Summary
כאן, אנו מציגים שיטות כדי לשפר את מחקרי דלקת ריאות משנית על ידי מתן תוואי לא פולשני של חוסר החלטיות לתוך דרכי הנשימה התחתונה ואחריו שחזור הפתוגן וניתוח תעתיק. הליכים אלה ניתנים לעיקור וניתן לבצעו ללא ציוד מיוחד כגון צינורית, חוטי מדריך או כבלי סיבים אופטיים.
Abstract
דלקת ריאות בקטריאלי משנית בעקבות דלקות שפעת מדרג באופן עקבי בתוך עשרת הגורמים המובילים למוות בארצות הברית. עד כה, מודלים murine של זיהום שיתוף כבר הכלי העיקרי שפותחה כדי לחקור את הפתווגיות הן של זיהומים העיקרי והמשני. למרות השכיחות של מודל זה, אי-התאמות ניכרים בהליכי הליכי מינון, כרכים וefficacies נפוצים בקרב הלימודים. יתר על כן, מאמצים אלה היו מושלמים במידה רבה בטיפול כיצד הפתוגן יכול להיות ישירות המשפיעים על התקדמות המחלה לאחר זיהום. כאן אנו מספקים שיטה מדויקת של משלוח הפתוגן, התאוששות, ניתוח לשמש מודלים murine של דלקת ריאות משנית. אנו מדגימים כי intratracheal האינטללציה מאפשר אספקה יעילה ומדויקת של אמצעי אחסון מבוקרים באופן ישיר ואחיד לתוך מערכת הנשימה התחתונה. הריאות ניתן להשיג כדי להתאושש לכמת את הנטל הפתוגן. בעקבות כריתה של הריאות נגוע, אנו מתארים שיטה לחלץ RNA באיכות גבוהה הפתוגן עבור ניתוח הטרנססקריפט הבאים. הליך זה מועיל להיות שיטה לא ניתוחית של מסירה ללא שימוש בציוד מעבדה מיוחדות ומספק אסטרטגיה הניתנת לקריאה כדי לחקור את התרומות של הפתוגן לדלקת ריאות משנית.
Introduction
דלקת ריאות בקטריאלי משנית בעקבות זיהום שפעת היא הגורם המוביל למוות בארצות הברית ואזור פעיל של מחקר1,2. למרות מחקרים רבים באמצעות מודלים murine של דלקת ריאות משנית, חוסר עקביות לגבי המחלה הפתוגן והחקירה נשארים3,4,5. בנוסף, בעוד מאמצים קודמים רבים התמקדו ההשפעות האימונומודולטוריים של שפעת שמובילה susceptibly מוגברת לזיהום חיידקי משני, נתונים עדכניים יותר מציע התקפה אלימה של הפתוגן החיידקי הוא שווה המשתתף לקראת הקמת מחלה6,7,8,9. נתונים חדשים אלה מחייבים שיטה מדויקת יותר כדי לחקור דלקת ריאות משנית במודלים murine של זיהום שיתוף המאפשרים חקירה לתוך תגובת הפתוגן.
ייחודי שיתוף מודלים לזיהום שפעת, אורגניזמים מארחים הם במכוון חיסוני במתכוון על ידי זיהום שפעת העיקרי לפני הממשל של סוכן חיידקי משני. על מנת לשכפל ביותר את המחלה בפתוגנזה שנצפתה בפונדקאים אנושיים, זה הכרחי כי עומס הפתוגן של שני סוכנים ראשיים ומשניים להיות נשלט כדי להתבונן השפעות הפרט והקומבינטורית של כל סוכן זיהומיות. בדרך כלל, זיהומים בדרכי הנשימה בעכברים הוקמו באמצעות מינהל intranasal3,4,5,6,10. בגלל תוואי זה הוא ציין להיות פשוט מבחינה טכנית והוא יכול להיות מתאים בכמה יישומים לזיהום יחיד הסוכן, זה לא מתאים מודלים לזיהום שיתוף, כמו הליכי מינון, כמויות המינון, ואת היעילות הם מאוד משתנה בתוך התפרסםספרות 3,4,5,6.
