax hulrum og lunger.
  7. For at punktafgifts behandle lungerne, tag fat i bunden af hjertet med pincet og løft opad. Placer saksen bag lungerne og begynde at lave små snit gennem vævet forbindelser, mens du fortsætter til løft hjertet opad.
  8. Når lungerne er blevet exciseret, placere dem på den sterile gaze og fjerne hjertet. Hjertet kan let fjernes ved at løfte det væk fra lungerne med pincet og skære de resterende vævs forbindelser.
  9. Overfør lungerne til en fortartet veje båd og Optag vægten.
  10. Efter at lungerne er blevet vejet, overføre dem til steril fosfatbuffer saltvand (PBS) og midlertidigt opbevare dem på is, indtil de bevæger sig fremad til patogenet opsving og analyse trin.

3. genvinding og analyse af patogenet

  1. Fortsæt med at arbejde i en laminar flow hætte, Forbered et arbejdsområde med følgende forsyninger: en vævs sliber, steril RNAse-fri PBS, buffer RLT suppleret med ß-mercaptoethanol (1:100) og 1,5 mL RNAse-fri mikrocentrifuge glas.
    Forsigtig: ß-mercaptoethanol kan være farlig i tilfælde af hudkontakt, indtagelse, øjenkontakt eller indånding. Fortynding af ß-mercaptoethanol i buffer RLT skal ske i en stinkhætte.
  2. Begynd med først at tilføje 1 mL steril RNAse-fri PBS til vævs kværnen. Når fyldt, opbevares vævs kværn på is.
  3. Forbered en serie af sterile RNAse-fri serielle fortyndings slanger, der vil blive brugt til at kvantificere den bakterielle belastning genvundet fra de inficerede lunger. Dette opnås lettest ved at citere 900 μL sterilt vand i hvert mikrocentrifuge glas efterfulgt af en seriel fortynding af patogenet inoculum.
    Bemærk: antallet af fortyndingsrør, som er nødvendige for nøjagtig patogen tælling, vil variere afhængigt af det oprindelige patogen input og infektions varigheden. Dette skal fastlægges empirisk.
  4. Brug sterile pincet, Overfør lungerne til den forberedte vævs sliber og homogeniser vævet grundigt ved at trykke ned på piedestal, mens du roterer.
  5. Åbn vævs kværnen og alikvot 100 μL af den homogeniserede prøve i det første af de fremstillede serielle fortyndings slanger. Serielt fortynde prøverne og optælle CFUs ved plating på næringsstof agar. CFUs kan registreres som CFUs/mL eller CFUs/mL/mg lungevævet.
    Bemærk: på dette trin kan yderligere 200 μL af den homogeniserede prøve fjernes til rensning af viral RNA (Se tabel over materialer) eller opbevares ved-80 °c ved fremtidig analyse.
  6. Efter at aliquoterne er blevet fjernet for CFU-bestemmelse og/eller viral RNA-isolation, skal du udskifte slibe piedestalet og pellet det homogeniserede væv ved at centrifugeres ved 4.000 rpm (3724 x g) i 10 minutter ved 4 °c.
  7. Ved hjælp af en pipette fjernes supernatanten fra den pelleteret prøve og placeres i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    Bemærk: supernatanten er fri for bakterier og kan opbevares ved-80 °C til analyse af opløselige vært-og udskillede patogen faktorer.
  8. Den homogeniserede vævs pellet resuspenderes ved pipettering eller vortexning i 700 μL buffer RLT-ß-mercaptoethanol, og prøven overføres til et sterilt, RNAse frit 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    Bemærk: på dette tidspunkt kan prøverne opbevares ved-80 °C i flere måneder.
  9. Rense RNA ved hjælp af mindre ændringer af fabrikantens protokol for et rensningsanlæg (Se tabel over materialer); Se Voyich et al. 200814.
