Summary
Formålet med denne protokol er at påvise sikre nekropsy teknikker i små og store dyr for at opnå tilfredsstillende vævsprøver til rabies testning.
Abstract
New York State Department of Health (NYSDOH) rabies laboratorium modtager mellem 6.000 til 9.000 prøver årligt og udfører rabies test for hele staten, med undtagelse af New York City. Rabies laboratoriet nekropsier en række dyr spænder i størrelse fra flagermus til bovids. De fleste af disse prøver er dyr, der udviser neurologiske tegn, men mindre end 10% faktisk test positiv for rabies; indebærer traumer, læsioner eller andre smitsomme agenser som årsag til disse symptomer. På grund af risikoen for aerosolizing udiagnosticeret infektiøse agenser, rabies laboratoriet ikke bruger el-værktøj eller Save. Tre nekropsy teknikker vil blive præsenteret for dyr, hvis kranier er uigennemtrængelige med saks. Laboratoriet har implementeret disse teknikker for at mindske potentiel udsættelse for smitsomme agenser, eliminere unødvendig manipulation af præparatet og reducere behandlingstiden. Fordelene ved en foretrukken teknik i modsætning til en anden er underlagt den uddannede individuelle behandling af prøven.
Introduction
Arbejder på nekropsy gulvet i en rabies laboratorium er i sagens natur farlig. Til tider ankommer prøver med indlejrede Porcupine quills, fremmedlegemer, herunder pile/kugler/pellets eller udsatte knogle skår, der kan trænge ind i den beskyttende shipping wrap. Ukorrekt emballering kan medføre lækage og bringe individer, der udpakning af prøver, i fare. Ud over fysisk skade risikerer nekropsy teknikere at blive udsat for ukendte zoonotiske infektiøse agenser fra CNS-og kropsvæsker i enhederne. Desuden kan ektoparasitter, der bæres af præparatet, overføre andre zoonotiske sygdomme, da lopme og flåter almindeligvis ses på indgivne dyr. Afhængigt af geografisk placering og arter involveret de udsatte sygdomme varierer. Arbovira såsom Eastern Equine encephalitis virus (EEEV) eller West Nile virus (WNV), flåtbårne sygdomme, herunder Lyme sygdom eller tularæmi, bakterier, der forårsager Q-feber eller tuberkulose, og infektiøse prioner navngive et lille antal af de mulige farer1 , 2 , 3.
Formålet med disse metoder er at demonstrere sikre og effektive nekropsy teknikker ved hjælp af instrumenter, der minimerer potentialet for aerosolisering i modsætning til el-værktøj eller Save4,5. Almindeligt, nekropsy af små dyr i rabies laboratorium kræver skære væk de kranielle muskler og ved hjælp af en hammer og mejsel til at åbne den caudale dorsale del af calvarium6. Fjernelse af dette område af calvarium udsætter baghjernen, herunder hele cerebellum og kraniel hjernestammen. Modificerede nekropsy teknikker kan udføres på den ventrale del af kraniet, undgå de store kranielle muskler og tykkere regioner af kraniet. Men, disse modificerede nekropsy teknikker er kun muligt, når præparatet er uden cervikal ryghvirvler.
Tilsvarende kan hjernevæv i store dyr fjernes ved at adskille de kranielle muskler og åbne den caudale rygdel af kraniet7. Der kræves en betydelig indsats for at udsætte cerebellum og hjernestammen, da kranier af større dyr generelt er tykkere. For at undgå at trænge ind i kraniet, er lederen af et stort dyr placeret, så den ventro-hale del af kraniet står over for teknikeren. Ved hjælp af modificerede instrumenter fjernes cerebellum og hjernestammen gennem foramen magnum. Dette svarer til den prøve anskaffelsesmetode, der anbefales af TSE-undersøgelserne under EU-reference laboratoriet for transmissible spongiforme encephalopati (TSE)8. Cranial hvirvler bør fjernes på forhånd for at give adgang til foramen magnum.