כדי להשיג הבנה מלאה יותר של הפתוגנזה דלקת ריאות משנית, תרומות של שני המארחים והפתוגן חייב להיחשב. לשם כך, פיתחנו גישה ישירה ומגובשת להתאוששות של חיידקים קיימא ו-RNA פתוגן מהריאות הנגועות. שיטה זו עושה שימוש פשוט, לא פולשנית הליך intratra, ואחריו בידוד הבאים של רנ א חיידקי. הליך העברת היתר המתואר במסמך זה דומה לשיטות שתוארו קודם לכן ואינו מוגבל למשלוח הפתוגן11,12,13. השימוש בנוהל מסוים זה מועיל בעלות נמוכה ואינו מחייב שימוש בציוד מיוחד כגון צינורית, חוטי מדריך או כבל סיבים אופטיים; יתר על כן, כי הליך זה אינו פולשני הוא מבודד לחץ מינימלי על נושאים murine, ממזער תגובה דלקתית מתוך מכניקת חיסונים, ומספק נתיב משלוח יעיל לזיהום של נושאים מרובים. בקצרה, העכברים המושהים. מושעים מחותכות מלקחיים משמשים בעדינות לתפוס את הלשון ואחריו על ידי החדרת כפוף טעון מראש, קהה-משופעת, 21-מד מחט לתוך קנה הנשימה ומסירה של עומס הפתוגן. אימות של הליך זה מוכח על ידי אישור חזותי של צבע מופץ באופן שווה לתוך התא הריאתי והתאוששות של עומס חיידקי. אנו לאחר מכן להדגים כיצד לשחזר את האורהולוקוקוס קיימא (S. האוראוס) מן הריאות נגוע ולתאר שיטת השחזור כדי לבודד RNA באיכות גבוהה הפתוגן.
Protocol
כל השיטות תואמות את ההנחיות הלאומיות לבריאות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת מדינת מונטנה.
1. האינטרוסטציה
- הכן מרחב עבודה המכיל את האספקה הבאה: פלטפורמת צנרור, מזרק מעוקר 1 מ"ל, סטרילי מלקחיים בוטה קהה, סטרילי 21-מד מחט קהה, ושני צינורות חרוט לאחסן את המזרק ואת מלקחיים.
הערה: ניתן לרכוש פלטפורמות צנרור באופן מסחרי או מוקם בתוך הבית. פלטפורמת הצנרור המשמשת כאן נבנתה באמצעות 0.25 אינץ ' פלקסיגלס. בקצרה, החום הוחל על פלקסיגלס והלוח מכופף זווית הפנים משוער 65 °. בצד החיצוני של פלטפורמת הצנרור, שני בורגי מכונה הופרה בהפרש של 3 סנטימטרים ולהקת גומי הושהתה בין שני הברגים. - הכינו את הפתוגן על ידי מדלל באופן סדרתי את המדגם כך הריכוז הסופי הרצוי מתקבל בנפח כולל של 50 μL. Store את האינוות על הקרח.
- לבישת כפפות סטרילי, לכופף 21 G בוטה משופעת מחט ל כ 35 °.
הערה: יש צורך במחט נפרדת עבור כל עכבר. - לתקן את המחט 21 גרם בוטה קהה מזרק 1 מ ל. צייר 100 μL כרית אוויר לתוך המזרק ואחריו 50 μL של הסוכן הזיהומיות. הניחו את המחט והמזרק שנטענו במקום נגישים בקלות בידי היד הדומיננטית.
- באופן עמוק מורדם עכבר באמצעות 4% isofלבנה/חמצן תערובת או דומה IACUC מאושר שיטה של הרדמה. עומק הרדמה נכונה מושגת בדרך כלל כאשר קצב הנשימה איטי כ 1 שאיפת לכל 5 – 8 s והוא יכול להיות מאושר על ידי צובט הנספח והתבוננות לא תגובה מהעכבר.
הערה: שיטה זו של הרדמה סיפקה משך ההרדמה מספיק של כ 1.5 דקות. זה היה מספיק לחברים במעבדה שלנו כדי ללמוד ולבצע את הליך ההחדרה; עם זאת, ניתן לעשות שיטות הרדמה אחרות שאושרו ב-11,12,13. - להסיר את העכבר מורדם מחדר ההרדמה ולהשעות את העכבר על פלטפורמת צנרור מן חותכות הלסת מלאה.
- כדי לפתוח מעבר ברור לתוך קנה הנשימה, להשתמש מלקחיים בוטה משופעת לתפוס בעדינות למתוח את הלשון מחוץ לתוך הפה. העבירו את הלשון מהלקחיים לתוך האגודל והאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית.
