Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar técnicas de necropsia seguras en animales pequeños y grandes para obtener muestras de tejido satisfactorias para pruebas de rabia.
Abstract
El Laboratorio de Rabia del Departamento de Salud del Estado de Nueva York (NYSDOH) recibe entre 6.000 y 9.000 especímenes al año y realiza pruebas de rabia para todo el estado, con la excepción de la ciudad de Nueva York. El laboratorio de rabia necropsia una variedad de animales que varían en tamaño desde murciélagos hasta ávidos. La mayoría de estos especímenes son animales que presentan signos neurológicos, sin embargo, menos del 10% en realidad dan positivo para la rabia; traumatismos, lesiones u otros agentes infecciosos como causa de estos síntomas. Debido al riesgo de aerosolizar agentes infecciosos no diagnosticados, el Laboratorio de Rabia no utiliza herramientas eléctricas ni sierras. Se presentarán tres técnicas de necropsia para animales cuyos cráneos son impenetrables con tijeras. El laboratorio ha implementado estas técnicas para disminuir la exposición potencial a agentes infecciosos, eliminar la manipulación innecesaria de la muestra y reducir el tiempo de procesamiento. Las ventajas de una técnica preferida opuesta a otra están sujetas al procesamiento individual entrenado de la muestra.
Introduction
Trabajar en el suelo de necropsia de un laboratorio de rabia es inherentemente peligroso. A veces, los especímenes llegan con plumas de puercoespín incrustadas, objetos extraños incluyendo flechas/ balas / pellets o fragmentos óseos expuestos que pueden penetrar en la envoltura de envío de protección. Un embalaje inadecuado puede provocar fugas, poniendo en peligro a las personas que desemman. Además de las lesiones físicas, los técnicos de necropsia corren el riesgo de exponerse a agentes infecciosos zoonóticos desconocidos del SNC y fluidos corporales de las muestras. Además, los ectoparásitos transportados por el espécimen pueden transmitir otras enfermedades zoonóticas, ya que las pulgas y las garrapatas se ven comúnmente en los animales presentados. Dependiendo de la ubicación geográfica y las especies involucradas las enfermedades expuestas varían. Arbovirus como el virus de la encefalitis equina oriental (EEEV) o el virus del Nilo Occidental (VNU), enfermedades transmitidas por garrapatas como la enfermedad de Lyme o la tularemia, las bacterias que causan fiebre Q o tuberculosis, y los priones infecciosos nombran un pequeño número de los posibles peligros1 , 2 , 3.
El propósito de estos métodos es demostrar técnicas de necropsia seguras y eficientes utilizando instrumentos que minimizan el potencial de aerosolización a diferencia de las herramientas eléctricas o sierras4,5. Comúnmente, la necropsia de los animales pequeños en el laboratorio de la rabia requiere cortar los músculos craneales y el uso de un martillo y un cincel para abrir la porción dorsal caudal del calvario6. Extracción de esta área de calvarium expone el cerebro posterior, incluyendo todo el cerebelo y el tronco craneal del cerebro. Las técnicas de necropsia modificadas se pueden realizar en la parte ventral del cráneo, evitando los músculos craneales grandes y las regiones más gruesas del cráneo. Sin embargo, estas técnicas de necropsia modificadas sólo son posibles cuando el espécimen está sin vértebras cervicales.
Del mismo modo, el tejido cerebral en animales grandes se puede extraer separando los músculos craneales y abriendo la porción dorsal caudal del cráneo7. Se requiere un esfuerzo considerable para exponer el cerebelo y el tallo cerebral, ya que los cráneos de animales más grandes son generalmente más gruesos. Para evitar penetrar el cráneo, la cabeza de un animal grande se coloca de modo que la porción ventrocaudal del cráneo está frente al técnico. Usando instrumentos modificados, el cerebelo y el tallo cerebral se eliminan a través del foramen magnum. Esto es similar al método de adquisición de muestras recomendado por el Laboratorio de Referencia de la Unión Europea de la EET para las investigaciones de encefalopatía espongiforme transmisible (EET)8. Las vértebras craneales deben retirarse de antemano para proporcionar acceso al foramen magnum.