Anvendelse af disse teknikker er til gavn for passende uddannede teknikere i rabies laboratorier. Som rabies laboratorium modtager prøver af forskellige størrelser, fra unge flagermus til voksne trækheste9, teknikeren har flere metoder til at vælge fra baseret på den individuelle omstændighed. Den metode, der er påvist for et stort dyr, er også hensigtsmæssig for dyrlæger, som udfører nekropsiser i marken, da det er besværligt og dyrt at sende et helt stort dyre hoved til rabies testning. Gennemførelsen af en af disse teknikker vil forbedre sikkerheden ved at mindske potentialet i aerosol produktion, reducere håndteringen af prøven og spare behandlingstid. Da området imidlertid ikke har de samme fordele som et laboratorium, der er oprettet specifikt for rabies testning, er det vigtigt, at alle ændringer af disse procedurer fokuserer på sikkerhed, især brug af personlige værnemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne metoder blev godkendt af Wadsworth Centers institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg (IACUC).
1. forberedelse
- Don PPE, på minimum øjenbeskyttelse (briller eller ansigt skjold), kirurgisk eller N-95 maske, og ikke-latex handsker.
- Forbered arbejdsområde, ideelt et bio-Safety kabinet (BSC), med en disponibel arbejdsoverflade, der dækker (f. eks. kraftpapir eller absorberende puder) og rene nekropsy instrumenter (figur 1).
- Prøven placeres på arbejdsoverfladen, og der anvendes instrumenter til at manipulere den for at vurdere prøvens tilstand, herunder tegn på nedbrydning, skader på kraniet, potentielle farer (f. eks. Porcupine quills, skalpel klinger) og kvaliteten af decapitation.
2. ventral metode
Bemærk: når præparatet er korrekt decapiteret på kæbelinjen, vil foramen magnum og occipital kondyle blive eksponeret. Ventrale metode er mindre kompliceret for at hente cerebellum og hjernestammen.
- Placer præparatet med ventrale side op og næse dirigerer fikseres mod bagsiden af BSC.
- Hold en ortopædisk hammer/Mallet i højre hånd (hvis højrehåndede) og på samme tid holde et rådmænd mejsel i venstre hånd.
- Placer mejsel i en 45 ° vinkel med hjørnepunktet af mejsel, der dirigerer mellem højre side af temporale knogler og occipital knogle gør en "V" åbning.
- Slå toppen af mejsel med hammeren, indtil de to knogler adskilte. Gør snittet til støder op til basisphenoid knogle.
- Gentag på venstre side af temporale knogle/occipital knogle (figur 2a).
- Bøje "V"-området af kraniet nedad med mejsel. Eksponere hele rhombencephalon-området i hjernen (cerebellum og hjernestammen) (figur 2b).
- SCOOP ud hjernestammen og cerebellum med saks og pincet. Fjern eventuelle resterende stykker fra kraniet, hvis hjernestammen og cerebellum ikke kom ud i et enkelt stykke.
3. dorsale metode
Bemærk: Hvis præparatet har en dårlig hugning (foramen magnum ikke synlig), og halsen ikke let kan fjernes under nekropsy, eller hvis der er mistanke om beskadigelse af cerebellum, bør rygnings metoden udnyttes.
- Placer præparatet dorsalt med næsen dirigerer fikseres mod bagsiden af BSC.
- Ved hjælp af tumor tenacula, forstå den venstre temporale muskel med tænder af tenacula og lås ved at klemme håndtaget.
- Skær den tidsmæssige muskel ned til knoglen med skarp udskæring kniv.
- Drej prøven 180 ° med tenacula og kniv (ikke hånd) og Gentag processen på den modsatte temporale muskel. Udsætte kraniet.
- Placer en mejsel i en 45 ° vinkel med hjørnepunktet af mejsel på midten af kraniet på tidspunktet for parietal og intraparietal knogle.
- Slå toppen af mejsel med en hammer, indtil en horisontal åbning er lavet på den øverste halvdel af kraniet på parietal knogle.
