Summary
여기에서, 우리는 병원체 복구 및 전사체 분석에 선행된 더 낮은 호흡기관에 주입의 비침범성 경로를 제공함으로써 이차 세균성 폐렴 연구를 향상시키는 방법을 제시한다. 이러한 절차는 재현 가능하며 캐뉼라, 가이드 와이어 또는 광섬유 케이블과 같은 특수 장비 없이도 수행할 수 있습니다.
Abstract
인플루엔자 감염 에 따르는 이차 세균성 폐렴은 미국에 있는 죽음의 상위 10개의 주요한 원인 안에 일관되게 순위. 현재까지, 공동 감염의 murine 모형은 1 차적인 및 이차 감염 둘 다의 병리학을 탐구하기 위하여 개발된 1 차적인 공구이었습니다. 이 모델의 보급에도 불구 하 고, 증심 절차에 관한 상당한 불일치, 복용량 볼륨, 그리고 efficacies 연구 중 널리 퍼진. 더욱이, 이러한 노력은 병원체가 감염 후 질병 진행에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는 방법을 해결하는 데 크게 불완전했다. 본 명세서에서 우리는 이차 세균성 폐렴의 뮤린 모델에 사용되는 병원균 전달, 회복 및 분석의 정확한 방법을 제공한다. 당사는 경간 내 주입을 통해 통제된 부피를 하부 호흡기로 직접, 그리고 고르게 정확하게 전달할 수 있음을 입증합니다. 폐는 병원체 부담을 회복하고 정량화하기 위해 절제될 수 있습니다. 감염된 폐의 절제에 이어, 후속 전사 분석을 위해 고품질 병원체 RNA를 추출하는 방법을 설명한다. 이 절차는 전문 실험실 장비를 사용하지 않고 전달의 비 수술 방법인 에서 혜택을 이차 세균성 폐렴에 병원균 기여를 조사하는 재현 가능한 전략을 제공합니다.
Introduction
인플루엔자 감염에 따른 이차 세균성 폐렴은 미국에서 주요 사망 원인이며 연구1,2의활성 영역이다. 이차 세균성 폐렴의 murine 모형을 사용하여 수많은 연구 결과에도 불구하고, 병원체 주입 및 심문에 관하여 불일치는3,4,5남아 있습니다. 또한, 많은 이전의 노력이 이차 세균 감염에 대한 민감성 증가로 이어지는 인플루엔자의 면역 조절 효과에 초점을 맞추고 있지만, 최근 의 자료에 따르면 세균 병원균의 독성 조절은 동등하다는 것을 시사합니다. 질병의 설립을 향해 기여6,7,8,9. 이 새로운 데이터는 병원체 반응에 대한 조사를 용이하게 하는 공동 감염의 뮤린 모형에 있는 이차 세균성 폐염을 탐구하는 더 정확한 방법을 필요로 합니다.
인플루엔자 공동 감염 모델에 고유, 숙주 유기체는 이차 세균 제의 투여 전에 1 차적인 인플루엔자 감염에 의해 의도적으로 면역 손상된다. 인간 숙성에서 관찰되는 질병 병인을 가장 잘 복제하기 위해서는 각 감염제의 개별 및 조합 효과를 관찰할 수 있도록 1차 및 이차 제제모두의 병원체 부하를 조절하는 것이 필수적이다. 가장 일반적으로, 마우스의 호흡기 감염은 비강 내 투여3,4,5,6,10을통해 확립되었다. 이 경로는 기술적으로 간단하고 일부 단일 에이전트 감염 응용 프로그램에서 적합 할 수있는 만큼, 점안 절차, 용량 볼륨 및 효능은 내에서 매우 가변적이기 때문에 공동 감염 모델에 적합하지 않습니다. 출판 문학3,4,5,6.
