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Biology

प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विवो में प्रोटीन स्व-असेम्बली का पता लगाने और विशेषता

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59577
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, The University of Kansas School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह आलेख दोनों एस cerevisiae और HEK293T कोशिकाओं में प्रोटीन स्वयं विधानसभा मात्रा निर्धारित करने के लिए एक FRET-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

प्रोटीन स्व-असेम्बली प्रोटीन समारोह को नियंत्रित करता है और अंतरिक्ष और समय में सेलुलर प्रक्रियाओं को कम करता है। यह अध्ययन करने के लिए वर्तमान तरीकों कम संवेदनशीलता से ग्रस्त हैं, अप्रत्यक्ष पढ़ने के बहिष्कार, सीमित प्रवाह, और / हम एक प्रवाह साइटोमेट्री आधारित एकल पद्धति है कि इन सीमाओं के सभी पते डिजाइन: वितरित एम्फीफ्लोरिक FRET या DAmFRET. DAmFRET का पता लगाता है और vivo में संवेदनशील उत्सर्जन FRET द्वारा प्रोटीन आत्म-असेम्बली का परिमाण, मॉडल सिस्टम भर में तैनाती सक्षम बनाता है- खमीर से मानव कोशिकाओं के लिए और संवेदनशील, एकल सेल, उच्च throughput पठन-आउट प्राप्त प्रोटीन की परवाह किए बिना स्थानीयकरण या विलेयता.

Introduction

homotypic प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए परख, या "स्व-असेम्बली" महत्वपूर्ण हैं क्योंकि अल्पवयीन राज्य और प्रोटीन की घुलनशीलता उनके कार्य हुक्म. प्रोटीओम में होमो-मल्टीमर्स1,2,3,4,जबकि अपेक्षाकृत कम प्रोटीन मोनोमर के रूप में कार्य करते हैं। प्रोटीन भी तनाव, उम्र, या misregulation के कारण aberantly इकट्ठा कर सकते हैं, गतिविधि में रोग परिवर्तन के लिए अग्रणी. कारकों की पहचान है कि इस तरह की घटनाओं, या यहां तक कि विधानसभाओं की शारीरिक प्रकृति, अक्सर असाधारण चुनौतीपूर्ण है.

प्रोटीन की बढ़ती संख्या अब असाधारण cooperativity और अनिश्चित स्टोइकियोमेट्री के साथ स्वयं को इकट्ठा करने के लिए मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, प्रोटीन घने चरणों के रूप में अन्य सेलुलर घटकों से उनके demixing में जिसके परिणामस्वरूप. ये अव्यवस्थित संघनित ोंकाओं का रूप लेते हैं, जैसे बूंदों और जैल, या अत्यधिक आदेशित फिलामेंट, जैसे एमिलॉयड फाइबर। बाद के साथ जुड़े अनुरूप उतार-चढ़ाव आणविक स्तर5,6पर स्वाभाविक रूप से संगतिक, अपने प्रारंभिक गठन या नाभिक को प्रदान करते हैं। क्योंकि मात्रा के साथ नाभिक तराजू की संभावना, इस तरह के विधानसभाओं के गठन के रहने वाले कोशिकाओं के स्थानिक दायरे में अत्यधिक stochastic हो सकता है7,8. stochastic नाभिक-सीमित चरण जुदाई के चरम पर prions हैं, अत्यधिक आदेश प्रोटीन विधानसभाओं कि केवल शायद ही कभी सहज रूप से नाभिक, लेकिन एक बार गठन, टेम्पलेट अपने स्वयं के विकास अनिश्चित काल के लिए. ऐसा ही एक प्रोटीन, एएससी के रूप में जाना जाता है, स्तनधारी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि में एक डिजिटल prion की तरह स्विच निष्पादित करता है. एएससी आत्म विधानसभा विशिष्ट प्रोटीन है कि खुद बाध्यकारी रोगज़नक़- या खतरे से जुड़े आणविक पैटर्न पर oligomerized है के साथ अपनी बातचीत से नाभिक है. एएससी असेंबली बारी में न्यूक्लिएट procaspase-1 स्वयं को इकट्ठा करने और सक्रिय करने के लिए, कोशिका9,10के साइटोकीन परिपक्वता और pyroptosis के लिए अग्रणी . अपनी विधानसभा के लिए जिम्मेदार एएससी के क्षेत्र मौत डोमेन superfamily, जो मानव proteome में एक से अधिक सैकड़ों सदस्यों के होते हैं के अंतर्गत आता है. जन्मजात प्रतिरक्षा और क्रमादेशित सेल मौत में मौत डोमेन की निर्णायक भूमिकाओं के बावजूद, उनमें से ज्यादातर अभी तक आत्म विधानसभा के संबंध में विशेषता नहीं किया गया है. इस तरह के व्यवहार के साथ अतिरिक्त प्रोटीन की खोज और विशेषता बहुत प्रोटीन स्वयं विधानसभा के एक प्रत्यक्ष, एकल सेल readout द्वारा सुविधा होगी.