La aplicación de estas técnicas es beneficiosa para los técnicos adecuadamente capacitados en laboratorios de rabia. Como el laboratorio de rabia recibe muestras de variostamaños, desde murciélagos juveniles hasta caballos de barril adultos 9, el técnico tiene varios métodos para elegir en función de las circunstancias individuales. El método demostrado para un animal grande también es apropiado para los veterinarios que realizan necropsias en el campo, ya que el envío de una cabeza de animal grande entera para pruebas de rabia es engorroso y costoso. La implementación de cualquiera de estas técnicas mejorará la seguridad al disminuir el potencial de producción de aerosoles, reducir el manejo de la muestra y ahorrar tiempo de procesamiento. Sin embargo, como el campo no tiene las mismas ventajas que un laboratorio configurado específicamente para las pruebas de rabia, es esencial que cualquier modificación hecha a estos procedimientos se centre en la seguridad, especialmente el uso de equipos de protección personal (EPP).
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Protocol
Todos los métodos descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) del Centro Wadsworth.
1. Preparación
- Don PPE, con protección ocular mínima (gafas o protector facial), mascarilla quirúrgica o N-95 y guantes sin látex.
- Preparar el área de trabajo, idealmente un armario de bioseguridad (BSC), con una cubierta de superficie de trabajo desechable (por ejemplo, papel kraft o almohadillas absorbentes) e instrumentos de necropsia limpios (Figura1).
- Coloque la muestra en la superficie de trabajo y utilice instrumentos para manipularla para evaluar el estado de la muestra, incluyendo evidencia de descomposición, daños en el cráneo, peligros potenciales (por ejemplo, plumas de puercoespín, cuchillas de bisturí) y la calidad de la decapitación.
2. Método ventral
NOTA: Cuando la muestra se decapita correctamente en la línea de la mandíbula, el foramen magnum y el cóndilo occipital serán expuestos. El método ventral es menos complicado para recuperar el cerebelo y el tronco cerebral.
- Coloque la muestra con el lado ventral hacia arriba y la nariz que se dirige discadamente hacia la parte posterior de BSC.
- Sostenga un martillo/mallet ortopédico en la mano derecha (si es diestro) y al mismo tiempo sostenga un cincel concejal en la mano izquierda.
- Coloque el cincel en un ángulo de 45o con el punto de esquina del cincel que dirige entre el lado derecho del hueso temporal y el hueso occipital haciendo una abertura "V".
- Golpea la parte superior del cincel con el martillo hasta que los dos huesos se separen. Haga el corte adyacente al hueso basefenoides.
- Repetir en el lado izquierdo del hueso temporal/hueso occipital (Figura2A).
- Dobla el área "V" del cráneo hacia abajo con el cincel. Exponer toda el área rommbencefalona del cerebro (cerebelo y tallo cerebral) (Figura 2B).
- Saca el tallo cerebral y el cerebelo con tijeras y fórceps. Retire las piezas restantes del cráneo si el tallo cerebral y el cerebelo no salieron en una sola pieza.
3. Método dorsal
NOTA: Si la muestra tiene una decapitación deficiente (foramen magnum no visible) y el cuello no se puede quitar fácilmente durante la necropsia o si se sospecha daño al cerebelo, se debe utilizar el método dorsal.
- Coloque el espécimen dorsalmente con la nariz dirigiendo distalmente hacia la parte posterior de BSC.
- Usando tenacula tumoral, agarre el músculo temporal izquierdo con dientes de tenacula y cierre apretando el mango.
- Cortar el músculo temporal hasta el hueso con un cuchillo de talla rita.
- Gire la muestra 180o con tenacula y cuchillo (no mano) y repita el proceso en el músculo temporal opuesto. Exponga el cráneo.
- Coloque un cincel en un ángulo de 45o con el punto de esquina del cincel en el centro del cráneo en la coyuntura del hueso parietal e intraparietal.
- Golpea la parte superior del cincel con un martillo hasta que se haga una abertura horizontal en la mitad superior del cráneo en el hueso parietal.
- Gire la muestra 180o y repita el proceso en el lado opuesto.
- Inserte el punto del cincel en el extremo del corte 1 (Figura3A)y a 90o de apertura horizontal. Golpea con el martillo hasta que la abertura alcance el hueso occipital (aproximadamente 10 cm dependiendo del tamaño de la muestra).
- Enrolle la muestra y repita en el lado opuesto al final del corte 2.
NOTA: Con la muestra dorsal y la nariz colocada hacia la parte posterior de BSC, las aberturas en el cráneo se asemejan a una "U" al revés. - Inserte los dientes de la tenacula en el cráneo en la parte inferior de la "U" y haga palanca hacia uno mismo. Exponer el extremo caudal del cerebro y el cerebelo (Figura3B).