- הישארו מחזיקים את הלשון ביד הלא שלטת והרימו את המזרק שנטען מראש. הצבע את הקצה העקום של המחט הרחק מן הגוף ולהכניס את המחט לתוך חלל הפה לבסיס הלשון.
- עם המחט בבסיס הלשון, בעדינות זווית היד כדי לגרום דחיפה קלה של המחט הרחק מן הגוף. צעד זה מבודד את המחט יוכנס לקנה הנשימה ולא הוושט.
- לאט להנחות את המחט למטה לתוך קנה הנשימה; לעתים קרובות שנתות קל מרגיש כמו המחט עובר דרך קיפול הקול. להעביר את המחט דרך קנה הנשימה עד התנגדות קלה הוא הרגיש כמו המחט נתקלת הקרינה.
- מרימים מעט את המחט בכיוון הגבוה ביותר כדי להשעות את המחט מעל הקרינה. הדבר מאפשר מסירה לשני הברוצ הראשי. לדכא לחלוטין את הבוכנה של המזרק כדי לספק את העומס הזיהומיות. הסר את המחט מקנה הנשימה על ידי הרמת כלפי מעלה ולהשליך.
- להסיר את העכבר מפלטפורמת צנרור ידי מדכא את הלהקה גומי אבל לשמור על החזקת העכבר בתנוחה זקופה. לחסום את דרכי הנשימה של האף על ידי הצבת אצבע ישירות מעל nares. החזיקו עמדה זו למשך כ 1 דקות או עד כמה נשימות עמוקות מתבוננים.
הערה: השלב האחרון מבטיח שעוצמת הקול הכוללת תימסר למערכת הנשימה התחתונה. - להחזיר את העכבר לכלוב שלו ולהתבונן התאוששות מלאה מן ההרדמה.
2. כריתה של הריאות נגוע
- עבודה בתוך מכסה הזרימה לשימור כדי לשמור על עקרות, להכין סביבת עבודה עם הפריטים הבאים: קנה מידה וסירה שוקל סטרילי, פלטפורמת חיתוך, ערכת ניתוח המכיל מספריים ומלקחיים, מעוקר RNAse-PBS חינם, ו גזה סטרילית.
- המתת חסד עכבר נגוע עם CO2 או דומה IACUC מאושר שיטת המתת חסד.
- מניחים עכבר נגוע על פלטפורמת לחיתוך ולאבטח את העכבר באמצעות פינים בסוף כל תוספת. לרסס את העכבר עם אתנול כדי לעזור לשמור על עקרות של משטחי עבודה.
- החל על הטבור, השתמש זוג מלקחיים להרים את העור ולעשות חתך לבסיס של קנה הנשימה. אוחז את העור משני צדדיו של החתך הראשוני, למשוך את העור הרחק מהגוף וחותכים את הקשרים רקמות.
הערה: זה יכול להיות שימושי לעשות כמה חתכים לרוחב על פני העור כדי לחשוף יותר של אזור החזה. - החל בבסיס התהליך, הפוך את החתך הקטן בכוונה לתוך הסרעפת. התוצאה היא עלייה בלחץ בחלל החזה הגורמת הריאות לסגת. עם הריאות ושוב להמשיך את החתך כדי לשחרר את הסרעפת.
- להסיר את הצלעות על ידי ביצוע חתך לאורך שני צידי כלוב הצלעות. זה יחשוף לחלוטין את. חלל החזה והריאות
- כדי לבלו את הריאות, אחוז בבסיס הלב עם הלקחיים והרם כלפי מעלה. הניחו את המספריים מאחורי הריאות והתחילו לעשות חתכים קטנים דרך הרקמה בזמן שממשיכים להרים את הלב כלפי מעלה.
- מניחים אותם על הגזה. הסטרילית ומסירים את הלב הלב ניתן להסיר בקלות על ידי הסרתו מן הריאות עם מלקחיים לחתוך את החיבורים הנותרים רקמות.
- העבירו את הריאות לסירה שוקלת. מראש והקליטו את המשקל
- לאחר הריאות שקלו, להעביר אותם מלוחים סטרילית מאגר פוספט (PBS) ולאחסן אותם באופן זמני על הקרח עד לנוע קדימה התאוששות הפתוגן ושלבי ניתוח.