    1. Den homogeniserede lunge gylle overføres til et 2 mL mikrocentrifuge glas, der indeholder 0,1 mm silica-perler og forarbejdes via en perle beater for 20 s ved 6 m/s.
    2. Prøven centrifugeres ved 1.500 rpm i 3 minutter. Efter centrifugering pipetteres supernatanten i et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
    3. Tilsæt 350 μL 96% – 100% ethanol til prøven og bland grundigt ved pipettering eller inversion.
    4. 700 μL af prøven overføres til en rense søjle anbragt i et 2 mL opsamlings glas. Prøven centrifugeres ved ≥ 8.000 x g i 15 s, og gennemstrømningen kasseres. Kør en eventuel overskydende prøve gennem den samme kolonne som beskrevet ovenfor.
    5. Kolonnen vaskes med 700 μL buffer RW1 og centrifuge prøve ved ≥ 8.000 x g for 15 s. kassér gennemstrømningen, og Overfør silicagel søjlen til et nyt 2 ml opsamlings glas.
    6. Anvend 500 μL buffer RPE på kolonnen. Kolonnen vaskes ved centrifugering ved ≥ 8.000 x g i 15 s. kassér gennemstrømningen.
    7. Påfør yderligere 500 μL buffer RPE til RNeasy-kolonnen, og centrifuge ved 8.000 x g i 2 min. kassér gennemstrømning, og centrifuger kolonnen ved ≥ 10.000 x g i 1 min.
    8. For at elueres oprenset RNA skal du begynde med at overføre søjlen til et nyt 1,5 ml RNase-frit mikrocentrifuge glas. Pipetten 50 μL RNase frit vand direkte på kolonnens silicagel-membran og centrifugeres ved ≥ 8000 x g i 1 min.
      Bemærk: det elueret RNA kan køres over den samme kolonne igen for at øge RNA-udbyttet.
    9. Tilsæt 50 μL RNase frit vand til det rensede RNA for at bringe det totale volumen til 100 μL. aliquot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol efterfulgt af 250 μL 96% – 100% ethanol til prøven og blandes grundigt ved pipettering eller inversion.
    10. Prøven påføres en oprensnings søjle anbragt i en opsamlings slange og centrifugeres ved ≥ 8000 x g i 15 s. kassér gennemstrømnings røret og Udskift opsamlings slangen.
    11. Kolonnen vaskes ved tilsætning af 350 μL buffer RW1 efterfulgt af centrifugering ved ≥ 8000 x g i 15 s.
    12. En DNase-opløsning, der indeholder ca. 27 Kunitz-enheder, skal forberedes ved tilsætning af 10 μL DNase-lager (750 Kunitz-enheder/mL) til 70 μL buffer RDD. Tilsæt 80 μL Dnaseopløsning direkte på silicagel membranen, og Inkuber prøven i 15 minutter ved stuetemperatur.
    13. Kolonnen vaskes med 350 μL buffer RW1 og centrifugeres ved ≥ 8000 x g i 15 s, og gennemstrømningen kasseres.
    14. Gentag trin 3.9.6 – 3.9.8 for at rense RNA.
      Bemærk: det anbefales at gentage RNA-oprydnings proceduren ved at følge trinene 3.9.9 – 3.9.10 og 3.9.6 – 3.9.8 (Spring DNase Steps 3.9.11 – 3.9.13). Denne ekstra oprydning det resulterer i meget høj kvalitet RNA.
  10. RNA-udbytte kan kvantificeres ved hjælp af et spektrofotometer med målinger ved 260 nM til bestemmelse af koncentration og 260:280 nM for renhed. Efter opnåelse af RNA-udbytte, standardisere koncentrationen af hver RNA prøve til 50 ng/μL.
    Bemærk: det anbefales at lave flere aliquoter i en koncentration på 50 ng/μL for at undgå fryse/tø-cyklusser, der kan føre til nedbrydning af RNA.
  11. Det rensede RNA opbevares ved-80 °C eller anvendes straks til transkriptionen.
    Bemærk: i tidligere udgivelser blev RNA fra 3 – 5 mus samlet til transkriptanalyse. Gennem optimering af ovennævnte teknik, RNA fra 1 mus er blevet empirisk bestemt som tilstrækkelig til transkriptionen analyse (80 – 120 ng/μL).