- Drej prøven 180 °, og Gentag processen på den modsatte side.
- Indsæt punkt af mejsel i slutningen af cut 1 (figur 3a) og ved 90 ° vandret åbning. Strike med hammeren, indtil åbningen når occipital knogle (ca. 10 cm afhængigt af størrelsen af prøven).
- Rul prøven og Gentag på den modsatte side i slutningen af cut 2.
Bemærk: med præparatet dorsale og næse placeret mod bagsiden af BSC, er åbningerne i kraniet ligner en Upside-down "U". - Indsæt tænderne af tenacula i kraniet i bunden af "U" og PRY mod sig selv. Udsæt den hale ende af cerebrum og cerebellum (figur 3b).
- Brug en saks som en scoop, og lirk hele cerebellum ud i hulrummet.
- Brug væv pincet til at drille ud hjernen stamme fra foramen.
4. stor animalsk metode
- Placer præparatet således, at rygdelen af kraniet er i kontakt med nekropsy overfladen med den hale del af kraniet og foramen magnum overfor teknikeren.
- Indsæt den modificerede stilethæl kniv i foramen magnum i mellem rygmarven og spinal meninges så vidt muligt.
- Score omkring rygmarven til at adskille cerebellum og hjernen stamme fra spinal meninges. Efter kniven er indsat gennem foramen magnum, forsigtigt vinkel kniven til at følge langs kraniet så meget som muligt.
- Indsæt en kemi spatel eller tynd, længe håndteret ske i rummet mellem neurale væv og spinal meninges.
- Sonde omkring rygmarven og cerebellum for at sikre forbindelsen til rygmarvs meninges er blevet afbrudt.
- Hold hjernestammen med pincet. Med den anden hånd, forskud skeen rostrally derefter dorsalt at scoop op cerebellum. Samtidig trække tilbage på hjernen stammen med pincet og scoop ud cerebellum ved hjælp af skeen.
Bemærk: det kan tage mere end ét forsøg på at inddrive tilstrækkelig cerebellum til rabies testning.
5. post nekropsy
- Bortskaf alle engangsmaterialer (handsker, puder, arbejdsområde belægninger) og ubrugte væv i biologisk farligt affald.
- Rengør og Desinficer alle instrumenter med den tilgængelige metode (f. eks. industriel opvaskemaskine, autoklave, kemisk desinfektionsmiddel, kogning).
- Rengør og Desinficer alle arbejdsflader med 20% blegemiddel og/eller 70% ethanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle terrestriske prøver indsendt med kranier mellem januar 31, 2019 og februar 28, 2019 havde oplysninger om tilstedeværelsen af en hals og metoden til nekropsy indsamlet. I denne periode blev 170 hoveder nekropsied med 18 arter repræsenteret. 52% (89/170) blev korrekt Decapitated. De resterende havde mindst én hvirvlen vedlagt herunder tre hele kroppen prøver. Ventrale metoden blev brugt 75% (128/170) af tiden, af dem, hals var til stede på 49. Prøver indsendt med en hals vil have det fjernet under nekropsy at give mulighed for ventrale metode, når det er muligt. Tre store dyr (ko, hjorte, svin) blev indgivet, og i to tilfælde blev den store dyre protokol anvendt. Den store dyre protokol blev ikke brugt på grisen, fordi der var behov for ekstra prøver af hjernevæv til yderligere testning. Et egern blev indsendt med et knust kranium og blot skære væk huden eksponeret hjernevæv, således ingen af de ovennævnte metoder blev anvendt (tabel 1).
På friske intakte indlæg, alle tre metoder vil resultere med den nødvendige væv for pålidelige rabies diagnostiske testresultater. Lejlighedsvis, cerebellum og hjernestammen kan ikke fjernes intakt, selv efter at fjerne alle væv fra hindhjernen disse væv kan identificeres og behandles i overensstemmelse hermed.
