Summary
Denne artikkelen beskriver en bånd-basert flyt flowcytometri protokoll til å kvantifisere protein selv montering i både S. cerevisiae og HEK293T celler.
Abstract
Protein selv montering regulerer protein funksjon og compartmentalizes cellulære prosesser i rom og tid. Nåværende metoder for å studere den lider av lav-følsomhet, indirekte lese-outs, begrenset gjennomstrømning, og/eller befolkning-nivå i stedet for én celle oppløsning. Vi har utformet en flyt flowcytometri enkelt metodikk som tar for oss alle disse begrensningene: distribuert Amphifluoric bånd eller DAmFRET. DAmFRET oppdager og kvantifiserer protein selv-forsamlinger av sensibilisert utslipp bånd in vivo, muliggjør distribusjon på tvers av modellsystemer-fra gjær til menneskelige celler-og oppnår sensitiv, enkelt celle, høy gjennomstrømming lese-outs uavhengig av protein lokalisering eller løselighet.
Introduction
Analyser for å studere homotypic protein interaksjoner, eller "selv montering" er viktig fordi oligomer tilstand og løselighet av proteiner dikterer deres funksjon. Proteom overflod med homo-multimers1,2,3,4, mens relativt få proteiner fungerer som monomerer. Proteiner kan også montere aberrantly på grunn av stress, alder eller misregulation, noe som fører til patologiske forandringer i aktivitet. Identifisering av faktorene som modulere slike hendelser, eller til og med den fysiske karakteren til samlingene, er ofte svært utfordrende.
Et økende antall proteiner er nå anerkjent for å montere selv med ekstraordinære cooperativity og ubestemmelig støkiometri, noe som resulterer i deres demixing fra andre cellulære bestanddeler, som protein tette faser. Disse tar form av relaterte kondensat, som dråper og gels, eller svært bestilte filamenter, slik som amyloid fibre. De conformational svingninger knyttet til sistnevnte gjengi sin opprinnelige formasjon, eller kjernedannelse, iboende sannsynlighetsbasert på molekylær nivå5,6. Fordi sannsynligheten for kjernedannelse skalaer med volum, kan dannelsen av slike forsamlinger være svært Stokastisk i den romlige rammen av levende celler7,8. På det ekstreme av Stokastisk kjernedannelse-begrenset fase separasjon er prioner, høyt bestilte protein forsamlinger som bare sjelden nucleate spontant, men når dannet, mal sin egen vekst på ubestemt tid. En slik protein, kjent som ASC, utfører en digital Prion-lignende bryter i aktiviteten av pattedyr medfødte immunceller. ASC selv-montering er kjerne av sin interaksjon med bestemte proteiner som har selv oligomerized upon bindende patogen-eller fare-assosiert molekylær mønstre. Den ASC forsamlinger i sin tur nucleate procaspase-1 til selv montere og aktivere, fører til cytokin modning og pyroptosis av cellen9,10. Regionen av ASC ansvarlig for sin forsamling tilhører død domenet overfamilie, som består av over 100 medlemmer i den menneskelige proteom. Til tross for sentrale roller døden domener i medfødt immunitet og programmert celle død, de fleste av dem har ennå ikke vært preget med hensyn til selv-montering. Oppdagelsen og karakterisering av ytterligere proteiner med slik atferd vil bli sterkt tilrettelagt av en direkte, enkelt celle avlesning av protein selv-montering.
Klassisk protein biokjemi tilnærminger for å studere protein selv montering, slik som størrelses ekskludering kromatografi og ultracentrifugation, er i stor grad begrenset til befolkningsnivå vurderinger. Celle-til-celle-heterogenitet som er et resultat av en kjerne-begrenset faseovergang kan imidlertid ikke være modellert med dette detaljnivået. Enkelt celle tilnærminger basert på fluorescens mikroskopi gjenvinne denne evnen, men mangler gjennomstrømningen nødvendig for å nøyaktig kvantifisere kjernedannelse eller for å oppdage sjeldne forsamlinger. Videre, løselig selv-forsamlinger som de fleste enzymer og pre-amyloid oligomers, er for små og mobile å bli løst ved standard lys mikroskopi. De kan oppdages av mer sofistikerte tilnærminger som fluorescens korrelasjon spektroskopi, men disse er svært begrenset i celle nummer og gjennomstrømning.