Representative Results

Figur 1 anvender en 0,1% vægt/volumen coomassie Brilliant blå løsning til at påvise, at en intratrakeal instillation leverer inokulum direkte og jævnt i de nedre luftveje. Figur 2 viser, at bakterier (S. aureus) cfus genvundet direkte fra homogeniseret lunge væv. Figur 3 viser brugen af dette system til præcis levering og genvinding af inokulum i de nedre luftveje ved at plotte input og Recovery cfus fra individuelle mus. Figur 4 viser QRT-PCR amplifikationskurven for det bakterielle husholdnings-gen gyrb for at PÅVISE, at bakteriel RNA kan udvindes direkte fra inficeret LUNGE væv med minimal DNA-kontaminering. Figur 5 viser konstruktionen af en standardkurve ved hjælp af QRT-PCR amplifikation af influenza a virus M-segment til påvisning af viral RNA kan udvindes direkte fra inficeret lunge væv.

Figure 1
Figur 1: Intratracheal instillation muliggør jævn fordeling i de nedre luftveje. (A, B) Uinficerede lunger blev fjernet fra en sund mus efter intratrakeal instillation af sterile PBS og fotograferet fra (a) dorsale og (B) ventrale perspektiver. (C, D) 50 μl af en 0,1% coomassie strålende blå opløsning blev administreret til en bedøvet mus via intratrakeal administration. C) dorsal. D) ventral. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentativ genopretning af bakterielle CFUs fra inficeret lunge homogenate. Lunger blev exciseret en dag post-Challenge med S. aureus. Efter homogenering blev 100 μL af lunge opslæmningen serielt fortyndet gennem 10-6. For at optælle CFUs blev 10 μL dråber pletteret fra 10-5 og 10-6 fortyndinger på trypticase Soy agar (TSA) og inkuberet ved 37 °C med 5% C02 natten over. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: præcis levering og genvinding af patogenet inokulum efter intratrakeal administration. Mus blev inddelt i to grupper, der indeholdt tre mus pr. gruppe. Mus blev udsat for intratrakeal instillation af S. aureus ved 1 x 108 (lav) og 2 x 108 (høj) CFU/ml. En time efter infektion, mus blev aflives og lungerne blev exciseret for at demonstrere præcisionen af instillation og nyttiggørelse. Bakteriel inokulum og bakterier genvundet fra lunge homogenatet blev belagt på TSA (Tryptic soja agar). Der blev ikke indberettet signifikante forskelle mellem bakteriel input og nyttiggørelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentativt bakterie-RNA-opsving og renhed. Seks timer efter intratrakeal instillation med 1 x 108 CFU/50 μl af S. aureus, mus blev euthanized. Lungerne blev fjernet og homogeniseret efterfulgt af opblanding af lunge gylle i buffer rlt-ß-mercaptoethanol. RNA blev renset som beskrevet i trin 3,914. qRT-PCR blev brugt til at detektere udskrifter af den bakterielle husholdning gene Gyrb. En kontrol, der indeholder ingen reverse transkriptase (nRT) blev inkluderet for at påvise renheden af RNA genvundet. Ved en tærskel på 0,1 blev Gyrb -transskriptioner detekteret i en gennemsnitlig cyklus på 21,1, 20,3 og 20,5. nRT-kontrolelementer blev ikke fundet, før cyklus gennemsnit 35,9, 35,5 og 35,0. n = 3 biologiske replikater, indeholdende 3 tekniske replikater/biologisk replikat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentativt viral RNA-opsving. Seks dage efter intratrakeal instillation med 100 PFU/50 μl influenza A/pr/8/1934 (H1N1) blev mus euthanized. Lungerne blev fjernet og homogeniseret, og 200 μl af den homogeniserede gylle blev indsamlet og passeret gennem en 70 μm celle si før viral RNA rensning. Renset RNA blev serielt fortyndet (10-1-10-4) efterfulgt af amplifikation af influenza A M-segment. A) amplifikation plot af influenza A RNA genvundet fra en inficeret lunge og fortyndet 10-1-10-4. B) standard kurven for influenza A M-segment. Tærskel = 0,2, R2 = 0,994, hældning =-3,46. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Brug af denne model giver en yderst effektiv og reproducerbar metode til at studere sekundære bakterielle infektioner. Evnen til stramt at kontrollere leveringen af patogenet inokulum giver mere præcise observationer af de enkelte og kombinatoriske virkninger af hvert patogen. Ineffektivitet i den mere almindelige intranasale instillation rute har sandsynligvis bidraget til forskellene i dosismængder og koncentrationer til stede i litteraturen. Det er rimeligt, at manglen på en præcis murine system til at studere sekundær bakteriel lungebetændelse har forsinket fund identificere bakterielle specifikke reaktioner, der bidrager til sværhedsgraden af pulmonale co-infektioner. Udvikling af en reproducerbar model til at studere virulens udtryk under sekundære bakterielle infektioner kan føre til identifikation af vaccine eller Drug mål at forbedre disse infektioner.