Disse tre værdifulde metoder kan ikke kompensere for dårlig prøve kvalitet forårsaget før modtagelsen på laboratoriet. Traumer, nedbrydning og dårlige hugning metoder kan påvirke udfaldet, uanset hvor effektivt prøverne er indsamlet.
Figur 1: instrumenter, der anvendes til rabies nekropsy. Buet skarp-stump Mayo saks, glat-tippet væv dressing pincet uden tænder, rådmand ortopædisk knogle mejsel, ortopædisk Mallet-hammer, låsning tumor-tenacula, restaurant-kvalitet carving kniv, modificeret stilethæl kniv, kemi ske, og skærpet spiseskefuld. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ventral metode til nekropsy. (A) placering af udskæringer: sted punkt af en mejsel ved foden af pilen, skåret i retning af grøn pil og Gentag efter den gule pil danner en "V" omkring foramen magnum. Lirk "V" ned for at afsløre hjernestammen og cerebellum. (B) hjernestammen (grøn) og cerebellum (blå), når de eksponeres ved hjælp af ventrale metode til nekropsy. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: dorsale metode til nekropsy. (A) placering af udskæringer: sted punkt af en mejsel ved foden af pilen og skæres i retning af pilen i den rækkefølge, der danner en "U". Lirk "U" ned for at udsætte cerebellum med hjernestammen under den. B) cerebellum (cirklet) ved eksponering ved brug af dorsale-metoden. Hjernestammen ligger direkte nedenunder og er ikke synlig, før cerebellum er fjernet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Arter | hvirvler fastgjort | anvendt metode V = ventral, D = dorsal, LA = stort dyr | Samlede | Kommentarer |
| Bære | Nej | V | 2 | |
| Kat | Nej | V | 32 | |
| Kat | Nej | D | 3 | 2 lille nok til at åbne kraniet med en saks, 1 havde med, der blev undersøgt udsætter toppen af kraniet |
| Kat | Ja | V | 11 | |
| Kat | Ja | D | 8 | |
| Ko | Nej | La | 1 | |
| Coyote | Nej | V | 1 | |
| Coyote | Ja | V | 2 | |
| Coyote | Ja | D | 3 | |
| Hjorte | Nej | La | 1 | |
| Hund | Nej | V | 19 | |
| Hund | Nej | D | 3 | |
| Hund | Ja | V | 2 | 1 var lille hund |
| Hund | Ja | D | 18 | |
| Opspore | Nej | V | 1 | |
| Fisher | Nej | V | 1 | |
| flyvende egern | Ja | D | 1 | hele kroppen |
| grå ræv | Nej | V | 2 | |
| grå ræv | Ja | V | 4 | |
| Gris | Ja | V | 1 | |
| Porcupine | Nej | V | 1 | |
| Vaskebjørn | Nej | V | 16 | |
| Vaskebjørn | Nej | D | 1 | Frosne |
| Vaskebjørn | Ja | V | 26 | |
| rød ræv | Nej | V | 2 | |
| Skunk | Nej | V | 1 | |
| Skunk | Ja | V | 3 | |
| Egern | Nej | V | 1 | |
| Egern | Ja | D | 1 | fuld krop, knust kranium, brugt saks til at skære væk hud til udsatte hjerne hulen |
| weasle | Nej | D | 1 | |
| Woodchuck | Ja | D | 1 | hele kroppen |
| Samlede | 170 | |||
| Fordeling af de samlede | ||||
| med nakke | 81 | |||
| ingen nakke | 89 | |||
| ventrale metode | 128 | |||
| dorsale metode | 39 | |||
| stor animalsk metode | 2 | |||
| anden metode | 1 | |||
| ventrale metode med hals | 49 |
Tabel 1: opdeling af prøver, der kræver vævs fjernelse fra kraniet indsendt fra januar 31, 2019 gennem februar 28, 2019 på New York State Department of Health rabies laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prøver indsendt til rabies nekropsy har ofte en anamnese med kliniske tegn, der er kompatible med en neurologisk sygdom. Tilstedeværelsen af klinisk sygdom kan være forbundet med en række forskellige lidelser, herunder zoonotiske sygdomme, øge risikoen for personale i et laboratorium erhvervet infektion. For at reducere disse risici, teknikker er blevet implementeret, at mindske håndteringen og manipulation af prøver.