Nærhets BAS ert analyser av protein montering, for eksempel bånd og splitt fluoroforen komplementering, tilbyr en potensiell løsning på disse problemene. Men de vanligvis krever bruk av to forskjellige konstruksjoner uttrykker protein av interesse smeltet til komplementære Tags-donor og Acceptor fluorophores i tilfelle av bånd. Dette kompromisser eksperimentell gjennomstrømning og reduserer også følsomheten på grunn av celle-til-celle-variasjon i de relative nivåene av donor-og Acceptor. For å omgå dette, utviklet vi en analyse som sysselsetter en photoconvertible fluoroforen, mEos 3.111, som tillater en enkelt konstruere å uttrykke både donor-og Acceptor-merket protein. Utslipps spekteret av uomvendte mEos 3.1 (GFP-lignende giver) er tilstrekkelig overlapper med det eksitasjon spekteret av photoconverted mEos 3.1 (dsRed-lignende Acceptor) for å tillate bånd til å forekomme når molekylene er i umiddelbar nærhet (< 10 NM). Således, ved å utsette celler til en empirisk bestemt dose av 405 NM lys, som photoconverts en optimal brøkdel av total mEos 3.1 i Acceptor form, oppnår vi konsistent og reproduserbar relative nivåer av donor og Acceptor på tvers av flere prøver, uttrykks nivåer og eksperimenter. Vi måler Acceptor fluorescens når opphisset enten direkte med 561 NM lys, eller indirekte (ved energi overføring fra donor) med 488 NM lys (dvs. sensibilisert utslipp bånd). Vi rapporterer protein forsamlingen som forholdet mellom disse to verdiene og begrepet det amphifluoric bånd eller AmFRET.
For å beregne proteinkonsentrasjon ved flyt flowcytometri vi først beregne gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av Spc42 merket med mEos 3.1. Fordi gjærceller inneholder ca 1000 molekyler av Spc42, vi deretter beregne fluorescens intensiteten av en enkelt fluorescerende grønt mEos 3.1 molekyl. Ved å utnytte den jevne photoconversion ved alle cellulære konsentrasjoner (fig. 1e), vi deretter relatere total meos 3.1 fluorescens verdier for alle Acceptor intensitet etter photoconversion. Vi er da i stand til å dele det totale antall føflekker av fluorescerende proteiner ved omtrentlig cytosolic volum (som bestemmes ved hjelp av Imaging Flow flowcytometri) for å få den totale cytosolic konsentrasjon av protein av interesse. For nøyaktige beregninger, vennligst se det opprinnelige manuskriptet8.
Ved å uttrykke mEos 3.1-smeltet protein fra en 2μ plasmider i gjær, sonde vi en ca tusen-fold utvalg av proteinkonsentrasjon i hver prøve8. Vi oppnår det samme i HEK293T celler i kraft av variasjon i plasmider opptak under transfeksjoner, og dermed variabel kopi nummer.
Den resulterende fordelingen av AmFRET, eller DAmFRET, for mange tusen celler avslører konsentrasjonen-avhengighet av selv-montering i stoffer for noen protein av interesse. Samlet representerer DAmFRET en slik metodikk for å oppdage og karakterisere protein selv montering med en enestående kombinasjon av følsomhet, gjennomstrømning og reproduserbarhet.
Mens du bruker et bilde flowcytometer, kan vi oppnå in vivo protein konsentrasjons målinger, slik cytometers er ennå ikke tilgjengelig på de fleste forskningsinstitusjoner. Likevel kan DAmFRET kjøres selv i en typisk ikke-tenkelig flowcytometer å få distribusjoner av protein forsamlingen over omfanget av protein uttrykk.
Protocol
1. utarbeidelse av Saccharomyces cerevisiae for DAmFRET analysen
- Transform eksperimentelt relevante gjær stammer med en 2μ galaktose-induserbart plasmider som uttrykker protein av interesse8 merket enten på C eller N Terminus med meos 3.1 ved hjelp av en standard litium acetate protokoll12 .
- Vokse gjær i flytende kultur.
- For hver spørring protein, vaksinere gjær kolonier (forvandlet), i tre eksemplarer, hver i 200 μL av passende ikke-inducing vekst medier (dvs. medier som inneholder 2% druesukker, gjær nitrogen base og aminosyrer for valg av plasmider) i en 96-brønn plate ( Figur 1C).