शास्त्रीय प्रोटीन जैव रसायन दृष्टिकोण प्रोटीन स्वयं विधानसभा का अध्ययन करने के लिए, इस तरह के आकार बहिष्कार क्रोमैटोग्राफी और ultracentrifugation के रूप में, जनसंख्या स्तर के आकलन के लिए काफी हद तक सीमित हैं. तथापि, न्यूक्लिएशन-सीमित प्रावस्था संक्रमण के परिणामस्वरूप कोशिका-से-कोशिका विषमता को विस्तार के इस स्तर के साथ मॉडल नहीं किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के आधार पर एकल सेल दृष्टिकोण इस क्षमता हासिल है, लेकिन सही मात्रा नाभिक या दुर्लभ विधानसभाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक प्रवाह की कमी. इसके अलावा, इस तरह के सबसे एंजाइमों और पूर्व amyloid oligomers के रूप में घुलनशील आत्म विधानसभा, बहुत छोटे हैं और मोबाइल मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा हल किया जा करने के लिए. वे इस तरह के फ्लोरोसेंट सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में और अधिक परिष्कृत दृष्टिकोण से पता लगाया जा सकता है, लेकिन इन सेल संख्या और प्रवाह में बहुत सीमित हैं.

प्रोटीन असेंबली की निकटता-आधारित परख, जैसे FRET और स्प्लिट फ्लोरोफोर पूरकेशन, इन समस्याओं के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करते हैं। हालांकि, वे आम तौर पर दो अलग अलग constructs के उपयोग की आवश्यकता होती है पूरक टैग के लिए जुड़े ब्याज के प्रोटीन व्यक्त दाता और FRET के मामले में स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर्स. यह प्रयोगात्मक थ्रूपुट से समझौता करता है और दाता और स्वीकारकर्ता के सापेक्ष स्तरों में सेल-टू-सेल भिन्नता के कारण संवेदनशीलता को भी कम करता है। इस दरकिनार करने के लिए, हम एक परख है कि एक photoconvertible fluorophor, mEos3.111,जो एक एकल निर्माण दोनों दाता व्यक्त करने की अनुमति देता है को रोजगार डिजाइन- और स्वीकारकर्ता टैग प्रोटीन. unconverted mEos3.1 (GFP की तरह दाता) के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पर्याप्त photoconverted mEos3.1 (dsRed की तरह स्वीकारकर्ता) की उत्तेजना स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप करने के लिए FRET होने की अनुमति जब अणुओं करीब निकटता में हैं (lt;10 एनएम). इस प्रकार, 405 एनएम प्रकाश की एक अनुभवजन्य निर्धारित खुराक के लिए कोशिकाओं को उजागर करके, जो photoconverts कुल mEos3.1 का एक इष्टतम अंश स्वीकारकर्ता के रूप में, हम दाता और स्वीकार करने के कई नमूनों में दाता और स्वीकार करने के लगातार और reproducible रिश्तेदार स्तर को प्राप्त करने, व्यंजक स्तर और प्रयोग. हम स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेंट उपाय जब या तो सीधे 561 एनएम प्रकाश के साथ उत्साहित, या परोक्ष रूप से (दाता से ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा) 488 एनएम प्रकाश के साथ (यानी, संवेदनशील उत्सर्जन FRET). हम प्रोटीन असेंबली को इन दो मूल्यों के अनुपात के रूप में रिपोर्ट करते हैं और इसे उभयप्रवाहीय FRET या AmFRET कहते हैं।

प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के लिए, हम पहले mEos3.1 के साथ टैग Spc42 का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना. क्योंकि खमीर कोशिकाओं Spc42 के लगभग 1000 अणु होते हैं, हम तो एक भी फ्लोरोसेंट हरी mEos3.1 अणु की फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना. सभी सेलुलर सांद्रताओं पर सम प्रकाश रूपांतरण का लाभ उठाकर (चित्र 1E) हम तो फोटो रूपांतरण के बाद सभी स्वीकारकर्ता तीव्रता के लिए कुल mEos3.1 फ्लोरोसेंट मानसह. हम तो अनुमानित cytosolic मात्रा द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की moles की कुल संख्या को विभाजित करने में सक्षम हैं (के रूप में इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर निर्धारित) ब्याज की प्रोटीन की कुल cytosolic एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. सटीक गणना के लिए, कृपया मूल पांडुलिपि8देखें.

खमीर में एक 2 डिग्री प्लाज्मिड से mEos3.1-fused प्रोटीन व्यक्त करके, हम हर नमूने में प्रोटीन एकाग्रता के एक लगभग हजार गुना रेंज की जांच8. हम transfection के दौरान प्लाज्मिड तेज में भिन्नता के आधार पर HEK293T कोशिकाओं में एक ही प्राप्त है, और इसलिए चर प्रतिलिपि संख्या.

AmFRET, या DAmFRET के परिणामस्वरूप वितरण, कोशिकाओं के कई हजारों के लिए ब्याज के किसी भी प्रोटीन के लिए cytosol में आत्म विधानसभा की एकाग्रता निर्भरता से पता चलता है. कुल मिलाकर, DAmFRET की खोज और संवेदनशीलता का एक अभूतपूर्व संयोजन के साथ प्रोटीन आत्म विधानसभा की विशेषता के लिए एक सक्षम पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है, throughput, और reproducibility.