3. שחזור וניתוח הפתוגן
- המשך לעבוד בתוך כיסוי הזרימה למינארי, להכין את סביבת העבודה עם האספקה הבאה: מטחנת רקמות, מעקר RNAse-PBS חינם, מאגר RLT שיושלם עם למשל-mercaptoethanol (1:100), ו 1.5 mL RNAse-מיקרוצנטריפוגה חינם צינורות.
התראה: במקרה של מגע העור, בליעה, קשר עין או אינהלציה. דילול של מרסטואתנול לתוך מאגר RLT צריך להיעשות בתוך מכסה. - להתחיל על ידי הוספת הראשון 1 מ ל של הPBS סטרילי RNAse-חינם אל מטחנת הרקמה. . ברגע שתמלא, אחסן את מטחנת הרקמה על הקרח
- הכן סדרה של צינורות דילול RNAse-חינם סדרתי שישמשו לכמת את העומס חיידקי התאושש הריאות הנגוע. זה מושגת בקלות ביותר על ידי מצטט 900 μL של מים סטריליים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה כל ואחריו על ידי דילול סדרתי של הפתוגן.
הערה: מספר צינורות הדילול הנחוצים לספירת פתוגן מדויקת ישתנו בכניסת הפתוגן הראשונית ובמשך ההדבקה. . זה חייב להיקבע באמצעות מדעית - באמצעות מלקחיים סטרילי, להעביר את הריאות לתוך מטחנת הרקמה המוכן והמגון ביסודיות את הרקמה על ידי לחיצה על המעמד בעת סיבוב.
- פתח את מטחנת הרקמה סדרת מחלקים 100 μl של המדגם המתכלה לתוך הראשון של צינורות הדילול הסדרתי המוכנים. מדלל את הדגימות ומספור את הדפוס באמצעות ציפוי על אגר מזינים. ניתן להקליט את הקפוס כ-CFUs/mL או בדפוס/מ מ/mg של רקמת הריאה.
הערה: בשלב זה 200 μL נוספים של דגימת הומוגניים ניתן להסיר לטיהור של רנ א נגיפי (ראה טבלת חומרים) או מאוחסן ב-80 ° c לניתוח עתידי. - לאחר ההסרה הוסרו לקביעת CFU ו/או ויראלי בידוד RNA, להחליף את המעמד שחיקה ואת הגלולה הומוגניים הרקמה ידי צנטריפוגה ב 4,000 rpm (3724 x g) עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- באמצעות פיפטה, להסיר את supernatant מתוך דגימת המקום ומקום לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
הערה: סופרנטנט הוא ללא חיידקים וניתן לאחסנו ב-80 ° c לניתוח של גורמי הפתוגן מסיסים ומופרשים. - השהה מחדש את הרקמה המנשבת על-ידי ליטוף או vortexing ב-700 μL של מאגר RLT-, מרקוטואתנול והעבר את הדגימה לשפופרת סטרילית RNAse-1.5 free mL מיקרוצנטריפוגה.
הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 ° c במשך מספר חודשים. - טיהור RNA באמצעות שינויים קלים בפרוטוקול היצרן של ערכת טיהור (ראה טבלת חומרים); ראה Voyich et al. 200814.
- להעביר את המיטר הריאה מוקצב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכיל 0.1 מ"מ חרוזי סיליקה ו מעובד באמצעות מקצף חרוז עבור 20 s ב 6 מ מ.
- צנטריפוגה את המדגם ב 1,500 סל ד למשך 3 דקות. לאחר צנטריפוגה, מנקז את הסופרנטנט לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL.
- הוסף 350 μL של 96% – 100% אתנול למדגם לערבב ביסודיות על ידי ליטוף או היפוך.
- העבר 700 μL של המדגם לעמודת טיהור הממוקמת בשפופרת אוסף של 2 מ"ל. צנטריפוגה את המדגם ב ≥ 8,000 x g עבור 15 s ולמחוק את הזרימה דרך. הפעל את כל הדגימות העודפות דרך אותה עמודה כפי שתוארה לעיל.
- לשטוף את העמודה עם 700 μL של מאגר RW1 ומדגם צנטריפוגה ב ≥ 8,000 x g עבור 15 s. למחוק את הזרימה-דרך ולהעביר את הטור קרום סיליקה לתוך צינור חדש 2 mL האוסף.
- החל את 500 μL של מאגר RPE לעמודה. לשטוף את העמודה על ידי צנטריפוגה ב ≥ 8,000 x g עבור 15 s. למחוק את הזרימה.