De viste metoder repræsenterer en nekropsy begivenhed for at fjerne ønskede væv fra et enkelt dyr alene. Mere almindeligt flere eksemplarer behandles i et skift og pleje er nødvendig for at sikre ingen krydskontaminering mellem prøver. En ren arbejdsflade (engangs kraftpapir eller-puder), et nyt sæt af rene, desinficeres instrumenter og handske ændringer er obligatoriske. Når vævet er opnået, kan det enkelte laboratoriums protokol til behandling følges, herunder fremstilling af lysbilleder til mikroskopi eller RNA-ekstraktion for molekylære metoder.
Der er flere væsentlige forudsætninger for en vellykket gennemførelse af disse teknikker i laboratoriet eller marken. Tidligere rabiesvaccination og PPE er afgørende for enhver nekropsying en rabies mistænkte dyr. Personer, der arbejder i rabies laboratorier bør have deres serum testet hver sjette måned for at sikre et tilstrækkeligt niveau af anti-rabies antistoffer er til stede10. Det er vigtigt at huske på, at andre zoonotiske sygdomme, såsom eeev, wnv og bovin spongiform encephalopati (BSE), frembyder lignende tegn som rabies og kan også forekomme hos rabies mistænkte dyr11,12.
Passende velholdte instrumenter er afgørende for sikker udførelse af nekropsy. Når en prøve er blevet fjernet fra sin Biohazard taske, bør den kun manipuleres med instrumenter, ikke hænder, for at mindske risikoen for ulykker. Før små dyr nekropsy, skal teknikeren evaluere tilstanden af prøven for at afgøre, om en foretrukken ventrale tilgang gennem bunden af kraniet er muligt. Med store dyr kan det være for besværligt at fuldt ud evaluere tilstanden af præparatet som yderligere ryghvirvler kan være nødvendigt at blive fjernet, før du henter væv gennem foramen magnum.
Begrænsninger præsenterer sig selv i alle nekropsy teknikker, herunder prøvetilstand, vævs kvalitet og mængden af resterende cervikale hvirvler. Den cervikale hvirvler vil ikke påvirke resultaterne af rabies analyse, men alvorligt nedbrydes væv kan resultere i utilfredsstillende resultater. Mere følsomme molekylære metoder i rabies diagnostik kan tillade vellykket testning i visse prøver, der ikke kan testes ved direkte fluorescerende antistof assay (DFA), herunder alvorligt deformerede prøver13. Men, ingen mængde af følsomhed kan erstatte behovet for korrekt vævs prøvetagning.
Et fælles problem i rabies laboratoriet modtager upassende eller utilstrækkeligt hjernevæv til testning, når der udføres store dyre nekropsier i marken. Uden det krævede væv, og hvis yderligere væv er utilgængelige for genindsendelse, vores rabies laboratorium vil udføre testning på væv til rådighed, men er i stand til at kontrollere den model negative, i stedet er det utilfredsstillende for testning. Der er andre offentliggjorte metoder til felt vævs samlinger såsom halm metoden eller retro-orbital rute14. Begge metoder indsamle hjernevæv uden at det er nødvendigt at åbne kraniet. En halm eller engangs pipette indsættes enten gennem foramen magnum eller et hul oprettet i øjenhulen og skubbet gennem hjernen, hovedsagelig tager en kerne prøve og ikke nødvendigvis prøveudtagning af hele tværsnit af hjernen stammen. Da disse felt metoder ikke indsamler prøver på en måde, der kan anses for tilfredsstillende til testning i vores laboratorium, er disse processer ikke påvist eller udforsket i dette papir.
I marken store dyr nekropsy kan være udfordrende for personer, der ikke er uddannet til at fjerne den korrekte væv til rabies test. I stedet for hele dyrets hoved, som kan veje mellem 20-45 kg, er fremlagt at skabe tung transport for både marken dyrlæge og rabies laboratorium teknikere. Hyppige anmodninger om uddannelse på store dyr nekropsy teknik er blevet foretaget til vores laboratorium. Formålet med dette manuskript er at distribuere disse oplysninger til enkeltpersoner og grupper, hvis arbejde kan drage fordel af disse teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for New York State Department of Health Wadsworth Center for at støtte dette projekt. Vi vil også gerne anerkende støtten fra Amy Willsey og Frank Blaisdell fra Department of Health Wadsworth Center, og LL Ranch, Altamont, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemistry spoon | Any | ||
| Curved, sharp-blunt mayo scissors | Sklar | 14-2055 | Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt |
| Large sharp restaurant-quality carving knife | Dexter | P94848 | 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Locking tumor-tenacula | Diamond Scientific and Surgicals | N/A | Czerny Tenaculum Forcep |
| Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) | Dexter | P94848 | Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Orthopedic mallet-hammer | Mortech | N/A | Postmortem hammer with hook |
| Sharp councilman orthopedic bone chisel | Shandon | 60-5 | Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in |
| Sharpened tablespoon or other long handled spoon | Any | ||
| Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth | Shandon | 63-03 | Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps |
| Powder-free non-latex gloves | Any | ||
| Safety glasses, goggles, or faceshield | Any | ||
| Surgery or N-95 mask | Any | ||
| Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc | Any |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). West Nile virus activity - United States, 2009. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (25), 769-772 (2010).
- McDaniel, C. J., Cardwell, D. M., Moeller, R. B. Jr, Gray, G. C. Humans and cattle: A review of bovine zoonoses. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 14 (1), 1-19 (2014).
- Spickler, A. R. Zoonotic diseases. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/public-health/zoonoses/zoonotic-diseases (2019).
- Wenner, L., Pauli, U., Summermatter, K., Gantenbein, H., Vidondo, B., Posthaus, H. Aerosol generation during bone-sawing procedures in veterinary autopsies. Veterinary Pathology. 54 (3), 425-436 (2017).
- Green, F. H. Y., Yoshida, K. Characteristics of aerosols generated during autopsy procedures and their potential role as carriers of infectious agents. Applied Occupational and Environmental Hygiene. 5 (12), 853-858 (1990).
- Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. Laboratory techniques in Rabies 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , World Health Organization. 425-427 (1996).
- Ness, S. L., Bain, F. T. How to perform an equine field necropsy. American Association of Equine Practitioners. 55, 313-316 (2009).
- Animal & Plant Health Agency. Sample requirements for TSE testing and confirmation – EURL guidance. , Available from: https://protect2.fireeye.com/url?k=09f00f8d-55d40ec4-09f2f6b8-0cc47aa8d394-3f805f032cc98df8&u=https://science.vla.gov.uk/tse-lab-net/documents/tse-oie-rl-samp.pdf (2019).
- New York State Department of Health, Wadsworth Center. Rabies reports. , Available from: https://www.wadsworth.org/programs/id/rabies/reports (2019).
- CDC. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing: A minimum standard for rabies diagnosis in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Miller, L. D., Davis, A. J., Jenny, A. L., Fekadu, M., Whitfield, S. G. Surveillance for lesions of bovine spongiform encephalopathy in U.S. cattle. Developments in Biological Standardizations. 80, 119-121 (1993).
- Andrews, C., Gerdin, J., Patterson, J., Buckles, E. L., Fitzgerald, S. D. Eastern equine encephalitis in puppies in Michigan and New York states. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 30 (4), 633-636 (2018).
- Appler, K., Brunt, S., Jarvis, J. A., Davis, A. D. Clarifying indeterminate results on the rabies direct fluorescent antibody test using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Public Health Reports. 134 (1), 57-62 (2019).
- Chapter 7. Brain removal. Laboratory techniques in Rabies 5th Edition. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. , World Health Organization. 67-72 (2018).