- Ruge celler mens du rister på en plate shaker (se tabell over materialer) med 1,5 mm bane ved 1200 RPM ved 30 ° c i 16 timer.
- Indusere uttrykk for det genet av interesse (representativ protokoll for 16 h-noen proteiner kan ta mer eller mindre tid).
- Etter 16 h av induksjon, snurr platen ved 2200 x g i 2 min ved romtemperatur (RT0 til pellets prøvene.
- Fjern medier ved å vende kraftig. Resuspend celler med 200 μL av passende induksjon Media (dvs. medier som inneholder 2% galaktose, gjær nitrogen base og aminosyrer for valg av plasmider). Se figur 1C.
- Ruge celler mens du rister ved 30 ° c i 12 timer.
- Sentrifuger (se tabell over materialer) platen ved 2200 x g for 2 min ved RT til pellets prøvene. Fjern medier ved å vende kraftig. Resuspend celler med 200 μL av induksjon Media.
- Ruge celler mens du rister ved 1200 RPM ved 30 ° c for ytterligere 4 timer. Denne blanding inne frisk Media burde finne sted 4 h tidligere å running DAmFRET, for at nedskrive autofluorescence.
2. pattedyr plasmider skapelse
- Konstruere en pattedyr vektor som har en konstituerende promoter og mEos 3.1 med en plassholder for å sette inn genet av interesse og en linker i mellom dem.
Merk: vi konstruerte en gylden gate kompatibel vektor, M1, fra en offentlig tilgjengelig plasmider (se tabell over materialer) med følgende modifikasjoner: en eksisterende BsaI området ble fjernet av et punkt mutasjon G til a (i posisjon 3719 som per deponert rekkefølge). mEos 3.1 ble innhentet ved hjelp av site-regissert mutagenese av fluoroforen på I157V. Invertert BsaI nettsteder etterfulgt av 4X (EAAAR) linker ble satt inn, av Gibson forsamlingen, i-rammen mellom CMV promoter og mEos 3.1 for å produsere den endelige M1 vektor. Protein uttrykk er drevet av CMV Enhancer og promoter; og transkripsjon oppsigelse av SV40 polyadenylation signal. - Lag et bibliotek av innsatser, kompatibel med den konstruerte vektoren.
Merk: vi bestiller våre innsatser for Golden Gate montering som syntetiske lineære fragmenter (se tabell over materialer) flankert av BsaI nettsteder for ligation til M1 mellom CMV promoter og 4X (EAAAR)-mEos 3.1.
3. pattedyr cellekultur og transfeksjoner
- Kultur HEK293T celler i DMEM + 10% FBS + 1x PenStrep Media ved 37 ° c ved 5% CO2.
- På dagen før transfeksjoner, frø 5 x 105 celler i en 6-brønn plate med 2 ml medier.
- Transfect celler med 2 mikrogram plasmider DNA ved hjelp av en transfeksjoner reagens (se tabell over materialer) i forholdet 3:1 (transfeksjoner REAGENS: DNA). Bland komponentene i 150 μL av reduserte serum medier (se tabell over materialer) og ruge den ved RT i 15 minutter, tilsett blandingen i hver brønn og ruge for 48 h for protein uttrykk.
- Bekreft protein uttrykk etter 24 h ved epifluorescence mikroskopi (488 NM eksitasjon, 515 NM utslipp).
4. utarbeidelse av pattedyrceller for DAmFRET analysen
- Etter 48 h av protein uttrykk, Fjern medier fra hver brønn og vask forsiktig celler med 1 mL 37 ° c fosfat-bufret saltvann (PBS). Etter vask, aspirer PBS.
- Tilsett 0,5 mL Trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (0,25%) og ruge i 5 min ved 37 ° c.
- Tilsett 0,5 mL komplett DMEM Media til hver brønn, resuspend celler og sikre at ingen store klumper er synlige.
- Overfør hele volumet av hver brønn i 1,5 mL rør.
- Spin celler i 5 min ved 1000 x g ved romtemperatur (RT).
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
- Snurr cellene i 5 minutter ved 1000 x g ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) + 10 mM EDTA i PBS.
- Fix celler for 5 min på en Shake bord med konstant bevegelse.
- Spin celler i 5 min ved 1000 x g ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
- Spin celler i 5 min ved 1000 x g ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspend cellene i tilstrekkelig volum av buffer for flowcytometri kjøre (for 1 brønn av en 96-brønn plate bruk 200 μL av PBS + 10 mM EDTA).