- החל נוסף 500 μL של מאגר RPE לעמודה RNeasy וצנטריפוגה ב 8,000 x g עבור 2 דקות. למחוק את זרימת ולצנטריפוגה את העמודה ב-≥ 10,000 x g עבור 1 דקות.
- כדי לטהר את ה-RNA, התחל בהעברת הטור לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה 1.5 mL RNAse. פיפטה 50 μL של RNase-מים ללא תשלום ישירות על ממברנה סיליקה ג'ל של העמודה ואת צנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 1 דקות.
הערה: ה-RNA החומק יכול להיות מופעל על אותה עמודה שוב כדי להגדיל את התשואה RNA. - להוסיף 50 μL של RNase-מים ללא מטוהרים RNA כדי להביא את הנפח הכולל ל 100 μL. Aliquot 350 μL RLT-מרסטואתנול ואחריו 250 μL של 96% – 100% אתנול למדגם ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף או היפוך.
- החל את המדגם על עמודת טיהור ממוקם בצינור אוסף וצנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 15 s. למחוק את הזרימה ולהחליף את צינור הגבייה.
- לשטוף את העמודה על ידי הוספת 350 μL של מאגר RW1 ואחריו צנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 15 s.
- הכנת פתרון DNase המכיל כ 27 יחידות Kunitz ידי הוספת 10 μL של מלאי DNase (750 ביחידות Kunitz/mL) כדי 70 μL של מאגר RDD. הוסף 80 μL של הפתרון DNase ישירות על קרום סיליקה ג'ל ו מודקת את המדגם עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את העמודה עם 350 μL של מאגר RW1 ו צנטריפוגה ב ≥ 8000 x g עבור 15 s ולמחוק את הזרימה דרך.
- חזור על שלבים 3.9.6 – 3.9.8 לטהר את ה-RNA.
הערה: מומלץ לחזור על הליך הניקוי של RNA על-ידי ביצוע השלבים 3.9.9 – 3.9.10 ו 3.9.6 – 3.9.8 (דלג על שלבי DNase 3.9.11 – 3.9.13). זה נוסף לנקות את זה גורם RNA באיכות גבוהה מאוד.
- תשואה RNA ניתן לכמת באמצעות ספקטרוסקופיה עם קריאות ב 260 nM לקביעת ריכוז 260:280 nM לטוהר. לאחר תשואה RNA מושגת, לתקנן את הריכוז של כל דגם RNA כדי 50 ng/μL.
הערה: מומלץ לבצע מספר מחזורי שינה בריכוז של 50 ng/μL כדי למנוע הקפאה/הפשרה של מחזורים שיכולים להוביל לירידה RNA. - אחסן את ה-RNA הטהור ב-80 ° צ' או השתמש באופן מיידי לניתוח תעתיק.
הערה: בפרסומים קודמים רנ א מ 3-5 עכברים היתה במאגר עבור ניתוח תעתיק. באמצעות אופטימיזציה של הטכניקה הנ ל, רנ א מ 1 העכבר נקבע אמפירי מספיק עבור ניתוח תעתיק (80 – 120 ng/μL).
Representative Results
איור 1 מנצל 0.1% משקל/נפח הפתרון כחול מבריק כדי להדגים כי intratracheal האינסטיציה מספקת את האינומיש באופן ישיר ואחיד בתוך מערכת הנשימה התחתונה. איור 2 מראה כי החיידקים (S.אורפוס) התאושש ישירות מרקמת ריאה הומוגניים. איור 3 מדגים את השימוש במערכת זו למסירה והתאוששות מדויקים של האירשת בדרכי הנשימה התחתונה על-ידי התוויית הקלט והשחזור של העכברים הבודדים. איור 4 מציג את עקומת הגברה של רביעיית ה-PCR של הגנים החיידקיים של שירות החדרנית כדי להדגים כי רנ א חיידקי ניתן לחילוץ ישירות מרקמת ריאה נגוע עם זיהום DNA מינימלי. איור 5 מראה את הבנייה של עקום רגיל באמצעות רביעיית הגברה של השפעת הנגיף מקטע M וירוס להפגין RNA ויראלי ניתן לחילוץ ישירות מרקמת הריאה נגוע.