एक इमेजिंग साइटोमीटर का उपयोग करते समय हमें विवो प्रोटीन एकाग्रता माप में प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है, इस तरह के cytometers अभी तक ज्यादातर अनुसंधान संस्थानों में उपलब्ध नहीं हैं. फिर भी, DAmFRET प्रोटीन अभिव्यक्ति की सीमा पर प्रोटीन विधानसभा के वितरण प्राप्त करने के लिए एक ठेठ गैर-इमेजिंग साइटोमीटर में भी चलाया जा सकता है।

Protocol

1. DAmFRET परख के लिए Saccharomyces cerevisiae की तैयारी

  1. एक 2 डिग्री गैलैक्टोस-इंड्यूसिबल प्लाज्मिड के साथ प्रयोगात्मक रूप से प्रासंगिक खमीर उपभेदों को रूपांतरण करें जो एक मानक लिथियम एसीटेट प्रोटोकॉल12 का उपयोग करते हुए सी या एन टर्मिनस में या तो सी या एन टर्मिनस पर टैग किए गए ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करता है।
  2. तरल संस्कृति में खमीर हो जाना.
    1. हर क्वेरी प्रोटीन के लिए, खमीर कालोनियों टीका (रूपांतरण), triplicate में, प्रत्येक में 200 $L उपयुक्त गैर-प्रेरित विकास मीडिया के (यानी, मीडिया युक्त 2% dextrose, खमीर नाइट्रोजन आधार और एमिनो एसिड प्लाज्मिड के चयन के लिए) एक 96-वेल प्लेट में () चित्र 1C)
    2. एक प्लेट शेकर पर मिलाते समय इनक्यूबेट कोशिकाएं (सामग्री की सारणीदेखें ) 16 ज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 1200 बजे 1200 उउ कक्षा के साथ।
  3. ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करें (16 एच-कुछ प्रोटीनों के लिए प्रतिनिधित्व प्रोटोकॉल में अधिक या कम समय लग सकता है)।
    1. प्रेरण के 16 एच के बाद, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2200 x ग्राम पर प्लेट स्पिन (RT0 नमूने गोली के लिए.
    2. जबरन उलटा करके मीडिया को हटा दें. उपयुक्त प्रेरण मीडिया के 200 डिग्री सेल्सियस के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित (यानी, 2% गैलिक्टोज युक्त मीडिया, खमीर नाइट्रोजन आधार और प्लाज्मिड के चयन के लिए एमिनो एसिड). चित्र 1Cदेखें.
    3. 12 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेट कोशिकाएं।
    4. सेंट्रीफ्यूज (सामग्री की मेजदेखें ) प्लेट 2200 x g पर 2 मिनट के लिए आरटी पर नमूने गोली. जबरन उलटा करके मीडिया को हटा दें. प्रेरण मीडिया के 200 $L के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    5. एक और 4 ज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 1200 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेट कोशिकाओं। ताजा मीडिया में इस resuspension 4 एच DAmFRET चलाने से पहले होना चाहिए, ताकि autofluorence को कम करने के लिए.

2. मैमलियन प्लाज़्मिड सृष्टि

  1. एक स्तनधारी सदिश का निर्माण करें जिसमें एक प्लेसहोल्डर के साथ एक संरचक प्रवर्तक और एमईओएस3.1 है, जो उनके बीच में ब्याज के जीन और एक लिंकर को सम्मिलित करता है।
    नोट: हम एक सुनहरा गेट संगत वेक्टर का निर्माण किया, M1, एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड से ( सामग्री की तालिकादेखें) निम्नलिखित संशोधनों के साथ: एक मौजूदा BsAI साइट एक बिंदु उत्परिवर्तन जी द्वारा एक बिंदु उत्परिवर्तन जी द्वारा हटा दिया गया था (स्थिति 3719 जमा के अनुसार अनुक्रम) मीओस3.1 I157V पर फ्लोरोफोर की साइट-निर्देशित म्यूटजेनेसिस का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। उलटे BsAI साइटों 4x (EAAAR) linker द्वारा पीछा किया गया, गिब्सन विधानसभा द्वारा, सीएमवी प्रमोटर और mEos3.1 के बीच में फ्रेम अंतिम M1 वेक्टर का उत्पादन करने के लिए. प्रोटीन अभिव्यक्ति CMV बढ़ाने और प्रमोटर द्वारा संचालित है; और SV40 polyadenylation संकेत द्वारा प्रतिलेखन समाप्ति.
  2. सम्मिलित करता है, का निर्माण वेक्टर के साथ संगत की एक पुस्तकालय बनाएँ.
    नोट: हम सिंथेटिक रैखिक टुकड़े के रूप में गोल्डन गेट विधानसभा के लिए हमारे सम्मिलित करता है आदेश (सामग्री की तालिका देखें) CMV प्रमोटर और 4x (EAAR)-mEos3.1 के बीच M1 में ligation के लिए BsAI साइटों द्वारा flanked.

3. मैमलियन सेल संस्कृति और ट्रांसफेक्शन

  1. DMEM में संस्कृति HEK293T कोशिकाओं + 10% FBS + 1x PenStrep मीडिया पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2.
  2. transfection से पहले दिन, बीज 5 x 105 कोशिकाओं को एक 6 अच्छी तरह से थाली में मीडिया के 2 एमएल के साथ.
  3. ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करके 2 ग्राम प्लाज्मिड डीएनए वाली ट्रांसफेक्ट कोशिकाएं (सामग्री की सारणीदेखें) 3:1 (ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक:डीएनए) के अनुपात में। कम सीरम मीडिया के 150 डिग्री एल में घटकों को मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें ) और इसे 15 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें, प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण जोड़ें और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 48 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (488 एनएम उत्तेजना, 515 एनएम उत्सर्जन) द्वारा 24 एच के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि करें।