- Overfør de resuspendert cellene til en brønn av en rund bunn 96-brønn plate.
5. Photoconversion av gjær og pattedyrceller for analysen
- Photoconvert prøver i en mikroplate uten deksel ved hjelp av en UV-lampe (se tabell over materialer) utstyrt med et 320-500 NM (fiolett) filter og en bjelke parallelliseringsoptikk, plassert 45 cm over platen, for en varighet på 25 min mens risting. Disse forholdene er hensiktsmessige når strålen strøm på platen er 11,25 mW/cm2, med ca 17 000 mJ/cm2 av totalt Foton dose8.
6. DAmFRET datainnsamling
- Analysen celler ved hjelp av en flowcytometer med ikke-kollineare 488/561 lasere. Følgende data er minimumskravene for beregning av bånd.
- Bruk en 488 NM eksitasjon/515 NM utslipps kanal for innsamling av donor fluorescens.
- Bruk en 488 NM eksitasjon/595 NM utslipps kanal for innsamling av fluorescens av bånd signalet.
- Bruk en 561 NM eksitasjon/595 NM utslipps kanal (ikke-kollineare med 488/595 kanal) for innsamling av Acceptor fluorescens.
- Bruk en 405 NM eksitasjon/457 NM utslipps kanal for innsamling av autofluorescence8.
- Bruk en brightfield bilde kanal for volum beregning.
Merk: Imaging flowcytometer-innstillinger for S. cerevisiae er som følger: 60x objektiv med lav strømningshastighet og høy følsomhet; laser krefter satt til 405 NM ved 15 mW, 488 NM ved 15 mW, 561 NM ved 20 mW. Imaging flowcytometer innstillinger for HEK293T celler er som følger: 40x mål ved lav strømningshastighet og høy følsomhet; laser krefter satt til 405 NM ved 15 mW, 488 NM ved 15 mW, 561 NM ved 20 mW. også oppmerksom på at vår Imaging flowcytometer var spesialdesignet for å ha romlig separert 488 NM og 561 NM lasere (dvs. på forskjellige kameraer) for å oppnå klar oppløsning av bånd fra Acceptor fluorescen Ce.
- Samle data for 20000-50000 enkeltceller per prøve innenfor en fluorescens positiv port.
- Gate enkeltceller med et høyt størrelsesforhold og et lite celleområde i motsetning til klumpet seg celler eller rusk som ville ha lavt størrelsesforhold og store eller svært små celleområder hhv.
Merk: tilsvarende parametre i en ikke-Imaging flowcytometer er FSC (Forward scatter) for omtrentlig Cellestørrelse og SSC (side scatter) for celle detalj. I tillegg bruker FSC puls høyde versus pulsbredde som en proxy for enkelt celle gating. I tillegg er det avgjørende å ikke samle hendelser som har fluorescens verdier utover den øvre grensen for følsomheten til flowcytometer. I vår Imaging flowcytometer, begrenser vi samling av hendelser til en rå maksimal pikselverdi på en mindre enn metning grensen for hver fluorescerende kanal vi samler. På samme måte bør ikke datapunkter i hyllen med høyest intensitet (som inkluderer hendelser som er utenfor det dynamiske området for gjenkjenning) analyseres, for konvensjonelle flyt cytometers.
- Gate enkeltceller med et høyt størrelsesforhold og et lite celleområde i motsetning til klumpet seg celler eller rusk som ville ha lavt størrelsesforhold og store eller svært små celleområder hhv.
7. data analyse
- Utfør kompensasjon ved hjelp av et ikke-photoconverted mEos 3.1-utvalg for det rene giver signalet og monomere DsRed2, som har et lignende spektrum til den røde formen av mEos 3.1, for det rene Acceptor signalet13. For mer følsomhet, sørg for at bånd detektor kanalen også betraktes som et smitteeffekter mål, i analyseprogrammet.
- Gate prøver å velge bare enkeltceller som er fluorescens positive (som i figur 2).
- Beregn AmFRET parameteren som forholdet mellom totalt bånd signal (488ex/595em) dividert med den totale bånd Acceptor (561ex/595em) signal.
- Visualiser data ved hjelp av en flyt flowcytometri programvare (se tabell over materialer).