איור 1: מערכת העיכול מאפשרת גם הפצה למערכת הנשימה התחתונה. (א, ב) הריאות נגוע נלקחו עכבר בריא בעקבות intratracheal האינקטלציה של PBS סטרילי וצילם מ (א) מתוך נקודות מבט (ב) הגגול. (ג, ד) 50 μl של a 0.1% coomassie הפתרון הכחול המבריק היתה ניתנת לעכבר מורדם באמצעות מינהל intratracheal. (ג). (ד) וגחוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התאוששות מייצגת של הדפוס החיידקי של המגון ריאות נגוע. הריאות נלקחו יום אחד אחרי אתגר עם ס. האוראוס. בעקבות הומוגון, 100 μL של מדלל הריאות היה מדולל באופן סדרתי דרך 10-6. כדי לספור את ה-CFUs התאושש, 10 טיפות μL היו מצופה 10-5 ו 10-6 לדלל הסויה הטריטיק אגר (האו) ו מודחלת ב 37 ° c עם 5% c02 בן לילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: משלוח והתאוששות מדויקים של הפתוגן בעקבות הממשל intratracheal. עכברים חולקו לשתי קבוצות המכילות שלושה עכברים לכל קבוצה. עכברים היו חשופים לחוסר החלטיות של האוראוס ב-1 x 108 (נמוך) ו-2 x 108 (גבוה) cfu/mL. שעה אחת לאחר זיהום, העכברים הורמתו והריאות היו מוכי להפגין את הדיוק של החוסר וההתאוששות. בקטריות וחיידקים ששוחזרו מהמגון של הריאה היו מצופים ב-"קו-הסויה" (טריטיק אגר). לא דווחו הבדלים משמעותיים בין קלט בקטריאלי להתאוששות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מייצג ההתאוששות RNA החיידק וטוהר. שישה שעות אחרי הקשר עם 1 x 108 cfu/50 μl של האוראוס, עכברים הורדמים. ולאחריו השעיה של הריאות. במאגר הניקוז של אר. RNA היה מטוהר כמתואר בשלב 3.914. "רביעיית-PCR" שימש לזיהוי תמלילים של גן המשק החיידקי גירב. פקד שאינו מכיל טרנססקריפט הפוכה (nRT) נכלל כדי להדגים את טוהר ה-RNA התאושש. על סף של 0.1, התעתיקים של Gyrb זוהו במחזור הממוצע של 21.1, 20.3, ו 20.5. פקדי nRT לא זוהו עד למחזור הממוצע 35.9, 35.5 ו-35.0. n = 3 משכפל ביולוגי, המכיל 3 שכפול טכני/ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התאוששות ויראלית RNA שחזור. שישה ימים לאחר הזמן האחרון עם 100 PFU/50 μL של שפעת A/PR/8/1934 (H1N1), עכברים הורדמים. הריאות היו מוכי הומוגניים, ו-200 μl של המנגירי הומוגניים נאסף ועבר דרך מסננת תא 70 יקרומטר לפני ויראלי RNA טיהור. רנ א מטוהרים היה מדולל באופן סדרתי (10-1-10-4) ואחריו הגברה של שפעת מקטע M. (א) הגברה העלילה של שפעת RNA ששוחזר מריאה נגוע מדולל 10-1– 10-4. (ב) העקומה הסטנדרטית של שפעת פלח M. סף = 0.2, R2 = 0.994, מדרון =-3.46. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
השימוש במודל זה מספק שיטה מאוד יעילה ומתוכוללת לחקר זיהומים חיידקיים משניים. היכולת לשלוט בחוזקה על המסירה של הפתוגן המחלה מאפשרת תצפיות מדויקות יותר של ההשפעות האישיות והקומבינטורית של כל פתוגן. חוסר יעילות בתוואי הintranasal הנפוץ יותר הסביר להניח שתרמו לאי-התאמות בכרכים ובריכוזים הקיימים בספרות. סביר כי העדר מערכת murine מדויקת ללמוד דלקת ריאות משנית בקטריאלי יש הממצאים מזהים תגובות בקטריאלי ספציפיים התורמים חומרת שיתוף זיהומים ריאתי. פיתוח מודל שניתן להתרבות לחקור ביטוי התקפה אלימה במהלך זיהומים חיידקיים משניים עלול להוביל לזיהוי של החיסון או מטרות התרופה שפר זיהומים אלה.