- Usa tijeras como una cucharada y saca todo el cerebelo desde dentro de la cavidad.
- Usa fórceps tisulares para burlarte del tallo cerebral del foramen.
4. Método animal grande
- Coloque el espécimen de modo que la parte dorsal del cráneo esté en contacto con la superficie de necropsia con la porción caudal del cráneo y el foramen magnum frente al técnico.
- Inserte el cuchillo de aguja modificado en el foramen magnum entre la médula espinal y las meninges espinales en la medida de lo posible.
- Puntuación alrededor de la médula espinal para separar el cerebelo y el tallo cerebral de las meninges espinales. Después de insertar el cuchillo a través del foramen magnum, ángulo suavemente el cuchillo para seguir a lo largo del cráneo tanto como sea posible.
- Inserte una espátula química o una cuchara finos y largas en el espacio entre el tejido neural y las meninges espinales.
- Sonda alrededor de la médula espinal y el cerebelo para asegurar se ha cortado la conexión con las meninges espinales.
- Sostenga el tronco cerebral con fórceps. Con la otra mano, avance la cuchara rostrally luego dorsalmente para recoger el cerebelo. Simultáneamente tire hacia atrás en el tallo cerebral con los fórceps y sacar el cerebelo usando la cuchara.
NOTA: Puede tomar más de un intento de recuperar el cerebelo adecuado para la prueba de la rabia.
5. Post necropsia
- Deseche todos los materiales desechables (guantes, almohadillas, revestimientos de área de trabajo) y los tejidos no utilizados en residuos biopeligrosos.
- Limpie y desinfecte todos los instrumentos con el método disponible (por ejemplo, lavavajillas industrial, autoclave, desinfectante químico, ebullición).
- Limpie y desinfecte todas las superficies de trabajo con un 20% de lejía y/o un 70% de etanol.
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Representative Results
Todas las muestras terrestres presentadas con cráneos entre el 31 de enero de 2019 y el 28 de febrero de 2019 tenían información sobre la presencia de un cuello y el método de necropsia recogido. Durante ese tiempo, 170 cabezas fueron necropsiadas con 18 especies representadas. 52% (89/170) fueron debidamente decapitados. El resto tenía al menos una vértebra unida, incluyendo tres especímenes de cuerpo entero. El método ventral se utilizó 75% (128/170) de la época, de los que, cuellos estaban presentes en 49. Los especímenes presentados con un cuello se eliminarán durante la necropsia para permitir el método ventral siempre que sea posible. Se presentaron tres animales grandes (vaca, ciervo, cerdo) y en dos casos se utilizó el protocolo animal grande. El protocolo animal grande no se utilizó en el cerdo porque se requerían muestras adicionales de tejido cerebral para pruebas adicionales. Una ardilla fue presentada con un cráneo aplastado y simplemente cortando el tejido cerebral expuesto a la piel, por lo tanto no se utilizó ninguno de los métodos anteriores (Tabla1).
En las presentaciones intactas frescas, los tres métodos resultarán con el tejido requerido para obtener resultados fiables de pruebas de diagnóstico de rabia. Ocasionalmente, el cerebelo y el tallo cerebral no se pueden eliminar intactos, aunque después de extraer todo el tejido del cerebro trasero estos tejidos pueden ser identificados y procesados en consecuencia.
Estos tres métodos valiosos no pueden compensar la mala calidad de la muestra causada antes de la recepción en el laboratorio. El trauma, la descomposición y los métodos de decapitación deficientes pueden afectar el resultado independientemente de la eficiencia con la que se recojan las muestras.