Merk: cytosolic konsentrasjoner for S. cerevisiae i denne studien ble beregnet med innstillingene nedenfor som i Khan et al.8. Data analyse ble utført ved hjelp av Flow flowcytometri programvare (se tabell over materialer).
Representative Results
Påvisning av oligomers som ikke danner puncta
Vi har tidligere brukt DAmFRET for karakterisering av protein fase separasjon, noe som vanligvis resulterer i dannelsen av store protein forsamlinger som også kan oppdages av fluorescens mikroskopi. For å demonstrere anvendelsen av DAmFRET til Diffraksjon-begrensede protein forsamlinger, analyserte vi en biokjemisk godt preget protein som danner diskrete homo-heptamers som er altfor små til å bli visualisere av lys mikroskopi: den menneskelige co-chaperonin, HSPE114. Vi sammenlignet DAmFRET profiler av gjærceller som uttrykker mEos 3.1 alene, eller HSPE1-mEos 3.1. Sistnevnte viste uniform positive AmFRET verdier, mens den tidligere utstilt ubetydelig AmFRET (figur 3a). Bildene av celler ervervet ved Imaging Flow flowcytometer (se tabell over materialer) avslørte diffuse fluorescens i alle kanaler-DONOR, bånd og Acceptor, for både meos 3.1-og HSPE1-meos 3.1-uttrykker celler (figur 3b). For å bekrefte dette funnet ved høyere optisk oppløsning, brukte vi konfokalmikroskopi mikroskopi å fange z-stabler for flere felt av celler. Fluorescens ble faktisk jevnt fordelt gjennom stoffer, uten noen synlig puncta, om cellene uttrykte HSPE1-mEos 3.1 eller fluoroforen alene (figur 3c). Merk at kjennetegnet Kd av HSPE1 er rundt 3 μM som er litt under følsomheten til systemet vårt, og dermed vi ikke observerer sigmoidal forholdet mellom bånd til konsentrasjon som ville være forventet for denne diskrete homo-oligomer. Likevel konkluderer vi at DAmFRET robust oppdager løselig homo-oligomerisering in vivo på en enkelt celle oppløsning.
Påvisning av kjerne-begrensede forsamlinger
Å vise frem evnen til DAmFRET å skille diskret homo-oligomers fra kjerne-begrenset forsamlinger som prioner, analyserte vi den menneskelige inflammasome protein ASC. Mens WT ASCPYD skjemaer filamenter in vivo, den inaktive R41E mutant av ASCPYD ikke9,10. Vi uttrykte i gjærceller enten mEos 3.1 alene, eller mEos 3.1 smeltet til enten WT eller R41E ASCPYD. Gjærceller uttrykker fluoroforen alene eller den muterte form av ASCPYD utstilt ubetydelig AmFRET over hele konsentrasjonen området, noe som indikerer en manglende evne til å selv-samhandle. I kontrast viste WT ASCPYD en DAmFRET-profil med to populasjoner: en med ubetydelig AmFRET og den andre med høy AmFRET (figur 4a). Som bekreftet av fluorescens bilder (figur 4b), disse populasjoner representerer celler som inneholder bare løselig protein eller i stedet inneholder det meste selv-monterte protein, henholdsvis. Den usammenhengende forholdet mellom befolkningen, og det faktum at de oppstår ved overlappende konsentrasjoner indikerer at en kjerne barriere stabiliserer monomere form av proteinet og kan holde den fra montering over varigheten av eksperimentet 8. gapet i AmFRET mellom de to populasjoner indikerer at, når kjernen oppstår, det nær umiddelbart maler andre monomerer til den sammensatte form og oppnår et nytt stabilt statlig nivå av AmFRET. DAmFRET bekreftet tidligere strukturelle data at punktet mutant ASCPYD R41E forstyrret kjernedannelse på tvers av konsentrasjoner oppnåelig av dette uttrykket systemet (figur 4a).
Anvendelse av DAmFRET i pattedyrceller
Selv om gjærceller er ideelle vert celler for DAmFRET, vi ønsket å forlenge anvendelsen av DAmFRET til pattedyrceller. For å unngå celle død forårsaket av funksjonelle ASC polymerer, testet vi DAmFRET i HEK293T celler som mangler ordtak-1-uttrykk. Vi uttrykte de samme proteinene i HEK293T celler som vi gjorde i gjærceller i figur 4a. Den resulterende DAmFRET profiler i HEK293T celler kvalitativt ligne de i gjærceller (tall 4a,C). DAmFRET, således, behandler idet de fleste allsidig inne vivo metoden å merker og kvantifisere kjerne protein selv-forsamlinger for enkeltcellen resolution med høy produksjon uten hensyn til begge to tilstedeværelsen av mikroskopisk synlig puncta likeledes idet cellen type.