Intratrakeal instillation trin er afgørende for med held at etablere en nedre luftvejsinfektion og enhver down-stream analyse af patogener. Når du lærer denne teknik, kan det være nyttigt at øve ved hjælp af et farvestof (som beskrevet i metoderne) før administration af infektiøs materiale. Ved hjælp af et farvestof giver mulighed for direkte visualisering af inokulum i luftvejene. En almindelig fejl, der kan opstå, er indsættelse af stump-nålen i spiserøret i stedet for luftrør. Dette vil resultere i leveringen af inokulum i maven i stedet for lungerne. For at korrigere denne fejl, skal du vinkle nålen længere væk fra kroppen og passere den ned i luftrøret. Når mestrer, denne procedure er meget effektiv og kan bruges til at udføre eksperimenter med et stort antal mus. Ved at arbejde i partier til bedøvelse af mus kan intratrakeal instillation afsluttes i ca. 30 sekunder pr. mus. Desuden kan excision af lungerne afsluttes i 2 til 3 minutter pr. mus.

Genvinding af levedygtige og ren bakteriel RNA fra inficerede væv er afgørende for transkriptionen analyse. RNases er allestedsnærværende og kan hurtigt ødelægge et eksperiment15. Nogle metoder omfatter anvendelse af Rnasehæmmere; Vi har imidlertid konstateret, at frysning af prøven ved-80 °C i RLT-ß-mercaptoethanol eller straks ved behandling af prøven til RNA-isolation ved hjælp af alle Rnasefri rør og reagenser er effektive til at reducere Rnasekontaminering. Derudover anbefaler vi, at højst seks prøver renses på én gang. Herunder mere end seks prøver kan resultere i langvarige ventetid mellem protokol trin, der kan kulere i RNA nedbrydning. Når renset, bør man også være forsigtig for at undgå unødvendige fryse-tø cyklusser. Således, hvis flere analyser vil blive udført på en prøve, at citere renset RNA til opbevaring ved-80 °C anbefales.

Ud over de teknikker, der gennemgås heri, kan denne metode suppleres ved at udføre bronkial alveolær skylning forud for excision og homogenation af lungerne16. Dette kan opnås ved skylning af hele nedre luftveje eller ved hjælp af sutur tråd til at begrænse en forgrenings arm af bronkial træet efterfulgt af skylning gennem den resterende gren. Dette fører ofte til en reduktion i genindvinding af patogenet, men giver en prøve, hvor oplysninger såsom lactat dehydrogenase-aktivitet, cellulær populations identitet og cytokinprofiler kan fås16. Tilsammen kan disse data danne en mere fuldstændig forståelse af det vært-patogen interaktioner, der opstår under sekundær bakteriel lungebetændelse.

Mens de diskuterede metoder har været inden for rammerne af sekundær bakteriel lungebetændelse, de er egnede til at blive udvidet til enhver murine model af nedre luftvejsinfektion; specifikt, dem, der ville drage fordel af stramt kontrolleret levering og nyttiggørelse af den installerede inoculum. Desuden, ligesom mange andre infektion ruter, intratrakeal instillation kan udnyttes i ikke-infektiøse applikationer, såsom administration af terapeutiske og miljømæssige forbindelser12.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Nicole Meissner, M.D./ph.d., Montana State University, for hendes hjælp til at etablere intratrakeal instillation metode. Dette arbejde blev støttet af U.S. National Institutes of Health (tilskud NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), samt midler fra Montana University system Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) og Montana State University Landbrug eksperiment Station.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911100 Referred to in text as "0.1 mm silica beads"
21-gauge blunt needle SAI B21-150 1.5" is recommended.
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 DNase used in the accompanying text.
FastPrep-24 Classic Instrument MP Biomedicals 116004500 FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents Applied Biosystems 4405543 Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Intubation Stand Kent Scientific ETI-MES-01 Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house.
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904 Viral RNA purification kit.
Tissue Grinders Thermo Fisher Scientific 02-542-08
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) Calbiochem UN2966

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64, (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
  2. Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
  3. Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201, (4), 508-515 (2010).
  4. Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. (2016).
  5. Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7, (2), 31359 (2012).
  6. Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209, (6), 865-875 (2014).
  7. Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7, (4), (2016).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218, (5), 809-813 (2018).
  9. Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119, (7), 1910-1920 (2009).
  10. McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2, (4), 240-249 (2007).
  11. Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, (2), 222-230 (2008).
  12. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  13. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  14. Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
  15. Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10, (4), 585-597 (2006).
  16. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
En præcis patogen levering og nyttiggørelse system for murine modeller af sekundær bakteriel lungebetændelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).More

Borgogna, T. R., Sanchez-Gonzalez, A., Gorham, K., Voyich, J. M. A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (151), e59566, doi:10.3791/59566 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter