Summary
Целью этого протокола является демонстрация безопасных методов некропсии у мелких и крупных животных для получения удовлетворительных образцов тканей для тестирования на бешенство.
Abstract
Лаборатория по борьбе с бешенством штата Нью-йорк (NYSDOH) ежегодно получает от 6000 до 9000 образцов и проводит тестирование на бешенство для всего штата, за исключением Нью-йорка. Лаборатория бешенства некропсии различных животных, начиная от летучих мышей до bovids. Большинство из этих образцов животных, демонстрирующих неврологические признаки, однако, менее 10% на самом деле положительный результат теста на бешенство; подразумевая травмы, поражения или других инфекционных агентов в качестве причины этих симптомов. Из-за риска аэрозольных недиагностированных инфекционных агентов, Лаборатория бешенства не использует электроинструменты или пилы. Для животных, чьи черепа непроницаемы ножницами, будут представлены три методы некропсии. Лаборатория внедрила эти методы для уменьшения потенциального воздействия инфекционных агентов, устранения ненужных манипуляций с образцом и сокращения времени обработки. Преимущества предпочтительной техники, противоположной другой, зависят от обученной индивидуальной обработки образца.
Introduction
Работа на полу некропсии в лаборатории бешенства по своей сути опасна. Временами, образцы прибывают со встроенными иголками дикобраза, посторонними предметами, включая стрелы/пули/гранулы или открытые костные осколки, которые могут проникать в защитную обертку для доставки. Неправильная упаковка может привести к утечке, подвергая опасности людей, которые распаковывают образцы. В дополнение к физическим травмам, специалисты по некропсии рискуют подвергаться воздействию неизвестных зоонозных инфекционных агентов из ЦНС и жидкостей организма образцов. Кроме того, эктопаразиты, переносимые образцом, могут передавать другие зоонозные заболевания, так как блохи и клещи обычно встречаются на представленных животных. В зависимости от географического положения и видов, связанных с болезнями подвергаются варьироваться. Арбовирусы, такие как вирус восточного конского энцефалита (EEEV) или вирус Западного Нила (WNV), клещевые заболевания, включая болезнь Лайма или туляремию, бактерии, вызывающие лихорадку или туберкулез, и инфекционные прионы называют небольшое количество возможных опасностей1 , 2 , 3.
Целью этих методов является демонстрация безопасных и эффективных методов некропсии с использованием инструментов, которые сводят к минимуму потенциал для аэрозолизации в отличие от электроинструментов или пил4,5. Как правило, некропсия мелких животных в лаборатории бешенства требует отрезать черепные мышцы и с помощью молотка и стамески, чтобы открыть каудальной царской части кальвария6. Удаление этой области кальвария подвергает задний мозг, в том числе весь мозжечок и черепного ствола мозга. Модифицированные методы некропсии могут быть выполнены на брюшной части черепа, избегая больших мышц черепа и более толстых областей черепа. Однако эти модифицированные методы некропсии возможны только тогда, когда образец без шейных позвонков.
Аналогичным образом, ткани мозга у крупных животных могут быть удалены путем разделения черепных мышц и открытия caudal царской части черепа7. Значительные усилия, необходимые для разоблачения мозжечка и ствола мозга, как черепа крупных животных, как правило, толще. Чтобы не проникать в череп, голова большого животного расположена таким образом, что вентро-каудаальная часть черепа обращена к технику. Используя модифицированные инструменты, мозжечок и ствол мозга удаляются через foramen magnum. Это похоже на метод приобретения образцов, рекомендованный Справочной лабораторией Европейского союза TSE для трансмиссивной спонгиформной энцефалопатии (TSE) исследований8. Черепные позвонки должны быть удалены заранее, чтобы обеспечить доступ к foramen magnum.
Применение этих методов полезно для надлежащим образом обученных техников в лабораториях по борьбе с бешенством. Как бешенство лаборатория получает образцы различных размеров, от несовершеннолетних летучих мышей для взрослых лошадей проекта9, техник имеет несколько методов на выбор на основе индивидуальных обстоятельств. Метод, продемонстрированный для большого животного, также подходит для ветеринаров, которые выполняют некропсии в полевых условиях, так как доставка всей большой головке животного для тестирования на бешенство является громоздким и дорогостоящим. Внедрение любого из этих методов повысит безопасность за счет уменьшения потенциала производства аэрозолей, сокращения обработки образца и экономии времени на обработку. Однако, поскольку поле не имеет тех же преимуществ, что и лабораторное оборудование для тестирования на бешенство, важно, чтобы любые изменения, внесенные в эти процедуры, были направлены на безопасность, особенно на использование средств индивидуальной защиты (СИЗ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные методы были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра Уодсворта (IACUC).