Figur 1 : Oversikt over eksperimentell design for S. cerevisiae. Dette tallet er tilpasset fra Khan et al.8 med tillatelse. (A) 2μ plasmider kart som viser den åpne lese rammen for protein av interesse, merket med photoconvertible meos 3.1 og drevet av en induserbart promoter. (B) når forvandlet til gjærceller, fører 2μ system av replikering til høy kopi tall variasjon mellom celler. Denne varianten, kombinert med den transcriptional støyen fra GAL1 promoter, resulterer i en bred fordeling av protein uttrykk i en populasjon av celler. (C) eksperimentell oversikt for gjær DAmFRET analysen. For å sikre sunne celler for analysen, kolonier er først inokulert for spredning over 16 t i syntetiske medier som inneholder den ikke-inducing karbon kilde, druesukker. Etter spredning, celler er overført til syntetiske medier som inneholder inducing karbon kilde, galaktose, for 16 h. Etter induksjon, celler er delvis og jevnt photoconverted ved eksponering for 405 NM lys. (D) prøvene analyseres deretter ved hjelp av bilde flyt flowcytometri. Den Spectra og intensiteten av grønne og røde mEos 3.1 gjengi dem godt egnet for et bånd donor og Acceptor, henholdsvis. Når i nær tilknytning til hverandre, som oppstår i polymer avbildet i den nederste cellen, vil de røde molekylene fluorescens upon eksitasjon av grønne molekyler (SLITE). (E) et komplott av donor versus Acceptor intensitet som viser et stramt, lineært forhold ved photoconversion, som viser at effektiviteten av photoconversion ikke påvirkes av uttrykks nivå. (F) scatter plot of Mean Acceptor versus donor intensitet fra bestander av celler uttrykker en rekke mEos-Tagged proteiner, i både løselig og amyloid former, viser at effektiviteten av photoconversion ikke er påvirket av fusjon eller løselighet (feilfelt indikerer standardavvik for biologisk triplicates). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : DAmFRET gating strategi for bilde flyt flowcytometri data. Gating strategi brukes til å analysere bare fokuserte, unbudded enkeltceller som har lav autofluorescence og uttrykker fluorescerende protein. (A) hierarki av porter for å oppnå godt fokuserte, levende, enkeltceller for analyse. (B) histogrammet av gradient RMS av brightfield kanal. Denne målingen gjør det mulig å velge celler som er riktig fokusert under overført lys. (C) tetthet tomten av sirkularitet versus området viser gated befolkning på unbudded sfærisk enkeltceller. (D) tetthet tomten viser Autofluorescence (Ch07) versus donor fluorescens (Ch02) intensitet som viser separate populasjoner av å uttrykke celler (gated) og mørke celler. (E) punktdiagram av donor versus Acceptor intensitet som viser et klart tap i donor fluorescens i et delsett av celler, som følge av bånd mellom donor og Acceptor fluorophores. (F) endelig DAmFRET plot. Celler som inneholder umontert protein, er sentrert rundt null AmFRET, mens celler som inneholder selv monterte proteiner, viser en positiv AmFRET-verdi. To overlappende populasjoner i plottet er en indikasjon på en endelig barriere for å nucleating at protein i høyere-Order forsamlinger som amyloids. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representative data for monomere og heptameric proteiner ved flyt flowcytometri og mikroskopi. (A) DAmFRET profil av monomere meos 3.1 protein (venstre) og heptameric HSPE1 merket med meos 3.1 (høyre) viser økt ratiometrisk bånd som følge av homotypic montering. (B) bilder fra flowcytometer, av celler som uttrykker meos 3.1 (venstre) og HSPE1 (høyre) vist i alle innspilte kanaler. (C) representative bilder av gjærceller som uttrykker monomere meos 3.1 (til venstre) og HSPE1 (høyre). Bildene er summen projeksjoner av konfokalmikroskopi skiver. Minst 50 celler ble avbildet til bekrefte denne observasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : DAmFRET profiler viser lignende selv-montering oppførsel av menneskelig ASCPYD protein i S. cerevisiae og HEK293T celler. (A) tetthet plott viser AmFRET versus cytosolic konsentrasjon (i μM) av meos 3.1 (venstre), eller meos 3.1 SMELTET til WT (midten) eller monomerizing MUTANT av ASCPYD (høyre) i S. cerevisiae. (B) bilder fra flowcytometer, av celler fra nedre og øvre porter (henholdsvis venstre og midtre panel) uttrykker WT ASCPYD; og celler uttrykker ASCPYD R41E av den angitte porten (høyre panel). (C) tetthet tomter som viser AmFRET versus Acceptor intensitet for samme serie proteiner som i (A), men uttrykt i HEK293T celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