4. DAmFRET परख के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्रोटीन अभिव्यक्ति के 48 एच के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया को हटा दें और ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। धोने के बाद, पीबीएस को प्रेरित करें।
  2. 0.5 एमएल ट्रिप्सिन-एथिलीनडिऐथिमिनेटेरैसेटिक एसिड (EDTA) (0.25%) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा DMEM मीडिया के 0.5 एमएल जोड़ें, कोशिकाओं को फिर से निलंबित और कोई बड़ी clumps दिखाई दे रहे हैं सुनिश्चित करें.
  4. प्रत्येक कुएं की पूरी मात्रा को 1.5 एमएल ट्यूबमें स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 1000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं।
  6. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस + 10 एमएम EDTA के 1 एमएल में सेल गोली resuspend.
  7. आरटी पर 1000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन।
  8. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस में 1 एमएल 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) + 10 एमएम एड्टा में सेल गोली को फिर से खोल दें।
  9. लगातार आंदोलन के साथ एक शेक मेज पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
  10. आरटी पर 1000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं।
  11. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस + 10 एमएम EDTA के 1 एमएल में सेल गोली resuspend.
  12. आरटी पर 1000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं।
  13. supernatant निकालें और cytometry चलाने के लिए बफर की पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (के लिए 1 अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग 200 पीबीएस के $L + 10 एमएम EDTA).
  14. एक गोल नीचे 96-अच्छी प्लेट के एक अच्छी तरह से करने के लिए resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण.

5. परख के लिए खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं के फोटो रूपांतरण

  1. एक माइक्रोप्लेट में फोटोकनवर्ट नमूने एक यूवी लैंप का उपयोग कर कोई कवर के साथ (सामग्री की मेजदेखें) एक 320-500 एनएम (वायलेट) फिल्टर और एक बीम collimator के साथ फिट, थाली के ऊपर 45 सेमी तैनात, जबकि मिलाते हुए 25 मिनट की अवधि के लिए. ये स्थितियां उपयुक्त हैं जब प्लेट में बीम शक्ति 11.25 उW/सेमी2है , जिसमें कुल फोटॉन खुराक 8 के लगभग 17,000 mJ/cm2 हैं .

6. DAmFRET डेटा संग्रह

  1. गैर-संरेखित 488/561 लेज़रों के साथ एक साइटोमीटर का उपयोग कर परख कोशिकाओं। निम्नलिखित डेटा FRET की गणना के लिए न्यूनतम आवश्यकताएँ हैं।
    1. दाता फ्लोरोसेंट के संग्रह के लिए एक 488 एनएम उत्तेजना / 515 एनएम उत्सर्जन चैनल का उपयोग करें।
    2. FRET संकेत के फ्लोरोसेंट के संग्रह के लिए एक 488 एनएम उत्तेजना / 595 एनएम उत्सर्जन चैनल का उपयोग करें।
    3. स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेंट के संग्रह के लिए 561 एनएम उत्तेजना/ 595 एनएम उत्सर्जन चैनल (488/595 चैनल के साथ गैर-संरेख) का उपयोग करें।
    4. ऑटोफ्लोरेसेंस8के संग्रह के लिए 405 एनएम उत्तेजना / 457 एनएम उत्सर्जन चैनल का उपयोग करें।
    5. मात्रा गणना के लिए एक brightfield छवि चैनल का उपयोग करें।
      नोट: S. cerevisiae के लिए साइटोमीटर सेटिंग्स को कम प्रवाह दर और उच्च संवेदनशीलता पर इस प्रकार हैं: 60x उद्देश्य; लेजर शक्तियों 15 mW पर 405 एनएम करने के लिए सेट, 15 mW पर 488 एनएम, 561 एनएम पर 20 mW.Imaging cytometer सेटिंग्स HEK293T कोशिकाओं के लिए इस प्रकार हैं: कम प्रवाह दर और उच्च संवेदनशीलता पर 40x उद्देश्य; लेजर शक्तियों 15 mW पर 405 एनएम करने के लिए सेट, 15 mW पर 488 एनएम, 561 एनएम पर 20 mW.Also ध्यान दें कि, हमारे इमेजिंग साइटोमीटर कस्टम डिजाइन किया गया था स्थानिक रूप से अलग किया गया था 488 एनएम और 561 एनएम लेज़रों (यानी, विभिन्न कैमरों पर) तो के रूप में fluorcen से FRET का स्पष्ट संकल्प प्राप्त करने के लिए Ce.
  2. एक फ्लोरोसेंट सकारात्मक गेट के भीतर प्रति नमूना 20,000-50,000 एकल कोशिकाओं के लिए डेटा एकत्र करें।
    1. गेट एकल कोशिकाओं एक उच्च पहलू अनुपात और एक छोटे सेल क्षेत्र के रूप में clumped कोशिकाओं या मलबे जो कम पहलू अनुपात और बड़े या बहुत छोटे सेल क्षेत्रों क्रमशः होगा करने के लिए विरोध किया.
      नोट: एक गैर-इमेजिंग साइटोमीटर में समकक्ष पैरामीटर FSC (आगे तितर बितर) अनुमानित सेल आकार और सेल दानेदारता के लिए एसएससी (साइड स्कैटर) के लिए हैं। साथ ही, FSC पल्स ऊँचाई बनाम पल्स चौड़ाई एकल सेल gating के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में उपयोग करें। इसके अतिरिक्त, यह साइट ोमीटर की संवेदनशीलता की ऊपरी सीमा से परे फ्लोरोसेंट मान है कि घटनाओं को इकट्ठा नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे इमेजिंग साइटोमीटर में, हम घटनाओं के संग्रह को हमारे द्वारा एकत्रित किए जाने वाले हर फ्लोरोसेंट चैनल के लिए संतृप्ति सीमा से कम एक के कच्चे अधिकतम पिक्सेल मूल्य तक प्रतिबंधित करते हैं। इसी तरह, पारंपरिक प्रवाह cytometers के लिए, उच्चतम तीव्रता बिन में डेटा अंक (जो घटनाओं है कि पता लगाने के गतिशील रेंज से परे हैं शामिल हैं) का विश्लेषण नहीं किया जाना चाहिए.