Figura 1: Instrumentos utilizados en la necropsia de la rabia. Tijeras de mayonesa afiladas curvadas, fórceps de vendaje de tejido de punta lisa sin dientes, cincel óseo ortopédico, martillo de mazo ortopédico, bloqueo tumor-tenacula, cuchillo de talla de calidad de restaurante, cuchillo de aguja modificado, cuchara química, y cucharada afilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Método ventral de necropsia. (A) Ubicación de los cortes: Coloque el punto de un cincel en la base de la flecha, corte en dirección a la flecha verde y repita siguiendo la flecha amarilla que forma una "V" alrededor del foramen magnum. Haga palanca "V" hacia abajo para exponer el tallo cerebral y el cerebelo. (B) Tallo cerebral (verde) y cerebelo (azul) cuando se expone utilizando el método ventral de necropsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Método dorsal de necropsia. (A) Ubicación de los cortes: Coloque el punto de un cincel en la base de la flecha y corte en la dirección de la flecha en el orden indicado formando una "U". Haga palanca "U" hacia abajo para exponer el cerebelo con el tallo cerebral debajo de él. (B) Cerebelo (círculo) cuando se expone utilizando el método dorsal. El tallo cerebral se encuentra directamente debajo y no es visible hasta que se elimina el cerebelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especies | vértebras unidas | método utilizado V-ventral, D-dorsal, LA-gran animal | Total | Comentarios |
| Oso | No | Ⅴ | 2 | |
| Gato | No | Ⅴ | 32 | |
| Gato | No | D | 3 | 2 lo suficientemente pequeño como para abrir el cráneo con tijeras, 1 tenía abcess que estaba siendo investigado exponiendo la parte superior del cráneo |
| Gato | Sí | Ⅴ | 11 | |
| Gato | Sí | D | 8 | |
| Vaca | No | LA | 1 | |
| Coyote | No | Ⅴ | 1 | |
| Coyote | Sí | Ⅴ | 2 | |
| Coyote | Sí | D | 3 | |
| Ciervo | No | LA | 1 | |
| Perro | No | Ⅴ | 19 | |
| Perro | No | D | 3 | |
| Perro | Sí | Ⅴ | 2 | 1 era perro pequeño |
| Perro | Sí | D | 18 | |
| Hurón | No | Ⅴ | 1 | |
| Fisher | No | Ⅴ | 1 | |
| ardilla voladora | Sí | D | 1 | todo el cuerpo |
| zorro gris | No | Ⅴ | 2 | |
| zorro gris | Sí | Ⅴ | 4 | |
| Cerdo | Sí | Ⅴ | 1 | |
| Puercoespín | No | Ⅴ | 1 | |
| Mapache | No | Ⅴ | 16 | |
| Mapache | No | D | 1 | Congelado |
| Mapache | Sí | Ⅴ | 26 | |
| zorro rojo | No | Ⅴ | 2 | |
| zorrino | No | Ⅴ | 1 | |
| zorrino | Sí | Ⅴ | 3 | |
| Ardilla | No | Ⅴ | 1 | |
| Ardilla | Sí | D | 1 | cuerpo completo, cráneo aplastado, tijeras usadas para cortar la piel a la cavidad cerebral expuesta |
| weasle | No | D | 1 | |
| Marmota | Sí | D | 1 | todo el cuerpo |
| Total | 170 | |||
| Desglose del total | ||||
| con cuello | 81 | |||
| sin cuello | 89 | |||
| método ventral | 128 | |||
| método dorsal | 39 | |||
| método animal grande | 2 | |||
| otro método | 1 | |||
| método ventral con cuello | 49 |
Tabla 1: Desglose de especímenes que requieren la extracción de tejido del cráneo presentado desde el 31 de enero de 2019 hasta el 28 de febrero de 2019 en el Laboratorio de Rabia del Departamento de Salud del Estado de Nueva York.
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Discussion
Los especímenes sometidos a necropsia de rabia a menudo tienen antecedentes de signos clínicos compatibles con una enfermedad neurológica. La presencia de enfermedad clínica puede estar asociada con una variedad de trastornos, incluyendo enfermedades zoonóticas, lo que aumenta el riesgo para el personal de una infección adquirida en un laboratorio. Para reducir estos riesgos, se han implementado técnicas que disminuyen el manejo y manipulación de muestras.
Los métodos demostrados representan un evento de necropsia para eliminar los tejidos deseados de un solo animal. Más comúnmente múltiples muestras se procesan en un turno y se necesita cuidado para asegurar que no haya contaminación cruzada entre las muestras. Una superficie de trabajo limpia (papel kraft desechable o almohadillas), un nuevo conjunto de instrumentos limpios, desinfectados y cambios de guante son obligatorios. Una vez obtenidos los tejidos, se puede seguir el protocolo de procesamiento del laboratorio individual, incluyendo la fabricación de diapositivas para microscopía o extracción de ARN para métodos moleculares.
Existen varios requisitos previos esenciales para implementar correctamente estas técnicas en el laboratorio o en el campo. La vacunación previa contra la rabia y la EPP son fundamentales para cualquier persona que necropsyy un animal sospechoso de rabia. Las personas que trabajan en laboratorios de rabia deben hacerse pruebas de suero cada seis meses para garantizar la entrada de un nivel adecuado de anticuerpos antirrábico10. Es importante recordar que otras enfermedades zoonóticas, como el EEEV, el WNV y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), presentan signos similares como rabia y también pueden ocurrir en animales sospechosos de rabia11,12.
Los instrumentos adecuados y bien mantenidos son esenciales para realizar con seguridad la necropsia. Una vez que un espécimen ha sido retirado de su bolsa de riesgo biológico, sólo debe ser manipulado con instrumentos, no con las manos, para disminuir el potencial de accidentes. Antes de la necropsia de animales pequeños, el técnico debe evaluar el estado de la muestra para determinar si es posible un enfoque ventral preferido a través de la base del cráneo. Con animales grandes puede ser demasiado engorroso evaluar completamente el estado del espécimen, ya que es posible que sea necesario extraer vértebras adicionales antes de recuperar el tejido a través del foramen magnum.
Las limitaciones se presentan en todas las técnicas de necropsia, incluyendo la condición de la muestra, la calidad del tejido y la cantidad de vértebras cervicales restantes. Las vértebras cervicales no afectarán los resultados del análisis de la rabia, pero el tejido gravemente descompuesto puede dar lugar a resultados insatisfactorios. Los métodos moleculares más sensibles en el diagnóstico de la rabia pueden permitir pruebas exitosas en ciertas muestras que no pueden ser analizadas mediante el ensayo directo de anticuerpos fluorescentes (DFA), incluidas las muestras gravemente descompuestas13. Sin embargo, ninguna cantidad de sensibilidad puede reemplazar la necesidad de muestreo de tejido adecuado.
Un problema común en el laboratorio de rabia es recibir tejido cerebral inapropiado o inadecuado para analizarlo cuando se realizan grandes necropsias de animales en el campo. Sin el tejido requerido, y si los tejidos adicionales no están disponibles para su reenvío, nuestro laboratorio de rabia realizará pruebas en el tejido disponible pero no puede verificar el espécimen negativo, en su lugar es insatisfactorio para las pruebas. Existen otros métodos publicados para colecciones de tejidos de campo, como el método de paja o la ruta orbital retro14. Ambos métodos recogen tejido cerebral sin necesidad de abrir el cráneo. Una pipeta de paja o desechable se inserta a través del foramen magnum o un agujero creado en la cavidad ocular y empujado a través del cerebro, esencialmente tomando una muestra de núcleo y no necesariamente el muestreo de la sección transversal completa del tallo cerebral. Dado que estos métodos de campo no recogen muestras de manera que se consideren satisfactorias para las pruebas en nuestro laboratorio, estos procesos no se demuestran ni exploran en este documento.
En el campo, la necropsia animal grande puede ser un desafío para las personas que no están entrenadas para eliminar el tejido correcto para las pruebas de rabia. En su lugar, toda la cabeza del animal, que puede pesar entre 20-45 kg, se presenta creando un transporte engorroso tanto para el veterinario de campo como para los técnicos de laboratorio de rabia. Se han realizado frecuentes solicitudes de entrenamiento en la técnica de necropsia de animales grandes a nuestro laboratorio. El objetivo de este manuscrito es distribuir esta información a individuos y grupos cuyo trabajo puede beneficiarse de estas técnicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos al Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York por apoyar este proyecto. También nos gustaría reconocer el apoyo de Amy Willsey y Frank Blaisdell del Departamento de Salud Wadsworth Center, y LL Ranch, Altamont, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemistry spoon | Any | ||
| Curved, sharp-blunt mayo scissors | Sklar | 14-2055 | Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt |
| Large sharp restaurant-quality carving knife | Dexter | P94848 | 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Locking tumor-tenacula | Diamond Scientific and Surgicals | N/A | Czerny Tenaculum Forcep |
| Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) | Dexter | P94848 | Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle |
| Orthopedic mallet-hammer | Mortech | N/A | Postmortem hammer with hook |
| Sharp councilman orthopedic bone chisel | Shandon | 60-5 | Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in |
| Sharpened tablespoon or other long handled spoon | Any | ||
| Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth | Shandon | 63-03 | Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps |
| Powder-free non-latex gloves | Any | ||
| Safety glasses, goggles, or faceshield | Any | ||
| Surgery or N-95 mask | Any | ||
| Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc | Any |
References
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