이차 세균성 폐렴 병인의 더 완전한 이해를 얻으려면, 호스트와 병원체 둘 다의 기여를 고려해야 합니다. 이를 위해, 우리는 감염된 폐에서 가능한 박테리아와 병원체 RNA의 회복을 위한 간단하고 재현 가능한 접근법을 개발했습니다. 이 방법은 세균RNA의 후속 격리에 선행된 간단한, 비침범성 내선 내 주입 절차를 이용합니다. 본 명세서에 기재된 심개내 시술은 앞서 설명한 방법과 유사하며 병원체전달(11,12,13)에한정되지 않는다. 이 특정 절차의 사용은 저렴한 비용으로 이점을 얻을 수 있으며 캐뉼러, 가이드 와이어 또는 광섬유 케이블과 같은 특수 장비를 사용할 필요가 없습니다. 또한, 이 절차는 비 침습적이기 때문에 뮤린 과목에 대한 최소한의 스트레스를 보장하고, 접종 역학에서 염증 반응을 최소화하며, 여러 피험자의 감염을위한 효율적인 전달 경로를 제공합니다. 간략하게, 이소플루란 마취 마우스는 절개에서 중단됩니다. 집게는 부드럽게 기관에 미리로드 된 구부러진, 무딘 팁, 21 게이지 바늘의 삽입 및 병원체 부하의 전달 에 이어 혀를 잡는 데 사용됩니다. 이 절차의 검증은 균등하게 폐 구획에 분포 된 염료의 시각적 인 확인과 세균 부하의 회복에 의해 입증된다. 그런 다음 감염된 폐에서 가능한 황색포도상구균(S. aureus)을회복하는 방법을 설명하고 고품질 병원균 RNA를 분리하는 재현 가능한 방법을 설명합니다.
Protocol
모든 방법은 건강의 국가 학회 지침에 부합하고 몬태나 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 내막 주입
- 삽관 플랫폼, 멸균 1mL 주사기, 멸균 무딘 팁 집게, 멸균 21게이지 무딘 팁 바늘, 주사기와 집게를 저장하는 원추형 튜브 2개 등 다음 소모품이 포함된 작업 공간을 준비합니다.
참고: 삽관 플랫폼은 상업적으로 구입하거나 사내에서 건설할 수 있습니다. 여기에 사용되는 삽관 플랫폼은 0.25 인치 플렉시 유리를 사용하여 구성되었습니다. 간단히 말해서, 열이 플렉시 글라스에 가해졌고 보드는 약 65° 내부 각도로 구부러집니다. 삽관 플랫폼의 외부 측에서는 두 개의 기계 나사를 3인치 간격으로 시드하고 두 나사 사이에 고무 밴드가 매달려 있었습니다. - 원하는 최종 농도가 총 부피 50 μL에서 수득되도록 시료를 직렬로 희석하여 병원균 접종을 준비합니다.
- 멸균 장갑을 착용하고 21G 무딘 기울어진 바늘을 약 35°로 구부립니다.
참고: 각 마우스마다 별도의 바늘이 필요합니다. - 구부러진 21G 무딘 기울어진 바늘을 1 mL 주사기로 고정하십시오. 100 μL 공기 쿠션을 주사기에 넣고 감염제의 50 μL을 그립니다. 지배적 인 손으로 쉽게 접근 할 수있는 위치에로드 된 바늘과 주사기를 놓습니다.
- 깊이 마취 4% 이소플루란 / 산소 혼합물 또는 유사한 IACUC 마취의 유사한 IACUC 방법을 사용하여 마우스. 적당한 마취 깊이는 일반적으로 호흡 속도가 5-8 s 당 대략 1 흡입으로 느릴 때 얻어지며 부속기를 꼬집고 마우스에서 아무 반응도 관찰하여 확인할 수 있습니다.
참고 : 이 마취 방법은 약 1.5 분의 충분한 마취 기간을 제공했습니다. 이것은 우리 실험실의 회원들이 이 주입 절차를 배우고 수행하기에 충분했습니다. 그러나, 다른 제도적으로 승인 된 마취 방법은11,12,13을사용할 수있다. - 마취 실에서 마취 된 마우스를 제거하고 상악 절개에서 삽관 플랫폼에 마우스를 일시 중단하십시오.
- 기관으로 명확한 통로를 열려면 무딘 팁 집게를 사용하여 입 바깥쪽으로 혀를 부드럽게 잡고 확장하십시오. 포셉에서 비 지배적 인 손의 엄지 손가락과 집게 손가락으로 혀를 옮김으로 옮김을 옮김.
- 비 지배적 인 손에 혀를 잡고 미리로드 된 주사기를 데리러 유지. 바늘의 구부러진 끝을 몸에서 멀리 가리키고 혀의 기저부로 구강에 바늘을 삽입합니다.
- 혀 의 기지에 바늘로, 부드럽게 몸에서 바늘의 약간의 푸시를 일으킬 손목을 각도. 이 단계는 바늘이 식도가 아닌 기관에 삽입될 것을 보장합니다.
- 천천히 기관으로 바늘을 안내; 바늘이 보컬 폴을 통과할 때 종종 약간의 진드기가 느껴질 수 있습니다. 바늘이 카리나에 부딪을 때 약간의 저항이 느껴될 때까지 기관을 통해 바늘을 통과시다.
- 카리나 위의 바늘을 일시 중단하기 위해 근접 방향으로 바늘을 약간 들어 올립니다. 이것은 2개의 1 차적인 기관지로 납품을 가능하게 합니다. 전염성 부하를 전달하기 위해 주사기의 플런저를 완전히 누르습니다. 위쪽으로 들어 올려 기관에서 바늘을 제거하고 폐기하십시오.
- 고무 밴드를 누르고 삽관 플랫폼에서 마우스를 제거하지만 마우스를 똑바로 세워 서 유지합니다. 손가락을 nares 위에 직접 배치하여 비강 기도를 방해하십시오. 이 자세를 약 1분 간 또는 여러 번 의심이 관찰될 때까지 유지합니다.
참고 : 이 마지막 단계는 총 접종 량이 하부 호흡기로 전달되도록합니다. - 마우스를 케이지로 되돌리고 마취에서 완전한 회복을 관찰하십시오.
2. 감염된 폐 절제
- 멸균을 유지하기 위해 층류 후드 내에서 작업하고 스케일 및 멸균 계량 보트, 해부 플랫폼, 가위 및 집게가 들어있는 해부 키트, 멸균 RNAE없는 PBS 및 멸균 거즈로 작업 공간을 준비하십시오.
- 감염된 마우스를CO2 또는 이와 유사한 IACUC 승인 된 안락사 방법으로 안락사시.
- 감염된 마우스를 해부 플랫폼에 놓고 각 부속기 끝에 핀을 사용하여 마우스를 고정합니다. 작업 표면의 불임 유지를 위해 에탄올로 마우스를 살포하십시오.
- 배꼽에서 시작, 피부를 들어 올리고 기관의 기지까지 절개를 하기 위해 집게의 쌍을 사용합니다. 초기 절개 양쪽의 피부를 잡고, 몸에서 피부를 당기고 조직 연결을 통해 잘라.
참고 : 흉부 부위를 더 많이 드러내기 위해 피부를 가로 질러 여러 개의 측면 컷을 만드는 것이 도움이 될 수 있습니다. - xiphoid 과정의 기지에서 시작하여 횡격막을 뚫을 의도로 작은 절개를하십시오. 이것은 폐가 철회하는 원인이 되는 흉부 구멍에 있는 압력의 증가 결과. 폐가 후퇴하면서 절개를 계속하여 횡격막을 풀어.
- 갈비뼈의 양쪽을 따라 절개를 하여 갈비뼈를 제거합니다. 이것은 흉강과 폐를 완전히 노출시킬 것입니다.
- 폐를 절제하려면 집게로 심장 의 기저를 잡고 위쪽으로 들어 올립니다. 폐 뒤에 가위를 놓고 심장을 위쪽으로 들어 올리는 동안 조직 연결을 통해 작은 절개를 하기 시작합니다.
- 폐가 절제되면 멸균 거즈에 놓고 심장을 제거하십시오. 심혼은 집게로 폐에서 멀리 들어 올리고 나머지 조직 연결을 절단하여 쉽게 제거될 수 있습니다.
- 폐를 미리 타르식 계량 보트로 옮기고 무게를 기록합니다.
- 폐를 칭량한 후에, 멸균 인산완충 식염수 (PBS)로 그(것)들을 전송하고 병원체 복구 및 분석 단계로 앞으로 이동할 때까지 얼음에 일시적으로 저장합니다.
3. 병원체 복구 및 분석
- 층류 후드 내에서 계속 작업, 다음과 같은 공급 작업 공간을 준비: 조직 분쇄기, 멸균 RNAse 무료 PBS, 완충 RLT ß-mercaptoethanol (1:100), 그리고 1.5 mL RNAse 무료 미세 원심 분리 튜브.
주의: ß-메르카포에탄올은 피부 접촉, 섭취, 눈 접촉 또는 흡입시 위험할 수 있습니다. 완충물 RLT로의 ß-메르카포에탄올의 희석은 연기 후드에서 이루어져야 한다. - 먼저 멸균 RNAE 없는 PBS 1 mL을 티슈 그라인더에 첨가하여 시작합니다. 일단 채워진 후, 티슈 그라인더를 얼음 위에 보관하십시오.
- 감염된 폐에서 회수된 세균 부하를 정량화하는 데 사용되는 일련의 멸균 RNAE-FREE 직렬 희석 튜브를 준비합니다. 이것은 병원체 접종의 직렬 희석에 선행된 각 microcentrifuge 관으로 살균근의 900 μL를 aliquoting에 의해 가장 쉽게 달성됩니다.
참고 : 정확한 병원체 열거에 필요한 희석 튜브의 수는 초기 병원균 입력 및 감염 기간에 따라 달라집니다. 이것은 경험적으로 결정되어야합니다. - 멸균 집게를 사용하여 폐를 준비된 조직 분쇄기로 옮기고 회전하는 동안 받침대를 눌러 조직을 철저히 균질화합니다.
- 조직 분쇄기 및 균질화된 샘플의 알리쿼트 100 μL을 제조된 직렬 희석 튜브의 제1로 열어. 샘플을 연속적으로 희석하고 영양한천에 도금하여 CFU를 동봉합니다. CFU는 폐 조직의 CFUs/mL 또는 CFU/mL/mg으로 기록될 수 있습니다.
참고: 이 단계에서 는 바이러스 RNA의 정제를 위해 균질화된 샘플의 추가 200 μL을 제거하거나 향후 분석을 위해 -80°C에 보관할 수 있습니다. - CFU 결정 및/또는 바이러스 RNA 분리를 위해 양호를 제거한 후, 4°C에서 10분 동안 4,000 rpm (3724 x g)에서원심분리하여 분쇄 받침대 및 펠릿을 교체합니다.
- 파이펫을 사용하여 펠릿 샘플에서 상급자를 제거하고 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣습니다.
참고 : 상판은 박테리아가 없으며 수용성 숙주 및 분비 된 병원균 인자의 분석을 위해 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. - 완충RLT-ß-메르카포에탄올의 700 μL에서 파이펫팅 또는 와르싱하여 균질화된 조직 펠릿을 재중단하고 시료를 멸균 RNAE-free 1.5 mL 미세원원지 튜브로 옮김을 옮김.
참고 : 이 시점에서 샘플은 몇 달 동안 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. - 정제 키트의 제조업체 프로토콜에 약간의 수정을 사용하여 RNA를 정화 (재료 표참조); 참조 Voyich 외. 200814.
- 균질화된 폐 슬러리를 0.1 mm 실리카 비드를 함유하는 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 6 m/s에서 20s의 비드 비터를 통해 처리합니다.
- 샘플을 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상급체를 새로운 1.5 mL 미세원원원지 튜브로 피펫한다.
- 시료에 96%-100% 에탄올의 350 μL을 추가하고 파이펫팅 또는 반전으로 철저히 혼합합니다.
- 시료의 700 μL을 2 mL 수집 튜브에 배치된 정제 컬럼으로 이송한다. 샘플을 ≥ 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리하고 흐름을 폐기한다. 위에서 설명한 것과 동일한 열을 통해 초과 샘플을 실행합니다.
- 완충RW1 및 원심분리기 시료를 ≥8,000 x g에서 15초로 700 μL로 세척하고, 유동을 버리고 실리카 막 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브로 옮긴다.
- 500 μL의 버퍼 RPE를 컬럼에 적용합니다. 15 s에 대 한 ≥ 8,000 x g에서 원심 분리에 의해 열을 세척 합니다.
- RNeasy 컬럼과 원심분리기에 500 μL의 버퍼 RPE를 추가로 적용하여 2분 동안 8,000 x g에 적용합니다.
- 정제 된 RNA를 용출하려면 컬럼을 새로운 1.5 mL RNAse없는 미세 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 피펫 50 μL의 RNase-free 물은 1 분 동안 ≥8000 x g에서 기둥및 원심 분리기의 실리카 겔 멤브레인에 직접 상한다.
참고: 용출된 RNA는 RNA 수율을 높이기 위해 동일한 컬럼을 다시 통해 실행될 수 있습니다. - 정제된 RNA에 RNase 가 없는 물 50 μL을 추가하여 총 부피를 100 μL로 가져와서 Aliquot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol을 시료에 250 μL-100% 에탄올로 넣고 파이펫팅 또는 반전으로 철저히 혼합합니다.
- 샘플을 수집 튜브에 배치하고 15 초 동안 ≥8000 x g의 원심 분리기에 샘플을 적용하십시오.
- 350 μL의 버퍼 RW1을 추가한 다음 15s에 대해 ≥8000 x g의 원심분리를 추가하여 컬럼을 세척합니다.
- 버퍼 RDD의 70 μL에 DNase 스톡(750 Kunitz units/mL)의 10 μL을 추가하여 약 27개의 Kunitz 단위를 포함하는 DNase 용액을 준비합니다. 80 μL의 DNase 용액을 실리카 겔 멤브레인에 직접 넣고 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오.
- 350 μL의 버퍼 RW1 및 원심분리기를 15s에 대해 ≥8000 x g로 세척하고 흐름을 폐기합니다.
- RNA를 정화하기 위해 3.9.6-3.9.8 단계를 반복합니다.
참고: 3.9.9-3.9.10 단계 및 3.9.6-3.9.8(DNase 단계 3.9.11-3.9.13 건너뛰기)을 수행하여 RNA 정리 절차를 반복하는 것이 좋습니다. 이 추가 정리는 매우 높은 품질의 RNA를 초래한다.
- RNA 수율은 농도를 결정하기 위한 260 nM 및 순도를 위한 260:280 nM의 판독값을 가진 분광광도계를 사용하여 정량화될 수 있다. RNA 수율을 얻은 후 각 RNA 샘플의 농도를 50 ng/μL로 표준화합니다.
참고: RNA 분해로 이어질 수 있는 동결/해동 주기를 피하기 위해 50 ng/μL의 농도에서 여러 개의 aliquots를 만드는 것이 좋습니다. - 정제된 RNA를 -80°C에 저장하거나 전사체 분석을 위해 즉시 사용하십시오.
참고: 이전 간행물에서 3-5 마우스로부터의 RNA를 전사체 분석을 위해 풀화하였다. 상기 기술의 최적화를 통해, 1마우스로부터의 RNA는 전사적으로 전사적 으로 전사적 으로 결정되어 전사적 분석(80-120 ng/μL).
Representative Results
그림 1은 0.1% 중량/부피 쿠마시 브릴리언트 블루 용액을 사용하여 내강내 주입이 하부 호흡기 내에서 직접 적이고 균일하게 접종을 제공한다는 것을 입증합니다. 도 2는 박테리아(S. 아우레우스)CFUs가 균질화된 폐 조직으로부터 직접 회수되었다는 것을 나타낸다. 도 3은 개별 마우스로부터의 입력 및 회수 CFU를 플로팅하여 하부 호흡기에서 접종의 정확한 전달 및 회복을 위해 이 시스템의 사용을 나타낸다. 도 4는 세균성 RNA가 최소한의 DNA 오염으로 감염된 폐 조직으로부터 직접 추출될 수 있음을 입증하기 위해 세균 하우스키핑 유전자 gyrB의 qRT-PCR 증폭 곡선을 나타낸다. 도 5는 감염된 폐 조직으로부터 직접 추출될 수 있는 바이러스 RNA를 입증하기 위해 인플루엔자 A 바이러스 M-세그먼트의 qRT-PCR 증폭을 이용한 표준 곡선의 구성을 나타낸다.