1. Подготовка
- Дон СИЗ, при минимальной защите глаз (очки или лицезащитный щит), хирургическая или N-95 маска, и нелатексные перчатки.
- Подготовка рабочей области, в идеале био-безопасности шкаф (BSC), с одноразовым покрытием поверхности работы (например, крафт бумаги или абсорбирующими прокладками) и чистых инструментов некропсии(рисунок 1).
- Поместите образец на рабочую поверхность и используйте приборы для его оценки состояния образца, включая доказательства разложения, повреждения черепа, потенциальных опасностей (например, дикобразные иглы, скальпельные лезвия) и качество обезглавливания.
2. Метод Вентрала
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда образец должным образом обезглавлен на челюсти линии, foramen магнум и затылочной кондиле будет подвергаться. Вентральный метод менее сложен для извлечения мозжечка и ствола мозга.
- Расположите образец с брюшной стороной вверх и носом направляя distally к задней части BSC.
- Держите ортопедический молоток/молоток в правой руке (если правша) и в то же самое время держите долото членов совета в левой руке.
- Расположите стамески под углом 45 градусов с угловой точкой стамески, направляющей между правой стороной височной кости и затылочной костью, что делает отверстие "V".
- Удар верхней части долото с молотком, пока две кости отдельно. Сделайте разрез рядом с основойфеноидной кости.
- Повторите на левой стороне височной кости / затылочной кости(рисунок 2A).
- Согните область черепа "V" вниз с долотом. Разоблачить всю ромбенцефалон области мозга (мозжечок и ствол мозга)(рисунок 2B).
- Scoop из ствола мозга и мозжечка с ножницами и щипцы. Удалите все оставшиеся части из черепа, если ствол мозга и мозжечок не вышли в единой части.
3. Дорсальный метод
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец имеет плохое обезглавливание (foramen magnum не видно) и шея не может быть легко удалена во время некропсии или если повреждение мозжечка подозревается, следует использовать метод доза.
- Позиция образца дорсально с носом направляя дистально к задней части BSC.
- Используя опухолевую тетакулу, схватите левую височную мышцу зубами тенакулы и зафиксируйте, сжимая ручку.
- Разрежьте височной мышцы до кости острым резным ножом.
- Поверните образец на 180 градусов с помощью тенакулы и ножа (не руки) и повторите процесс на противоположной височной мышце. Разоблачить череп.
- Позиция долото под углом 45 "с угловой точкой долото на центре черепа на стыке теменной и интрафариетной кости.
- Удар верхней части долото с молотком, пока горизонтальное отверстие производится на верхней половине черепа на теменной кости.
- Поверните образец на 180 градусов и повторите процесс на противоположной стороне.
- Вставьте точку долото в конце разреза 1(рисунок 3A)и на 90 "горизонтального отверстия. Забастовка молотком до тех пор, пока отверстие не достигнет затылочной кости (примерно 10 см в зависимости от размера образца).
- Сверните образец и повторите на противоположной стороне в конце разреза 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: С образцом спинной и нос расположен в сторону задней части BSC, отверстия в черепе напоминают перевернутый "U". - Вставьте зубы тенакулы в череп на дне "U" и подглядывать к себе. Выставить каудальный конец мозга и мозжечка(рисунок 3B).
- Используйте ножницы в качестве совок и вырвать весь мозжечок из нутри.
- Используйте щипцы ткани, чтобы дразнить из мозга вытекают из предыхла.
4. Большой метод животного
- Расположите образец так, чтобы дорнятельная часть черепа соприкасалсяа с поверхностью некропсии с каудальной частью черепа и форамином магнумом, обращенным к технику.
- Вставьте модифицированный нож стилет в foramen magnum между спинным мозгом и спинного мозга, насколько это возможно.
- Оценка вокруг спинного мозга, чтобы отделить мозжечок и мозг вытекают из спинного обезличения. После того, как нож вставляется через foramen magnum, осторожно угол нож следовать вдоль черепа как можно больше.
- Вставьте шпатель химии или тонкую, длинную ложку в пространство между нервной ткани и спинного обезвреживания.
- Зонд вокруг спинного мозга и мозжечка, чтобы обеспечить связь с спинной обезлищ, были разорваны.
- Держите ствол мозга с помощью щипц. С другой стороны, заранее ложку rostrally затем дорсально зачерпнуть мозжечок. Одновременно отойти на ствол мозга с щипками и вычерпывать мозжечок с помощью ложки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять более одной попытки восстановить адекватный мозжечок для тестирования на бешенство.
5. Пост некропсия
- Утилизировать все одноразовые материалы (перчатки, прокладки, покрытия рабочей зоны) и неиспользованные ткани в биоопасных отходах.
- Чистота и дезинфекция всех инструментов с помощью доступных методов (например, промышленная посудомоечной ублюдок, автоклав, химический дезинфицирующее средство, кипячение).
- Чистота и дезинфекция всех рабочих поверхностей с 20% отбеливателя и / или 70% этанола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все наземные образцы, представленные с черепами в период с 31 января 2019 года по 28 февраля 2019 года, имели информацию о наличии шеи и методе собираемого некропсии. За это время, 170 голов были некропсии с 18 видов представлены. 52% (89/170) были должным образом обезглавлены. Остальные имели по крайней мере один позвонок прилагается в том числе три всего тела образцов. Вентральный метод был использован 75% (128/170) времени, из них, шеи присутствовали на 49. Specimens, представленные с шеей будет иметь его удалить во время некропсии, чтобы позволить брюшной метод, когда это возможно. Были представлены три крупных животных (корова, олень, свинья), и в двух случаях был использован большой протокол животного. Большой протокол животного не был использован на свинье, потому что дополнительные образцы тканей мозга были необходимы для дополнительного тестирования. Белка была представлена с дробленым черепом и просто отрезать кожу подвергаются ткани мозга, таким образом, ни один из вышеперечисленных методов были использованы (Таблица 1).
На свежих нетронутых представлений, все три метода приведет к необходимой ткани для надежных результатов диагностики бешенства. Иногда мозжечок и ствол мозга не могут быть удалены нетронутыми, хотя после удаления всех тканей из заднего мозга эти ткани могут быть определены и обработаны соответствующим образом.
Эти три ценных метода не могут компенсировать низкое качество образцов, вызванное до получения в лаборатории. Травма, разложение и плохие методы обезглавливания могут повлиять на результат независимо от того, насколько эффективно собираются образцы.
Рисунок 1: Инструменты, используемые при некропсии бешенства. Изогнутые остротупичные ножницы майонеза, гладкие наконечником ткани одевания щипцы без зубов, советник ортопедический долото кости, ортопедический молоток, блокировка опухоли-tenacula, ресторан качества резьба нож, модифицированный нож стилет, химия ложка, и заточенная столовая ложка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Вентральный метод некропсии. (A) Расположение разрезов: Место точки долото у основания стрелки, вырезать в направлении зеленой стрелки и повторить следующие желтая стрелка формирования "V" вокруг foramen magnum. Pry "V" вниз, чтобы разоблачить ствол мозга и мозжечок. (B) Ствол мозга (зеленый) и мозжечок (синий) при воздействии с помощью брюшного метода некропсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дорсальный метод некропсии. (A) Расположение разрезов: Место точки долото у основания стрелки и сократить в направлении стрелки в порядке отметил формирования "U". Pry "U" вниз, чтобы разоблачить мозжечок с стволом мозга под ним. (B) Церебеллум (обведенный) при обнажек с помощью метода доза. Ствол мозга лежит прямо под и не виден до тех пор, пока мозжечок не будет удален. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Видов | позвонки прилагается | метод, используемый Вевентрал, Дюдорсал, ЛАЗ-большое животное | Общая | Комментарии |
| Медведь | Нет | V | 2 | |
| Кошка | Нет | V | 32 год | |
| Кошка | Нет | D | 3 | 2 достаточно малы, чтобы открыть череп ножницами, 1 была abcess, что в настоящее время расследуется подвергая верхней части черепа |
| Кошка | Да | V | 11 Год | |
| Кошка | Да | D | 8 | |
| Корова | Нет | La | 1 | |
| Койот | Нет | V | 1 | |
| Койот | Да | V | 2 | |
| Койот | Да | D | 3 | |
| Олень | Нет | La | 1 | |
| Собака | Нет | V | 19 лет | |
| Собака | Нет | D | 3 | |
| Собака | Да | V | 2 | 1 была маленькая собака |
| Собака | Да | D | 18 лет | |
| Ферре | Нет | V | 1 | |
| Фишер | Нет | V | 1 | |
| летающая белка | Да | D | 1 | все тело |
| серая лиса | Нет | V | 2 | |
| серая лиса | Да | V | 4 | |
| Свинья | Да | V | 1 | |
| Дикобраз | Нет | V | 1 | |
| Енот | Нет | V | 16 Год | |
| Енот | Нет | D | 1 | Замороженные |
| Енот | Да | V | 26 | |
| красная лиса | Нет | V | 2 | |
| Скунс | Нет | V | 1 | |
| Скунс | Да | V | 3 | |
| Белка | Нет | V | 1 | |