7. डेटा विश्लेषण

  1. शुद्ध दाता संकेत और monomeric DsRed2 के लिए एक गैर-photoconverted mEos3.1 नमूने का उपयोग कर मुआवजा प्रदर्शन, जो mEos3.1 के लाल रूप के लिए एक समान स्पेक्ट्रम है, शुद्ध स्वीकारकर्ता संकेत13के लिए . अधिक संवेदनशीलता के लिए, सुनिश्चित करें कि FRET डिटेक्टर चैनल भी एक spillover लक्ष्य के रूप में माना जाता है, विश्लेषण कार्यक्रम में.
  2. गेट नमूने केवल एकल कोशिकाओं जो फ्लोरोसेंट सकारात्मक हैं का चयन करने के लिए (चित्र 2के रूप में)।
  3. कुल FRET संकेत (488ex/595em) कुल FRET स्वीकारकर्ता (561ex/595em) संकेत से विभाजित के अनुपात के रूप में AmFRET पैरामीटर की गणना करें।
  4. प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को विज़ुअलाइज़ करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: इस अध्ययन में एस cerevisiae के लिए Cytosolic सांद्रता खान एट अल8के रूप में नीचे सेटिंग्स के साथ गणना की गई. डेटा विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)।

Representative Results

पंचक नहीं बनाने वाले ओलिगोमरों की जांच

हम पहले प्रोटीन चरण जुदाई की विशेषता के लिए DAmFRET लागू किया है, जो आम तौर पर बड़े प्रोटीन विधानसभाओं कि भी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है के गठन में परिणाम. विवर्तन-सीमित प्रोटीन विधानसभाओं के लिए DAmFRET की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, हम एक जैव रासायनिक अच्छी तरह से विशेषता प्रोटीन है कि असतत होमो-heptamers कि अभी तक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने के लिए बहुत छोटे हैं रूपों का विश्लेषण किया: मानव सह-चैपरोनिन, HSPE114| हम अकेले mEos3.1 व्यक्त खमीर कोशिकाओं के DAmFRET प्रोफाइल की तुलना में, या HSPE1-mEos3.1. उत्तरार्द्ध में एक समान धनात्मक एमफ्रेट मानों का प्रदर्शन किया गया, जबकि पूर्व में नगण्य एमफ्रेट का प्रदर्शन किया गया (चित्र 3क) इमेजिंग प्रवाह साइटोमीटर द्वारा अधिग्रहीत कोशिकाओं की छवियों (सामग्री की तालिकादेखें ) सभी चैनलों में फैलाना फ्लोरोसेंट से पता चला-दाता, FRET और स्वीकारकर्ता, दोनों के लिए mEos3.1- और HSPE1-mEos3.1-व्यक्त कोशिकाओं (चित्र 3B)। उच्च ऑप्टिकल संकल्प पर इस खोज की पुष्टि करने के लिए, हम confocal माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया z-स्टैक कोशिकाओं के कई क्षेत्रों के लिए कब्जा करने के लिए. वास्तव में, फ्लोरोसेंट समान रूप से cytosol भर में वितरित किया गया था, कोई डिटेक्टेबल puncta के साथ, चाहे कोशिकाओं HSPE1-mEos3.1 व्यक्त या फ्लोरोफोर अकेले (चित्र 3C) . ध्यान दें कि HSPE1 की विशेषता Kd लगभग है 3 डिग्री सेल्सियस जो हमारे सिस्टम की संवेदनशीलता से थोड़ा नीचे है, और इसलिए हम एकाग्रता है कि इस असतत होमो-ओलिगोमर के लिए उम्मीद की जाएगी FRET के sigmoidal संबंध का पालन नहीं करते. फिर भी, हम निष्कर्ष है कि DAmFRET मजबूती से एक सेल संकल्प में विवो में घुलनशील होमो-ओलिगोमराइजेशन का पता लगाता है।

न्यूक्लिएशन-सीमित विधानसभाओं की जांच

DAmFRET की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए इस तरह के prions के रूप में nucleation-सीमित विधानसभाओं से असतत होमो-ओलिगोमर भेद करने के लिए, हम मानव inflammasome प्रोटीन एएससी का विश्लेषण किया. जबकि WT ए एससीपीवाईडी विवो मेंफिलामेंट बनाता है , ए एस सीपीवाईडी के निष्क्रिय R41E उत्परिवर्ती9,10नहीं करता है . हम खमीर कोशिकाओं में व्यक्त या तो mEos3.1 अकेले, या mEos3.1 या तो WT या R41E ए एससीPYDके लिए जुड़े. खमीर कोशिकाओं अकेले fluorophore व्यक्त या ASCPYD के उत्परिवर्ती रूप पूरे एकाग्रता रेंज पर नगण्य AmFRET प्रदर्शन किया, आत्म बातचीत करने के लिए एक असमर्थता का संकेत. इसके विपरीत, WT ASCPYD दो आबादी के साथ एक DAmFRET प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन किया: नगण्य AmFRET के साथ एक और उच्च AmFRET के साथ अन्य (चित्र 4A)। जैसा कि फ्लोरोसेंट छवियों (चित्र 4ख)द्वारा पुष्टि की गई है, ये जनसंख्या उन कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं जिनमें केवल घुलनशील प्रोटीन होता है या इसके बजाय इनमें क्रमशः अधिकांश स्व-संयोजित प्रोटीन होता है। आबादी के बीच असंबद्ध संबंध, और तथ्य यह है कि वे ओवरलैपिंग सांद्रता में पाए जाते हैं इंगित करता है कि एक नाभिकन बाधा प्रोटीन के एकमेव रूप स्थिर और यह प्रयोग की अवधि में कोडांतरण से रख सकते हैं 8.दो आबादी के बीच एमफ्रेट में अंतर यह इंगित करता है कि एक बार न्यूक्लिएशन होने के बाद, यह अन्य मोनोमरों को इकट्ठा रूप में ले जाता है और एमफ्रेट का एक नया स्थिर राज्य स्तर प्राप्त करता है। DAmFRET पूर्व संरचनात्मक डेटा की पुष्टि की है कि बिंदु उत्परिवर्ती ए एस सीPYD R41E इस अभिव्यक्ति प्रणाली द्वारा प्राप्त सांद्रता भर में नाभिक भंग (चित्र 4A) .