DAmFRET er den mest omfattende metoden for å oppdage protein selv montering in vivo. DAmFRET kombinerer direkte lesing av homotypic protein-protein interaksjoner over et bredt spekter av konsentrasjon, med én celle oppløsning og høy gjennomstrømming. Den direkte lese-ut av DAmFRET og det faktum at smeltet proteiner ikke krever en bestemt subcellulære lokalisering eller uløselig tilstand eliminerer falske positiver og utvider anvendelsen til et bredt spekter av proteiner på sitt eget subcellulære steder. Spesielt ved å merke organeller med fluorophores som er Spectrally kompatible med mEos 3.1, slik som T-Sapphire og mCardinal, kan subcellulære lokalisering av løselige og sammensatte former av proteiner bestemmes ved siden av DAmFRET.
Bruke Imaging Flow flowcytometer som beskrevet her, tar det 8 h å analysere en 96-brønn plate med ca 20 000 gated celler per brønn. Imidlertid, vi likeledes rutinemessig utføre DAmFRET med målestokk (ingen-tenkelig) cytometers det oppnå mange høyere produksjon (til 20 eksemplar per minutt). Faktisk, alle flyte flowcytometer med romlig adskilt 488 og 561 NM laser det er befri fra stokk forsterker artefakter og har det passende eksportert pmts og filterene for oppdager donor, bånd, og Acceptor signaler er nok å utføre DAmFRET. I dag kommer denne gevinsten i gjennomstrømning på bekostning av lokalisering informasjon og volum bestemmelse, slik at selv-montering må da analyseres som en funksjon av protein uttrykk snarere enn konsentrasjon. Dette er ikke et problem for kvalitative analyser. I tillegg kan det være mulig å anslå cytosolic volum ved å smelte en Spectrally distinkt fluoroforen til en endogene "housekeeping" protein hvis uttrykk tett samsvarer med cytosolic volum.
Som vi har demonstrert gjennom vår distribusjon av DAmFRET i både gjær og pattedyrceller, kan DAmFRET enkelt tilpasses ulike uttrykks systemer. Dette gjør at selv-montering av proteiner som skal studert i deres opprinnelige cellulære sammenhenger. Videre gir det muligheten til å sammenligne protein forsamlingen over vidt avvikende celle-kultur modeller for å studere bevaring av mekanismer som styrer protein selv-montering.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Jeff lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, og Ellen Gyllenhammar for deres arbeid mot utviklingen av analysen. Dette arbeidet ble gjort for å oppfylle, delvis krav til doktorgrads avhandlingen forskning for T.S.K. som studenter registrert med Open University, UK, og Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, henholdsvis. Ytterligere analyse relatert informasjon finnes på https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Opprinnelige data underliggende dette manuskriptet kan nås fra Stowers opprinnelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Dette arbeidet ble finansiert av NIH Director ' s Early Independence Award DP5-OD009152, mars av kroner Foundation Grant no. 5-FY17-32, og Stowers Institute for Medical Research.
Forfatter bidrag er som følger. Konseptualisering: T.S.K., S.V., og R.H.; Metodikk: T.S.K., S.V., A.R.G. og A. B; Gransking: S.V., T.S.K., og A.R.G.; Formell analyse: S.V., og T.S.K.; Data Håndplukking: T.S.K.; Visualisering: T. S. K, og S.V., skrive (original draft): S.V., og T.S.K.; Skriving (gjennomgang, redigering): R.H., S.V. og T.S.K.; og finansiering oppkjøp: R.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
- Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
- Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
- Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
- Matthews, J. M., Sunde, M.
- Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
- Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
- Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
- Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
- Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425 (1992).
- Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
- Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).