| Белка | Да | D | 1 | полное тело, дробленый череп, использовали ножницы, чтобы отрезать кожу, чтобы подвергаться полости мозга |
| протье | Нет | D | 1 | |
| Сурка | Да | D | 1 | все тело |
| Общая | 170 г. | |||
| Разбивка общего числа | ||||
| с шеей | 81 год | |||
| нет шеи | 89 | |||
| вентральный метод | 128 г. | |||
| дорсальный метод | 39 | |||
| большой метод животных | 2 | |||
| другой метод | 1 | |||
| вентральный метод с шеей | 49 |
Таблица 1: Разбивка образцов, требующих удаления тканей из черепа, представленных с 31 января 2019 года по 28 февраля 2019 года в Лаборатории по борьбе с бешенством Департамента здравоохранения штата Нью-йорк.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Specimens, представленные для некропсии бешенства часто имеют историю клинических признаков, совместимых с неврологическим заболеванием. Наличие клинических заболеваний может быть связано с различными нарушениями, в том числе зоонозными заболеваниями, повышая риск для сотрудников лаборатории приобретенной инфекции. Чтобы уменьшить эти риски, были внедрены методы, которые уменьшают обработку и манипуляции образцами.
Продемонстрированные методы представляют собой событие некропсии для удаления желаемых тканей только из одного животного. Чаще всего несколько образцов обрабатываются в смену и уход необходим для обеспечения не перекрестного загрязнения между образцами. Чистая рабочая поверхность (одноразовая крафтовая бумага или прокладки), новый набор чистых, дезинфицированных инструментов и изменения перчаток являются обязательными. После получения тканей можно следовать протоколу индивидуальной лаборатории по обработке, включая изготовление слайдов для микроскопии или извлечения РНК для молекулярных методов.
Существует несколько необходимых предпосылок для успешного внедрения этих методов в лаборатории или на местах. Предварительная вакцинация против бешенства и СИЗ имеют решающее значение для тех, кто некропсии бешенства подозреваемого животного. Лица, работающие в лабораториях бешенства должны иметь свои сыворотки испытания каждые шесть месяцев, чтобы обеспечить адекватный уровень антител борьбы с бешенством присутствуют10. Важно помнить, что другие зоонозные заболевания, такие как EEEV, WNV и Bovine Spongiform энцефалопатии (BSE), присутствуют аналогичные признаки, как бешенство, а также может возникнуть у бешенства подозреваемых животных11,12.
Соответствующие ухоженные инструменты необходимы для безопасного выполнения некропсии. После того, как образец был удален из своего биоопасного мешка, им следует манипулировать только инструментами, а не руками, чтобы уменьшить вероятность несчастных случаев. Перед небольшой некропсией животных, техник должен оценить состояние образца, чтобы определить, является ли предпочтительным вентральный подход через основание черепа возможно. С крупными животными это может быть слишком громоздким, чтобы в полной мере оценить состояние образца, как дополнительные позвонки, возможно, потребуется удалить до извлечения ткани через foramen magnum.
Ограничения представлены во всех методах некропсии, включая состояние образца, качество тканей и количество оставшихся шейных позвонков. Шейные позвонки не повлияют на результаты анализа бешенства, но сильно разложившиеся ткани могут привести к неудовлетворительным результатам. Более чувствительные молекулярные методы в диагностике бешенства могут позволить успешное тестирование в некоторых образцах, которые не могут быть проверены прямым анализом флуоресцентных антител (DFA), включая сильно разложившиеся образцы13. Тем не менее, никакое количество чувствительности не может заменить необходимость надлежащего отбора проб тканей.
Распространенной проблемой в лаборатории бешенства является получение неадекватных или неадекватных тканей головного мозга для тестирования, когда крупные некропсии животных выполняются в поле. Без необходимых тканей, и если дополнительные ткани недоступны для повторного представления, наша лаборатория бешенства будет выполнять тестирование на ткани доступны, но не в состоянии проверить отрицательный образец, вместо этого это неудовлетворительно для тестирования. Есть и другие опубликованные методы для полевых тканей коллекции, такие как метод соломы или ретро орбитальный маршрут14. Оба метода собирают ткани мозга без необходимости открывать череп. Солома или одноразовые пипетки вставляется либо через отверстия магнум или отверстие, созданное в глазнице и толкнул через мозг, по существу, принимая образец ядра и не обязательно выборки полного сечения ствола мозга. Поскольку эти полевых методы не собирают образцы таким образом, чтобы считаться удовлетворительными для тестирования в нашей лаборатории, эти процессы не демонстрируются или изучены в настоящем документе.