그림 1: 내막 삽입은 하부 호흡기로 균일한 분포를 가능하게 합니다. (A, B) 감염되지 않은 폐를 멸균 된 PBS의 경막 내 주입 후 건강한 마우스로부터 절제하고(A)등쪽 및(B)복부 원근에서 촬영하였다. (C, D)50 μL의 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 용액을 마취된 마우스에 투여하여 경부내 투여를 통해 투여하였다. (C)등살. (D) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 감염된 폐 균질화로부터세균 CFUs의 대표적인 회복. 폐는 S. 아우레우스와 함께 하루 후 도전을 절제했다. 동질화 에 이어, 폐 슬러리의 100 μL을10-6을통해 직렬로 희석하였다. 회수된 CFUs를 열거하기 위해, 10 μL 방울을 트립틱 콩 한천(TSA)에10-5 및10-6 희석으로부터 도금하고 37°C에서 5% C02하룻밤동안 배양하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 병원체 내 투여 후 병원체 접종의 정확한 전달 및 회복. 마우스는 그룹당 3개의 마우스를 포함하는 2개의 그룹으로 분할되었다. 마우스는 1 x 108 (낮음) 및 2 x 108 (높은) CFU/mL에서 S. 아우레우스의 내내 주입을 실시하였다. 1시간 후 감염, 마우스를 안락사시키고 폐를 절제하여 증착 및 회복의 정밀도를 입증하였다. 폐 균질화로부터 회수된 세균 접종 및 박테리아는 TSA(트립틱 콩 한천)에 도금하였다. 세균 입력과 복구 사이에 는 유의한 차이가 보고되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대표적인 세균 RNA 회수 및 순도. S. 아우레우스의1 x 108 CFU/50 μL을 가진 경내 주입 후 6시간, 마우스를 안락사시켰다. 폐를 절제하고 균질화한 다음 완충제 RLT-ß-메르카포에탄올에서 폐 슬러리를 재증설시켰다. RNA는 단계 3.914에기재된 바와 같이 정제되었다. qRT-PCR은 세균 가사 유전자 gyrB의 전사체를 검출하는데 사용되었다. 회역전사제(nRT)를 함유하지 않는 대조군을 회수된 RNA의 순도를 입증하기 위해 포함시켰다. 0.1의 임계값에서, gyrB 전사체는 21.1, 20.3 및 20.5의 평균 주기에서 검출되었다. nRT 컨트롤은 주기 평균 35.9, 35.5 및 35.0까지 감지되지 않았습니다. n = 3개의 생물학적 복제본, 3개의 기술적 복제/생물학적 복제본을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 대표적인 바이러스 RNA 회복. 인플루엔자 A/PR/8/1934(H1N1)의 100 PFU/50 μL을 가진 경내 주입 후 6일, 마우스를 안락사시켰다. 폐를 절제하고 균질화하고, 균질화된 슬러리의 200 μL을 수집하여 바이러스 RNA 정제 전에 70 μm 세포 스트레이너를 통과시켰다. 정제된 RNA는 연속적으로 희석(10-1-10-4)하고 인플루엔자 A M-세그먼트의 증폭을 하였다. (a)인플루엔자 A RNA의 증폭 플롯은 감염된 폐로부터 회수되고10-1-10-4를희석시켰다. (B)인플루엔자 A M 세그먼트의 표준 곡선. 임계값 = 0.2, R2 = 0.994, 경사 = -3.46. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 모형의 사용은 이차 세균성 감염을 공부하는 고도로 능률적이고 재현가능한 방법을 제공합니다. 병원균 접종의 전달을 엄격하게 제어하는 능력은 각 병원체의 개별 및 조합 효과를 보다 정밀하게 관찰 할 수 있게합니다. 보다 일반적인 비강 내 주입 경로의 비효율성은 문헌에 존재하는 용량 및 농도의 불일치에 기여할 가능성이 있다. 이차 세균성 폐렴을 연구하는 정확한 뮤린 시스템의 부족이 폐 공동 감염의 엄격에 기여하는 세균성 특정 반응을 확인하는 사실 인정을 연기한 것이 합리적입니다. 이차 세균 감염 도중 독성 발현을 공부하기 위하여 재현가능한 모형을 개발하는 것은 이 감염을 개량하기 위하여 백신 또는 약 표적의 확인으로 이끌어 낼 수 있었습니다.
