Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera säkra obduktions tekniker i små och stora djur för att erhålla tillfredsställande vävnadsprover för rabiestest.
Abstract
New York State Department of Health (NYSDOH) rabies laboratorium får mellan 6 000 till 9 000 exemplar årligen och utför rabies testning för hela staten, med undantag för New York City. Den rabies laboratorium obduktion en omväxling av djuren strövande i storlek från fladdermöss till bovids. De flesta av dessa prover är djur uppvisar neurologiska tecken, dock mindre än 10% faktiskt test positivt för rabies; innebär trauma, lesioner eller andra smittämnen som orsaken till dessa symtom. På grund av risken för aerosolizing odiagnostiserade smittämnen, använder rabies laboratoriet inte elverktyg eller sågar. Tre obduktion tekniker kommer att presenteras för djur vars skallar är ogenomträngliga med sax. Laboratoriet har genomfört dessa tekniker för att minska potentiell exponering för smittämnen, eliminera onödig manipulation av preparatet och minska handläggningstiden. Fördelarna med en föredragen teknik som motsätter sig en annan är föremål för den utbildade individen som bearbetar preparatet.
Introduction
Att arbeta på obduktion golvet i en rabies laboratorium är till sin natur farlig. Ibland, prover anländer med inbäddade Porcupine Quills, främmande föremål inklusive pilar/kulor/pellets eller exponerade ben Shards som kan penetrera skyddande frakt wrap. Felaktig paketering kan resultera i läckage, utsätta individer som packar upp prover. Förutom fysisk skada, nekropsy tekniker riskexponering för okända zoonotiska smittämnen från CNS och kroppsvätskor av proverna. Dessutom kan ektoparasiter som transporteras av preparatet överföra andra zoonotiska sjukdomar, eftersom loppor och fästingar ofta ses på inlämnade djur. Beroende på geografisk plats och art inblandade de sjukdomar som exponeras varierar. Arbovirus såsom Eastern Equine encefalit virus (eeev) eller West Nile virus (wNv), fästingburna sjukdomar inklusive Borrelia eller tularemia, bakterier som orsakar Q feber eller tuberkulos, och infektiösa prioner namnge ett litet antal av de möjliga farorna1 , 2 , 3.
Syftet med dessa metoder är att demonstrera säkra och effektiva nekropsy tekniker med hjälp av instrument som minimerar potentialen för aerosolisering till skillnad från elverktyg eller sågar4,5. Vanligen, nekropsy av små djur i rabies laboratoriet kräver skära bort kranial muskler och med hjälp av en hammare och mejsel att öppna kaudala rygg del av calvarium6. Ta bort detta område av calvarium exponerar Hind hjärnan, inklusive hela lillhjärnan och kranial hjärnstammen. Modifierade nekropsy tekniker kan utföras på den ventrala delen av skallen, undvika de stora kranialmuskler och tjockare områden i skallen. Emellertid, dessa modifierade nekropsy tekniker är endast möjligt när preparatet är utan livmoderhalscancer Kotor.
Likaså kan hjärnvävnad hos stora djur avlägsnas genom att separera kranialmusklerna och öppna den kaudala ryggdelen av skallen7. Stora ansträngningar krävs för att exponera lillhjärnan och hjärnstammen som skallar av större djur är i allmänhet tjockare. För att undvika att tränga igenom skallen, är huvudet av ett stort djur placerad så Ventro-kaudala delen av skallen står inför teknikern. Med hjälp av modifierade instrument, lillhjärnan och hjärnstammen avlägsnas genom foramen magnum. Detta liknar den urvalsmetod som rekommenderas av TSE-Europeiska unionens referenslaboratorium för undersökningar av transmissibel spongiform encefalopati (TSE)8. Kraniala Kotor bör avlägsnas i förväg för att ge tillgång till foramen magnum.