השלב של intratracheal האינסטילציה הוא קריטי כדי ליצור בהצלחה זיהום במערכת הנשימה הנמוכה וכל ניתוח למטה הזרם של פתוגנים. בעת לימוד טכניקה זו, ייתכן שיהיה זה מועיל לתרגל באמצעות צבע (כמתואר בשיטות) לפני ניהול חומר מדבק. שימוש בצבע מאפשר את ההדמיה הישירה של האינורשת למערכת הנשימה. טעות נפוצה שיכולה להתרחש היא החדרת המחט קהה לתוך הוושט במקום קנה הנשימה. הדבר יגרום להעברת האירשת לבטן ולא לריאות. כדי לתקן את הטעות הזאת, להטות את המחט רחוק יותר מהגוף ולהעביר אותו לתוך קנה הנשימה. ברגע שולט, הליך זה יעיל מאוד והוא יכול לשמש לעריכת ניסויים עם מספר גדול של עכברים. העבודה בקבוצות לעכברים מכהים, ניתן להשלים את האינטראאטאל בתוך כ -30 שניות לכל עכבר. בנוסף, ניתן להשלים את כריתה של הריאות בתוך 2 עד 3 דקות לכל עכבר.
שחזור של רנ א וטהור בקטריאלי מרקמות נגוע הוא קריטי לניתוח תעתיק. . ויכולים להרוס במהירות את הניסוי15 שיטות מסוימות כוללות שימוש במעכבי RNase; עם זאת, מצאנו כי הקפאת המדגם ב-80 ° c ב RLT-מרקפטואתנול או באופן מיידי עיבוד המדגם לבידוד RNA באמצעות כל RNase צינורות חינם ריאגנטים יעילים בהפחתת זיהום RNase. בנוסף, אנו ממליצים לטהר מקסימום שישה דגימות בו. כולל יותר משש דגימות יכול לגרום השהיות ממושכות בין שלבי הפרוטוקול שיכולים להסתיים בירידה RNA. לאחר מטוהר, הטיפול צריך גם להילקח כדי למנוע מחזורי הקפאת ההקפאה מיותרת. כך, אם מספר ניתוחים ייעשה על מדגם אחד, הציטוט מטוהרים RNA עבור אחסון ב-80 ° c מומלץ.
בנוסף לטכניקות שנבדקו לעיל, ניתן לבצע שיטה זו על ידי ביצוע שאיפה ברונכיט מכתשיים לפני כריתה והומוציה של הריאות16. זה יכול להתבצע על ידי שאיפה של מערכת הנשימה התחתונה כולה או באמצעות חוט תפר להגביל זרוע אחת הסתעפות של עץ הסימפונות ואחריו שאיפה בענף הנותרים. לעתים קרובות זה מוביל להפחתת ההתאוששות של עומס הפתוגן אך מספק דגימה כאשר מידע כגון פעילות לקטט דהידרוגנאז, זהות האוכלוסייה הסלולרית, פרופילי cy, ניתן להשיג16. יחד נתונים אלה יכולים ליצור הבנה מלאה יותר של אינטראקציות מארח הפתוגן המתרחשים במהלך דלקת ריאות משנית בקטריאלי.
בעוד השיטות שנדונו היו בתוך ההקשר של דלקת ריאות משנית בקטריאלי, הם מתאימים להיות מורחב לכל מודל מורטין של זיהום הנשימה התחתון; באופן ספציפי, אלה שירוויחו מסירה מבוקרת היטב והתאוששות של מותקן. יתרה מזאת, כמו רבים מנתיבי הזיהום האחרים, ניתן להפיק את הבעיות הבלתי-זיהומיות ביישומים שאינם מדבקים, כגון מינהל therapeutics ותרכובות סביבתיות12.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים היו מודים לניקול מייסנר, md/Ph.D., האוניברסיטה הממלכתית של מונטנה, על עזרתה בהקמת שיטת האינטראטרציה. עבודה זו נתמכת על ידי U.S. המכונים הלאומיים לבריאות (מענקים NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), כמו גם כספים מתוך יוזמת המחקר של מערכת האוניברסיטה של מונטנה (51040-MUSRI2015-03) ו אוניברסיטת מונטנה מדינת . תחנת הניסוי של החקלאות
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
| 21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
| FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
| TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
| Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
| Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |
References
- Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64 (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
- Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
- Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201 (4), 508-515 (2010).
- Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. , (2016).
- Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7 (2), 31359 (2012).
- Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209 (6), 865-875 (2014).
- Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7 (4), (2016).
- Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218 (5), 809-813 (2018).
- Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1910-1920 (2009).
- McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2 (4), 240-249 (2007).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
- Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10 (4), 585-597 (2006).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