내선 주입 단계는 성공적으로 더 낮은 호흡기 감염 및 병원체의 어떤 다운 스트림 분석을 설치하는 것이 중요합니다. 이 기술을 배울 때, 감염성 물질을 투여하기 전에 염료(방법에 설명된 대로)를 사용하는 연습을 하는 것이 도움이 될 수 있다. 염료를 사용하면 접종을 호흡기로 직접 시각화 할 수 있습니다. 발생할 수 있는 일반적인 실수는 기관 보다는 식도에 무딘 바늘의 삽입입니다. 이것은 폐 보다는 오히려 위장으로 접종의 납품 귀착될 것입니다. 이 실수를 수정하려면 바늘을 몸에서 더 멀리 각도를 잡고 기관으로 전달하십시오. 일단 숙달되면, 이 절차는 매우 효율적이며 많은 수의 마우스와 함께 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 마우스를 마취하기 위해 일괄 처리하여 작업하면 마우스당 약 30초 만에 내골 내 주입을 완료할 수 있습니다. 또한, 폐의 절제는 마우스 당 2 ~ 3 분 안에 완료 될 수있다.
감염된 조직에서 실행 가능하고 순수한 세균 RNA의 회복은 전사체 분석에 매우 중요합니다. RNases는 유비쿼터스이며 신속하게 실험15를망칠 수 있습니다. 일부 방법은 RNase 억제제 사용 포함; 그러나, 우리는 RLT-ß-mercaptoethanol에서 -80 °C에서 샘플을 동결하거나 모든 RNase 자유 튜브 및 시약을 사용하여 RNA 격리를위한 샘플을 즉시 처리하는 것이 RNase 오염을 줄이는 데 효과적이라는 것을 발견했습니다. 또한 한 번에 최대 6개의 샘플을 정화하는 것이 좋습니다. 6개 이상의 샘플을 포함하면 RNA 분해가 절정에 달할 수 있는 프로토콜 단계 간의 대기 시간을 연장할 수 있습니다. 일단 정제, 주의 또한 어떤 불필요 한 동결 해동 주기를 피하기 위해 주의 해야 한다. 따라서 한 샘플에서 여러 번의 분석이 수행될 경우 -80 °C에서 저장하기 위해 정제 된 RNA를 aliquoting하는 것이 좋습니다.
본 명세서에서 검토된 기술 이외에, 이 방법은폐(16)의절제 및 균질화 이전에 기관지 폐포 세척을 수행함으로써 보충될 수 있다. 이것은 전체 하부 호흡기의 세척또는 봉합사 스레드를 사용하여 기관지 나무의 한 가지 팔이 남아있는 가지를 통해 세척을 제한함으로써 달성 될 수 있습니다. 종종 이는 병원체 부하의 회복의 감소를 유도하지만, 이에 따라 락테이트 탈수소효소 활성, 세포 집단 정체성 및 사이토카인 프로파일과 같은 정보를 얻을 수 있는 샘플을 제공한다16. 이 데이터는 함께 이차 세균성 폐염 도중 생기는 호스트 병원체 상호 작용의 더 완전한 이해를 형성할 수 있습니다.
논의 된 방법은 이차 세균성 폐렴의 맥락 내에 있었지만, 그들은 더 낮은 호흡기 감염의 모든 뮤린 모델로 확장하기에 적합하다; 특히, 설치된 접종의 엄격하게 제어 된 전달 및 복구의 혜택을 누릴 수 있습니다. 더욱이, 다른 많은 감염 경로와 마찬가지로, 내/내 주입은 치료제 및 환경화합물(12)의투여와 같은 비감염성 적용에 활용될 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 니콜 마이스너, M.D./Ph.D., 몬태나 주립 대학, 내선 내 점착 방법을 확립에 그녀의 도움에 감사드립니다. 이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다 (보조금 NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), 뿐만 아니라 몬태나 대학 시스템 연구 이니셔티브 (51040-MUSRI2015-0015)에서 자금 농업 실험 스테이션.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
| 21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
| FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
| TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
| Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
| Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |
References
- Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64 (2), at http://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr64/nvsr64_02.pdf 1 (2013).
- Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
- Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201 (4), 508-515 (2010).
- Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. , (2016).
- Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7 (2), 31359 (2012).
- Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209 (6), 865-875 (2014).
- Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7 (4), (2016).
- Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218 (5), 809-813 (2018).
- Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1910-1920 (2009).
- McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2 (4), 240-249 (2007).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, Clifton, N.J. 109-122 (2008).
- Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10 (4), 585-597 (2006).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