स्तनधारी कोशिकाओं में DAmFRET की प्रयोज्यता

हालांकि खमीर कोशिकाओं DAmFRET के लिए आदर्श मेजबान कोशिकाओं रहे हैं, हम स्तनधारी कोशिकाओं के लिए DAmFRET की प्रयोज्यता का विस्तार करने के लिए वांछित. आदेश कार्यात्मक एएससी पॉलिमर की वजह से सेल मौत से बचने के लिए, हम HEK293T कोशिकाओं है कि caspase-1 अभिव्यक्ति की कमी में DAmFRET परीक्षण किया। हमने HEK293T कोशिकाओं में वही प्रोटीन व्यक्त किए जैसा कि हमने चित्र 4कमें खमीर कोशिकाओं में किया था . HEK293T कोशिकाओं में परिणामी DAmFRET प्रोफाइल गुणात्मक खमीर कोशिकाओं में उन समान (चित्र 4A,सी) DAmFRET, इस प्रकार, का पता लगाने और उच्च थ्रूपुट के साथ एकल सेल संकल्प पर nucleated प्रोटीन आत्म-एसेंबली की मात्रा का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए विवो विधि में सबसे बहुमुखी के रूप में कार्य करता है दोनों सूक्ष्म रूप से दिखाई puncta के रूप में अच्छी तरह से सेल प्रकार की उपस्थिति के बावजूद.

Figure 1
चित्र 1 : के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का अवलोकन एस सेरेविएसियाई| यह आंकड़ा खान एट अल8 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है. (ए) 2 ] प्लाज्मिड मानचित्र जिसमें ब्याज के प्रोटीन के लिए खुला पठन फ्रेम दिखाया गया है, जो फोटोकन्वर्टिबल एमईओएस3.1 के साथ टैग किया गया है और एक प्रेरक प्रवर्तक द्वारा संचालित है। (बी) जब खमीर कोशिकाओं में तब्दील, प्रतिकृति के 2 डिग्री प्रणाली कोशिकाओं के बीच उच्च प्रतिलिपि संख्या परिवर्तनशीलता की ओर जाता है. यह भिन्नता, GAL1 प्रमोटर से प्रतिलेखन शोर के साथ संयुक्त, कोशिकाओं की आबादी में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक व्यापक वितरण में परिणाम. (सी) खमीर DAmFRET परख के लिए प्रायोगिक अवलोकन. परख के लिए स्वस्थ कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए, कालोनियों पहले गैर-प्रेरित कार्बन स्रोत, डेक्सट्रोज युक्त सिंथेटिक मीडिया में 16 एच से अधिक प्रसार के लिए टीका लगाया जाता है। प्रसार के बाद, कोशिकाओं को सिंथेटिक मीडिया को स्थानांतरित कर रहे हैं जिसमें 16 एच के लिए प्रेरित कार्बन स्रोत, गैलाक्टोज, शामिल हैं। प्रेरण के बाद, कोशिकाओं को आंशिक रूप से और समान रूप से 405 एनएम प्रकाश के लिए जोखिम द्वारा photoconverted हैं. (डी) नमूने तो इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं. स्पेक्ट्रा और हरे और लाल mEos3.1 की तीव्रता उन्हें क्रमशः एक FRET दाता और स्वीकारकर्ता के लिए अच्छी तरह से अनुकूल प्रदान करते हैं. जब एक दूसरे के करीब निकटता में, के रूप में नीचे कोशिका में चित्रित बहुलक में होता है, लाल अणुओं हरे अणुओं की उत्तेजना पर फ्लोरोसेंट होगा (FRET). (ई) दाता बनाम स्वीकारकर्ता तीव्रता का प्लॉट, जो प्रकाश परिवर्तन पर एक तंग रैखिक संबंध दर्शाता है, यह दर्शाता है कि प्रकाश परिवर्तन की दक्षता अभिव्यक्ति स्तर से प्रभावित नहीं होती है। (च) मध्य-अभिस्वीकारकर्ता बनाम दाता तीव्रता कोशिकाओं की आवयकता से विभिन्न प्रकार के एमईओ-टैग किए गए प्रोटीनों को घुलनशील और एमिलॉयड दोनों रूपों में व्यक्त करता है, जो यह दर्शाता है कि प्रकाश परिवर्तन की दक्षता संलयन से प्रभावित नहीं होती है साथी या विलेयता (त्रुटि सलाखों जैविक triplicates के मानक विचलन से संकेत मिलता है). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के लिए DAmFRET gating रणनीति। Gating रणनीति केवल ध्यान केंद्रित विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया, unbudded एकल कोशिकाओं जो कम autofluorscence है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं. (क) विश्लेषण के लिए सुकेंद्रित, जीवित, एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए द्वारों का पदानुक्रम। (ख) ब्राइटफील्ड चैनल के ग्रेडिएंट आरएमएस का हिस्टोग्राम। यह माप कोशिकाओं के चयन के लिए अनुमति देता है जो ठीक से संचारित प्रकाश के तहत ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. (ग) परिपत्र बनाम क्षेत्र का घनत्व आकांधीय क्षेत्र जो अबडित गोलाकार एकल कोशिकाओं की गेटेड जनसंख्या दर्शाता है। (घ) घनत्व आलेख जो स्व-प्रवाह (च07) बनाम दाता फ्लोरोसेंट (च02) तीव्रता दर्शाता है कि व्यक्त कोशिकाओं (गेटेड) और डार्क कोशिकाओं की अलग-अलग जनसंख्या है। (ई) दाता बनाम ग्राही तीव्रता का स्कैटर आलेख कोशिकाओं के सबसेट में दाता फ्लोरोसेंट में स्पष्ट हानि दर्शाता है, जिसके परिणामस्वरूप दाता और स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर्स के बीच FRET उत्पन्न होता है। (च) अंतिम DAmFRET साजिश. असंयोजित प्रोटीन युक्त कोशिकाएं शून्य एमफ्रेट के चारों ओर केंद्रित होती हैं, जबकि स्वयं इकट्ठे प्रोटीन युक्त कोशिकाएं एक सकारात्मक एमफ्रेट मान प्रदर्शित करती हैं। साजिश में दो ओवरलैपिंग आबादी ऐसे amyloids के रूप में उच्च क्रम विधानसभाओं में है कि प्रोटीन nucleating के लिए एक परिमित बाधा का संकेत है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा मोनोमेरिक और हेप्टेमेरिक प्रोटीन के प्रतिनिधि डेटा। (ए) मोनोमेरिक मेओस3.1 प्रोटीन (बाएं) और हेप्टेमेरिक एचएसपीई1 की डामफ्रेट प्रोफाइल को समरूपी असेंबली से उत्पन्न होने वाले गुणांकित अनुपात को दर्शाता है। (बी) साइटोमीटर से छवियाँ, सभी कैप्चर किए गए चैनलों में दिखाए गए mEos3.1 (बाएं) और HSPE1 (दाएं) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की। (ग) खमीर कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों monomeric mEos3.1 (बाएं) और HSPE1 (दाएं) व्यक्त. छवियों confocal स्लाइस के योग अनुमानों हैं. इस प्रेक्षण की पुष्टि करने के लिए कम से कम पचास कोशिकाओं की छवि थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : DAmFRET प्रोफाइल मानव एएससीPYD के इसी तरह के आत्म विधानसभा व्यवहार दिखा प्रोटीन में एस सेरेविएसिया और HEK293T कोशिकाओं. (ए) एमफ्रेट बनाम साइटोसोलिक सांद्रता (जेडएम में) को दिखाते हुए घनत्व भूखंडों (जेडएम में) एमईओएस3.1 (बाएं) या एमईओएस3.1 डब्ल्यूटी (सेंटर) या एस सेरेविसेई में एएससीपीवाईडी (दाएं) के एकमेव उत्परिवर्ती को दर्शाता है। (बी) साइटोमीटर से छवियाँ, निचले और ऊपरी फाटकों से कोशिकाओं की (बाएं और केंद्र पैनल, क्रमशः) WT ASCPYDव्यक्त ; और संकेत गेट (दाएं पैनल) के एएससीPYD R41E व्यक्त कोशिकाओं की. (ग) घनत्व के भूखंडों में प्रोटीन की उसी श्रृंखला के लिए एमफ्रेट बनाम स्वीकारकर्ता तीव्रता को दर्शाता है (क) लेकिन HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

DAmFRET विवो में प्रोटीन स्वयं विधानसभा का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक तरीका है। DAmFRET एकाग्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर homotypic प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के प्रत्यक्ष पढ़ने के बाहर को जोड़ती है, एकल सेल संकल्प और उच्च थ्रूपुट के साथ. DAmFRET के प्रत्यक्ष पठन-आउट और तथ्य यह है कि जुड़े प्रोटीन एक विशिष्ट subcellular स्थानीयकरण या अघुलनशील राज्य की आवश्यकता नहीं है झूठी सकारात्मक समाप्त और उनके मूल subcellular स्थानों पर प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपनी प्रयोज्यता फैली हुई है. विशेष रूप से, fluorophores कि इस तरह के टी Sapphire और mCardinal के रूप में mEos3.1 के साथ वर्णक्रमीय संगत कर रहे हैं के साथ organelles टैगिंग द्वारा, घुलनशील और प्रोटीन के इकट्ठे रूपों के subcellular स्थानीयकरण DAmFRET के साथ निर्धारित किया जा सकता है.

यहाँ वर्णित के रूप में इमेजिंग प्रवाह cytometer का उपयोग करना, यह लेता है 8 एच एक 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति लगभग 20,000 gated कोशिकाओं के साथ प्लेट का विश्लेषण करने के लिए. हालांकि, हम भी नियमित रूप से मानक (गैर-इमेजिंग) cytometers कि बहुत अधिक थ्रूपुट (प्रति मिनट 20 नमूने तक) को प्राप्त करने के साथ DAmFRET प्रदर्शन करते हैं। वास्तव में, स्थानिक रूप से अलग 488 और 561 एनएम लेज़रों के साथ किसी भी प्रवाह साइटोमीटर कि लॉग amp कलाकृतियों से मुक्त है और उचित PMTs और दाता का पता लगाने के लिए फिल्टर है, FRET, और स्वीकार करने वाले संकेतों के लिए पर्याप्त है DAmFRET प्रदर्शन करने के लिए. वर्तमान में, throughput में यह लाभ स्थानीयकरण जानकारी और मात्रा निर्धारण की कीमत पर आता है, इस तरह है कि आत्म विधानसभा तो एकाग्रता के बजाय प्रोटीन अभिव्यक्ति के एक समारोह के रूप में विश्लेषण किया जाना चाहिए. यह गुणात्मक विश्लेषण के लिए कोई समस्या नहीं है। इसके अतिरिक्त, यह एक अंतर्जात "हाउसकीपिंग" प्रोटीन जिसका अभिव्यक्ति कसकर cytosolic मात्रा के साथ संबंधित करने के लिए एक वर्णक्रमीय अलग फ्लोरोफोर fusing द्वारा cytosolic मात्रा का अनुमान लगाने के लिए संभव हो सकता है.

जैसा कि हम दोनों खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में DAmFRET की हमारी तैनाती के माध्यम से प्रदर्शन किया है, DAmFRET आसानी से विभिन्न अभिव्यक्ति प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह प्रोटीन के आत्म विधानसभा उनके मूल सेलुलर संदर्भों में अध्ययन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, यह व्यापक रूप से भिन्न सेल संस्कृति मॉडल भर में प्रोटीन विधानसभा की तुलना करने की क्षमता प्रदान करता है तंत्र है कि प्रोटीन स्वयं विधानसभा शासन के संरक्षण का अध्ययन.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

हम जेफ लैंग, जे Unruh, Jianzheng वू, तारिक खान, और एलेन Ketter परख के विकास की दिशा में अपने काम के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम को पूरा करने के लिए किया गया था, भाग में, T.S.K. और A.R.G के लिए पीएचडी थीसिस अनुसंधान के लिए आवश्यकताओं के रूप में मुक्त विश्वविद्यालय, ब्रिटेन के साथ पंजीकृत छात्रों, और चिकित्सा अनुसंधान स्नातक स्कूल, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए Stowers संस्थान, क्रमशः. अतिरिक्त परख से संबंधित जानकारी https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016 में पाया जा सकता है. इस पांडुलिपि अंतर्निहित मूल डेटा http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 पर Stowers मूल डेटा भंडार से पहुँचा जा सकता है. इस काम NIH निदेशक के प्रारंभिक स्वतंत्रता पुरस्कार DP5-OD009152, Dimes फाउंडेशन अनुदान संख्या 5-FY17-32 के मार्च, और चिकित्सा अनुसंधान के लिए Stowers संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

लेखक योगदान इस प्रकार हैं. संकल्पना: T.S.K., S.V., और R.H.; विधि: T.S.K., S.V., A.R.G., और A.B.; जांच: S.V., T.S.K., और A.R.G.; औपचारिक विश्लेषण: एस.वी., और टी.एस.के.; डेटा करनिर्धारण: T.S.K.; विज़ुअलाइज़ेशन: T.S.K, और S.V., लेखन (मूल ड्राफ्ट): S.V., और T.S.K.; लेखन (समीक्षा, संपादन): R.H., S.V., और T.S.K.; और अनुदान अधिग्रहण: आर.एच.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 Well Plate Axygen P96-450R-C-S
ASC 2-92 (mammalian plasmid) rhm1.0095 Available on request
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) rhm1.0096 Available on request
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) rhx2432 Available on request
ASC 2-92 (yeast plasmid) rhx2431 Available on request
Centrifuge Eppendorf 5430R "centrifuge" in text
CSM -Ura Sunrise Science Products 1004-100
Dextrose EMD Millipore DX0145-5
DMEM Gibco 11966025
EDTA Sigma-Aldrich EDS-500G
FCS Express 6 DeNovo FCS Express 6 Flow "flow cytometry software" in text
Fetal Bovine Serum VWR Life Science 45001-108
Flow Cytometer BioRad ZE5 Non-imaging flow cytometer
FUGENE HD Promega E2311 "transfection reagent" in text
Galactose VWR Life Science 0637-500g
HSPE1 (yeast plasmid) rhx1531 Available on request
Imaging Flow Cytometer EMD Millipore ImageStream X Mark II "imaging flow cytometer" in text
Mammalian Cells HEK293T
mEos3.1 (mammalian plasmid) rhm1 Available on request
mEos3.1 (yeast plasmid) rhx0935 Available on request
optiMEM Gibco 31985062 "reduced serum media" in text
PBS VWR Life Science 45000-446
PenStrep Gibco 15070063
PFA Sigma-Aldrich P6148-1KG
Photoconversion Lamp OmniCure S1000
Plasmid #54525 Addgene #54525 "publicly available plasmid" in text
Titramax 1000 Plate Shaker Heidolph Instruments 1000 "plate shaker" in text
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
Yeast Strain rhy1713 Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX)

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References

  1. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
  2. Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
  3. Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
  4. Matthews, J. M., Sunde, M. Dimers, oligomers, everywhere. Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).
  5. Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  6. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  7. Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
  8. Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
  9. Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  10. Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  11. Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
  12. Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425 (1992).
  13. Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
  14. Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).

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जीव विज्ञान अंक 149 फ्लो साइटोमेट्री FRET प्रोटीन एकत्रीकरण चरण जुदाई नाभिक प्रोटीओस्टेसिस
प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विवो में प्रोटीन स्व-असेम्बली का पता लगाने और विशेषता
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Venkatesan, S., Kandola, T. S., Rodríguez-Gama, A., Box, A., Halfmann, R. Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (149), e59577, doi:10.3791/59577 (2019).

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