Tillämpning av dessa tekniker är fördelaktigt för lämpligt utbildade tekniker i rabies laboratorier. Som rabies laboratoriet mottar proverna av olika storleken, från ung fladdermöss till vuxen förslagen häst9, teknikern har flera metoderna till välja från baserat på den individuell omständighet. Metoden som demonstreras för ett stort djur är också lämplig för veterinärer som utför obduktioner på området, eftersom sjöfarten ett helt stort djur huvud för rabies testning är besvärligt och kostsamt. Att implementera någon av dessa tekniker kommer att förbättra säkerheten genom att minska potentialen för aerosol produktion, reducera hanteringen av preparatet och spara handläggningstiden. Eftersom området inte har samma fördelar som ett laboratorium som inrättats specifikt för rabiestestning, är det dock viktigt att alla ändringar som görs i dessa förfaranden inriktas på säkerhet, särskilt användningen av personlig skyddsutrustning (PPE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs godkändes av Wadsworth Center institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. förberedelser
- Don PPE, vid minsta öga skydd (glasögon eller ansikte sköld), kirurgisk eller N-95 mask, och icke-latex handskar.
- Förbered arbetsområdet, helst ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC), med en disponibel arbetsyta beläggning (t. ex. kraftpapper eller absorberande kuddar) och rena obduktion instrument (figur 1).
- Placera preparatet på arbetsytan och Använd instrument för att manipulera det för att bedöma tillståndet hos provet, inklusive bevis på nedbrytning, skador på skalle, potentiella faror (t. ex. Porcupine Quills, skalpell blad) och kvaliteten på halshuggning.
2. ventrala metoden
Anmärkning: När preparatet är ordentligt halshugga på käklinjen, foramen magnum och occipital Condyle kommer att exponeras. Den ventrala metoden är mindre komplicerat för att hämta lillhjärnan och hjärnstammen.
- Placera preparatet med ventrala sida upp och näsan styra distalt mot baksidan av BSC.
- Håll en ortopedisk hammare/klubba i höger hand (om högerhänt) och samtidigt hålla en stadsfullmäktigar mejsel i vänster hand.
- Placera mejseln på en 45 ° vinkel med hörnpunkten av mejseln styra mellan höger sida av tinning ben och occipital ben gör en "V" öppning.
- Slå toppen av mejseln med hammaren tills de två benen separat. Gör snittet till intill basisphenoid benet.
- Upprepa på vänster sida av tinning ben/occipital ben (figur 2A).
- Böj "V" området av skalle nedåt med mejseln. Exponera hela rhombencephalon området i hjärnan (cerebellum och hjärnstammen) (figur 2b).
- Scoop ut hjärnstammen och lillhjärnan med sax och pinps. Ta bort eventuella kvarvarande delar från skallen om hjärnstammen och lillhjärnan inte kom ut i ett enda stycke.
3. dorsala metod
Anmärkning: om preparatet har en dålig halshuggning (foramen magnum inte synlig) och halsen kan inte lätt avlägsnas under nekropsy eller om skador på lillhjärnan misstänks, den dorsala metoden bör utnyttjas.
- Placera preparatet dorsalt med näsan styra distalt mot bak i BSC.
- Med hjälp av tumör tenacula, ta tag i vänster temporala muskler med tänder av tenacula och lås genom att klämma handtaget.
- Skär temporala muskler ner till ben med skarp carving kniv.
- Rotera preparatet 180 ° med tenacula och kniv (inte hand) och upprepa processen på motsatt temporala muskeln. Exponera skallen.
- Placera en mejsel på en 45 ° vinkel med hörnpunkten av mejseln på mitten av skallen vid tidpunkten för parietala och intraparietal benet.
- Slå toppen av mejseln med en hammare tills en horisontell öppning görs på den övre halvan av skallen vid parietalbenet.
- Rotera preparatet 180 ° och upprepa processen på motsatt sida.
- För in punkten på mejseln i slutet av cut 1 (figur 3a) och vid 90 ° av horisontell öppning. Slag med hammaren tills öppningen når occipital ben (cirka 10 cm beroende på storlek av preparatet).
- Rulla preparatet och upprepa på motsatt sida i slutet av cut 2.
Anmärkning: med preparat rygg och näsa placerad mot baksidan av BSC, öppningar i skallen likna en upp och ner "U". - Sätt tänderna i tenacula i skallen på botten av "U" och bända mot sig själv. Exponera den kaudala änden av storhjärnan och lillhjärnan (figur 3b).
- Använd saxar som en skopa och bäna ut hela lillhjärnan inifrån håligheten.
- Använd vävnad pincett att locka ut hjärnan stammen från foramen.
4. stor djur metod
- Placera preparatet så att den dorsala delen av skallen är i kontakt med nekropsy ytan med den kaudala delen av skallen och foramen magnum vänd mot teknikern.
- Sätt den modifierade Stiletto kniven i foramen magnum i mellan ryggmärgen och spinal hjärnhinnorna så långt som möjligt.
- Poäng runt ryggmärgen för att separera lillhjärnan och hjärnstammen från spinal hjärnhinnorna. Efter att kniven satts in genom foramen magnum, vinkel försiktigt kniven att följa längs skallen så mycket som möjligt.
- Sätt en kemi spatel eller tunna, länge hanteras sked i utrymmet mellan neurala vävnad och spinal hjärnhinnorna.
- Sond runt ryggmärgen och lillhjärnan för att säkerställa anslutningen till spinal hjärnhinnorna har avbrutit.
- Håll hjärnstammen med tång. Med den andra handen, förväg sked rostrally sedan dorsalt att skopa upp lillhjärnan. Samtidigt dra tillbaka på hjärnstammen med tång och skopa ut lillhjärnan med sked.
Obs: det kan ta mer än ett försök att återvinna adekvat lillhjärnan för rabies testning.
5. post obduktion
- Kassera alla engångsmaterial (handskar, kuddar, arbetsplats beläggningar) och oanvända vävnader i biologiskt farligt avfall.
- Rengör och desinficera alla instrument med tillgänglig metod (t. ex. industri diskmaskin, autoklav, kemiskt desinfektionsmedel, kokning).
- Rengör och desinficera alla arbetsytor med 20% blekmedel och/eller 70% etanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla markbundna prover som lämnats in med dödskallar mellan 31 januari 2019 och 28 februari, 2019 hade information om närvaron av en hals och metoden för nekropsy samlas in. Under den tiden var 170 huvuden obduceras med 18 arter representerade. 52% (89/170) var ordentligt halshugga. De resterande hade åtminstone en kotan fäst inklusive tre hela kropps prov. Den ventrala metoden användes 75% (128/170) av tiden, av dessa, halsar var närvarande på 49. Prover som lämnats in med en hals kommer att ha det bort under nekropsy att möjliggöra den ventrala metoden när det är möjligt. Tre stora djur (ko, hjortar, Pig) lämnades in, och i två fall användes det stora djura protokollet. Det stora djur protokollet användes inte på grisen eftersom extra hjärn vävnadprover krävdes för ytterligare tester. En ekorre lämnades in med en krossad skalle och helt enkelt skära bort huden exponerade hjärnvävnad, alltså ingen av ovanstående metoder användes (tabell 1).
På färska intakta inlagor, alla tre metoder kommer att resultera med den erforderliga vävnaden för tillförlitliga rabies diagnostiska testresultat. Ibland, lillhjärnan och hjärnstammen kan inte avlägsnas intakt, men efter avlägsnande av all vävnad från bakhjärnan dessa vävnader kan identifieras och bearbetas därefter.
Dessa tre värdefulla metoder kan inte kompensera för dålig prov kvalitet orsakat före mottagandet på labbet. Trauma, nedbrytning och dålig halshuggning metoder kan påverka resultatet oavsett hur effektivt proverna samlas in.
Figur 1: instrument som används för Necropsy av rabies. Böjda skarpa-trubbiga Mayo sax, slät tipped vävnad dressing pinpett utan tänder, councilman ortopediska ben mejsel, ortopediska klubba-hammare, låsning tumör-tenacula, restaurang-kvalitet carving kniv, modifierad Stiletto kniv, kemi sked, och vass matsked. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ventrala metoden för nekropsy. Aplacering av styckningsdelar: plats för en mejsel vid pilens botten, skuren i riktning mot grön pil och upprepa efter den gula pilen som bildar en "V" runt foramen magnum. PRY "V" ner för att avslöja hjärnstammen och cerebellum. (B) hjärnstammen (grön) och lillhjärnan (blå) när de exponeras med hjälp av den ventrala metoden för nekropsy. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: dorsala metoden för obduktion. Aplacering av styckningsdelar: plats för en mejsel vid pilens botten och skuren i pilens riktning i den ordning som anges som en U-punkt. PRY "U" ner för att exponera lillhjärnan med hjärnstammen under den. B) cerebellum (inringad) när det exponeras med hjälp av dorsala metoden. Hjärnstammen ligger direkt under och är inte synlig förrän lillhjärnan avlägsnas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Arter | Kotor bifogade | metod som används V = ventral, D = dorsal, LA = stort djur | Totala | Kommentarer |
| Bära | Nej | V | 2 | |
| Katt | Nej | V | 32 | |
| Katt | Nej | D | 3 | 2 liten nog att öppna skalle med sax, 1 hade Abcess som undersöktes utsätta toppen av skalle |
| Katt | Ja | V | 11 | |
| Katt | Ja | D | 8 | |
| Ko | Nej | La | 1 | |
| Coyote | Nej | V | 1 | |
| Coyote | Ja | V | 2 | |
| Coyote | Ja | D | 3 | |
| Hjortar | Nej | La | 1 | |
| Hund | Nej | V | 19 | |
| Hund | Nej | D | 3 | |
| Hund | Ja | V | 2 | 1 var liten hund |
| Hund | Ja | D | 18 | |
| Ferret | Nej | V | 1 | |
| Fisher | Nej | V | 1 | |
| flygande ekorre | Ja | D | 1 | hela kroppen |
| Gråräv | Nej | V | 2 | |
| Gråräv | Ja | V | 4 | |
| Gris | Ja | V | 1 | |
| Porcupine | Nej | V | 1 | |
| Tvättbjörn | Nej | V | 16 | |
| Tvättbjörn | Nej | D | 1 | Frysta |
| Tvättbjörn | Ja | V | 26 | |
| rödräv | Nej | V | 2 | |
| Skunk | Nej | V | 1 | |
| Skunk | Ja | V | 3 | |
| Ekorre | Nej | V | 1 | |
| Ekorre | Ja | D | 1 | hela kroppen, krossad skalle, används sax för att skära bort huden till exponerad hjärn håla |
| weasle | Nej | D | 1 | |
| murmeldjur | Ja | D | 1 | hela kroppen |
| Totala | 170 | |||
| Uppdelning av total | ||||
| med hals | 81 | |||
| ingen nacke | 89 | |||
| ventrala metoden | 128 | |||
| dorsala metod | 39 | |||
| stor djur metod | 2 | |||
| annan metod | 1 | |||
| ventrala metoden med hals | 49 |
Tabell 1: nedbrytning av prover som kräver vävnads avlägsnande från skallen lämnas från 31 januari, 2019 genom 28 februari 2019 på New York State Department of Health rabies laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prover som lämnats för rabies nekropsy har ofta en historia av kliniska tecken som är förenliga med en neurologisk sjukdom. Förekomst av klinisk sjukdom kan vara förknippad med en mängd olika sjukdomar, inklusive zoonotiska sjukdomar, vilket ökar risken för personal vid ett laboratorium som smittats. För att minska dessa risker har tekniker implementerats som minskar hanteringen och manipuleringen av proverna.
De metoder som demonstreras representerar en nekropsy händelse att ta bort önskade vävnader från ett enda djur bara. Oftare flera prover bearbetas i en förskjutning och omsorg behövs för att säkerställa ingen korskontaminering mellan proverna. En ren arbetsyta (engångskraft papper eller kuddar), en ny uppsättning av rena, desinficerade instrument och handskar förändringar är obligatoriska. När vävnaderna har erhållits, kan det enskilda laboratoriets protokoll för bearbetning följas, inklusive att göra diabilder för mikroskopi eller RNA-extraktion för molekylära metoder.
Det finns flera viktiga förutsättningar för att framgångsrikt implementera dessa tekniker i laboratoriet eller fältet. Tidigare rabies vaccinering och PPE är kritisk för någon necropsying en rabies misstänkt djur. Personer som arbetar i rabies laboratorier bör ha sitt serum testas var sjätte månad för att säkerställa en adekvat nivå av anti-rabies antikroppar är närvarande10. Det är viktigt att komma ihåg att andra zoonotiska sjukdomar, såsom eeev, wNv och bovin spongiform encefalopati (BSE), uppvisar liknande tecken som rabies och även kan förekomma hos misstänkta djur från rabies11,12.
Lämpliga väl underhållna instrument är viktiga för att säkert utföra nekropsy. När ett prov har avlägsnats från sin Biohazard påse, bör det endast manipuleras med instrument, inte händer, för att minska risken för olyckor. Innan små djur nekropsy, teknikern bör utvärdera tillståndet hos preparatet för att avgöra om en prioriterad ventrala tillvägagångssätt genom skallbasen är möjligt. Med stora djur kan det vara alltför besvärligt att fullt ut utvärdera tillståndet hos preparatet som ytterligare Kotor kan behöva avlägsnas innan du hämtar vävnad genom foramen magnum.
Begränsningar presentera sig i alla obduktion tekniker inklusive preparat tillstånd, vävnad kvalitet och mängden kvarvarande livmoderhals Kotor. Livmoderhals Kotor kommer inte att påverka resultaten av rabies analys, men allvarligt nedbrutet vävnad kan resultera i otillfredsställande resultat. Känsligare molekylära metoder vid rabiesdiagnostik kan möjliggöra lyckade tester i vissa prover som inte går att testa med direkt fluorescerande antikroppsanalys (DFA), inklusive allvarligt nedbrutet exemplar13. Emellertid, ingen mängd känslighet kan ersätta behovet av ordentlig vävnads provtagning.
Ett vanligt problem i rabies laboratoriet får olämplig eller otillräcklig hjärnvävnad för att testa när stora djurobduktioner utförs på fältet. Utan den erforderliga vävnaden, och om ytterligare vävnader är otillgängliga för åter inlämning, kommer vårt rabieslaboratorium utföra tester på vävnaden tillgänglig men är oförmögen att kontrollera provet negativt, i stället är det otillfredsställande för testning. Det finns andra publicerade metoder för fält vävnad samlingar såsom Straw metoden eller retro orbital Route14. Båda metoderna samla hjärnvävnad utan att behöva öppna skallen. En halm eller engångspipett förs in antingen genom foramen magnum eller ett hål som skapats i ögat uttaget och pressas genom hjärnan, i huvudsak tar ett kärnprov och inte nödvändigtvis provtagning hela tvärsnitt av hjärnstammen. Eftersom dessa fält metoder inte samlar in prover på ett sätt som anses tillfredsställande för testning i vårt laboratorium, dessa processer inte påvisas eller utforskas i detta dokument.
På området stora djur nekropsy kan vara utmanande för personer som inte är utbildade för att ta bort rätt vävnad för rabies testning. Istället läggs hela huvudet av djuret, som kan väga mellan 20-45 kg, skapa besvärliga transporter för både fält veterinären och rabies laboratorietekniker. Frekventa förfrågningar om utbildning på stora djur nekropsy teknik har gjorts till vårt laboratorium. Syftet med detta manuskript är att distribuera denna information till individer och grupper vars arbete kan dra nytta av dessa tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för New York State Department of Health Wadsworth Center för att stödja detta projekt. Vi skulle också vilja erkänna stöd från Amy Willsey och Frank Blaisdell av Department of Health Wadsworth Center, och LL Ranch, Altamont, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemistry spoon | Any | ||
| Curved, sharp-blunt mayo scissors | Sklar | 14-2055 | Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt |
| Large sharp restaurant-quality carving knife | Dexter | P94848 | 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Locking tumor-tenacula | Diamond Scientific and Surgicals | N/A | Czerny Tenaculum Forcep |
| Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) | Dexter | P94848 | Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Orthopedic mallet-hammer | Mortech | N/A | Postmortem hammer with hook |
| Sharp councilman orthopedic bone chisel | Shandon | 60-5 | Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in |
| Sharpened tablespoon or other long handled spoon | Any | ||
| Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth | Shandon | 63-03 | Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps |
| Powder-free non-latex gloves | Any | ||
| Safety glasses, goggles, or faceshield | Any | ||
| Surgery or N-95 mask | Any | ||
| Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc | Any |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). West Nile virus activity - United States, 2009. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (25), 769-772 (2010).
- McDaniel, C. J., Cardwell, D. M., Moeller, R. B. Jr, Gray, G. C. Humans and cattle: A review of bovine zoonoses. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 14 (1), 1-19 (2014).
- Spickler, A. R. Zoonotic diseases. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/public-health/zoonoses/zoonotic-diseases (2019).
- Wenner, L., Pauli, U., Summermatter, K., Gantenbein, H., Vidondo, B., Posthaus, H. Aerosol generation during bone-sawing procedures in veterinary autopsies. Veterinary Pathology. 54 (3), 425-436 (2017).
- Green, F. H. Y., Yoshida, K. Characteristics of aerosols generated during autopsy procedures and their potential role as carriers of infectious agents. Applied Occupational and Environmental Hygiene. 5 (12), 853-858 (1990).
- Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. Laboratory techniques in Rabies 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , World Health Organization. 425-427 (1996).
- Ness, S. L., Bain, F. T. How to perform an equine field necropsy. American Association of Equine Practitioners. 55, 313-316 (2009).
- Animal & Plant Health Agency. Sample requirements for TSE testing and confirmation – EURL guidance. , Available from: https://protect2.fireeye.com/url?k=09f00f8d-55d40ec4-09f2f6b8-0cc47aa8d394-3f805f032cc98df8&u=https://science.vla.gov.uk/tse-lab-net/documents/tse-oie-rl-samp.pdf (2019).
- New York State Department of Health, Wadsworth Center. Rabies reports. , Available from: https://www.wadsworth.org/programs/id/rabies/reports (2019).
- CDC. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing: A minimum standard for rabies diagnosis in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Miller, L. D., Davis, A. J., Jenny, A. L., Fekadu, M., Whitfield, S. G. Surveillance for lesions of bovine spongiform encephalopathy in U.S. cattle. Developments in Biological Standardizations. 80, 119-121 (1993).
- Andrews, C., Gerdin, J., Patterson, J., Buckles, E. L., Fitzgerald, S. D. Eastern equine encephalitis in puppies in Michigan and New York states. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 30 (4), 633-636 (2018).
- Appler, K., Brunt, S., Jarvis, J. A., Davis, A. D. Clarifying indeterminate results on the rabies direct fluorescent antibody test using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Public Health Reports. 134 (1), 57-62 (2019).
- Chapter 7. Brain removal. Laboratory techniques in Rabies 5th Edition. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. , World Health Organization. 67-72 (2018).