В поле большая некропсия животных может быть сложной задачей для людей, которые не обучены, чтобы удалить правильную ткань для тестирования на бешенство. Вместо этого вся головка животного, которая может весить от 20-45 кг, представляет собой создание громоздкого транспорта как для полевых ветеринаров и бешенства лаборантов. В нашу лабораторию поступали частые запросы на обучение по технике крупной животной некропсии. Цель этой рукописи заключается в распространении этой информации среди отдельных лиц и групп, чья работа может извлечь выгоду из этих методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признательны Центру Уодсвортского департамента здравоохранения штата Нью-йорк за поддержку этого проекта. Мы также хотели бы отметить поддержку Эми Уиллси и Фрэнк Айсделл Департамента здравоохранения Уодсворт центр, и LL ранчо, Altamont, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemistry spoon | Any | ||
| Curved, sharp-blunt mayo scissors | Sklar | 14-2055 | Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt |
| Large sharp restaurant-quality carving knife | Dexter | P94848 | 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Locking tumor-tenacula | Diamond Scientific and Surgicals | N/A | Czerny Tenaculum Forcep |
| Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) | Dexter | P94848 | Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Orthopedic mallet-hammer | Mortech | N/A | Postmortem hammer with hook |
| Sharp councilman orthopedic bone chisel | Shandon | 60-5 | Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in |
| Sharpened tablespoon or other long handled spoon | Any | ||
| Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth | Shandon | 63-03 | Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps |
| Powder-free non-latex gloves | Any | ||
| Safety glasses, goggles, or faceshield | Any | ||
| Surgery or N-95 mask | Any | ||
| Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc | Any |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). West Nile virus activity - United States, 2009. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (25), 769-772 (2010).
- McDaniel, C. J., Cardwell, D. M., Moeller, R. B. Jr, Gray, G. C. Humans and cattle: A review of bovine zoonoses. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 14 (1), 1-19 (2014).
- Spickler, A. R. Zoonotic diseases. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/public-health/zoonoses/zoonotic-diseases (2019).
- Wenner, L., Pauli, U., Summermatter, K., Gantenbein, H., Vidondo, B., Posthaus, H. Aerosol generation during bone-sawing procedures in veterinary autopsies. Veterinary Pathology. 54 (3), 425-436 (2017).
- Green, F. H. Y., Yoshida, K. Characteristics of aerosols generated during autopsy procedures and their potential role as carriers of infectious agents. Applied Occupational and Environmental Hygiene. 5 (12), 853-858 (1990).
- Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. Laboratory techniques in Rabies 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , World Health Organization. 425-427 (1996).
- Ness, S. L., Bain, F. T. How to perform an equine field necropsy. American Association of Equine Practitioners. 55, 313-316 (2009).
- Animal & Plant Health Agency. Sample requirements for TSE testing and confirmation – EURL guidance. , Available from: https://protect2.fireeye.com/url?k=09f00f8d-55d40ec4-09f2f6b8-0cc47aa8d394-3f805f032cc98df8&u=https://science.vla.gov.uk/tse-lab-net/documents/tse-oie-rl-samp.pdf (2019).
- New York State Department of Health, Wadsworth Center. Rabies reports. , Available from: https://www.wadsworth.org/programs/id/rabies/reports (2019).
- CDC. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing: A minimum standard for rabies diagnosis in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Miller, L. D., Davis, A. J., Jenny, A. L., Fekadu, M., Whitfield, S. G. Surveillance for lesions of bovine spongiform encephalopathy in U.S. cattle. Developments in Biological Standardizations. 80, 119-121 (1993).
- Andrews, C., Gerdin, J., Patterson, J., Buckles, E. L., Fitzgerald, S. D. Eastern equine encephalitis in puppies in Michigan and New York states. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 30 (4), 633-636 (2018).
- Appler, K., Brunt, S., Jarvis, J. A., Davis, A. D. Clarifying indeterminate results on the rabies direct fluorescent antibody test using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Public Health Reports. 134 (1), 57-62 (2019).
- Chapter 7. Brain removal. Laboratory techniques in Rabies 5th Edition. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. , World Health Organization. 67-72 (2018).
