Summary
Denne artikel beskriver en fret-baseret flow flowcytometri-protokol til kvantificering af protein-selvsamling i både S. cerevisiae -og HEK293T-cellerne.
Abstract
Protein selv montage regulerer protein funktion og segmenter cellulære processer i rum og tid. Nuværende metoder til at studere det lider af lav følsomhed, indirekte udlæsninger, begrænset gennemløb, og/eller befolkning-niveau snarere end enkelt celle opløsning. Vi har udviklet en flow cytometry-baseret enkelt metode, der adresserer alle disse begrænsninger: distribueret Amningspind eller DAmFRET. DAmFRET registrerer og kvantificerer protein selv samlinger ved sensibiliseret emission FRET in vivo, muliggør udrulning på tværs af modelsystemer-fra gær til humane celler-og opnår følsomme, enkelt celle-, højt gennemløb-læse-outs uanset protein lokalisering eller opløselighed.
Introduction
Assays at studere Homotypiske protein interaktioner, eller "selv-samling" er vigtige, fordi oligomer tilstand og Opløselighed af proteiner dikterer deres funktion. Proteomet bugner af Homo-multimere1,2,3,4, hvorimod relativt få proteiner fungerer som monomerer. Proteiner kan også samle Aberrant på grund af stress, alder eller fejl regulering, hvilket fører til patologiske ændringer i aktivitet. Det er ofte usædvanligt udfordrende at identificere de faktorer, der modunere sådanne begivenheder, eller endog den fysiske karakter af forsamlinger.
Et stigende antal proteiner er nu anerkendt for at selv samle med ekstraordinær cooperativitet og ubestemt støkiometri, hvilket resulterer i deres at fra andre cellulære bestanddele, som protein tætte faser. Disse tager form af uordnede kondensater, såsom dråber og geler, eller højt ordnede filamenter, såsom amyloid fibre. De konformationsmæssige udsving forbundet med sidstnævnte gør dets oprindelige dannelse, eller nukleation, i sagens natur probabilistisk på molekyl niveau5,6. Fordi sandsynligheden for nukleation skalaer med volumen, dannelsen af sådanne forsamlinger kan være meget stokastiske i den rumlige grænser af levende celler7,8. På det ekstreme af stokastiske nukleation-begrænset faseadskillelse er prioner, højt ordnede protein samlinger, der kun sjældent kerner, men når dannet, skabelon deres egen vækst på ubestemt tid. Et sådant protein, kendt som ASC, udfører en digital prion-lignende switch i aktiviteten af pattedyr medfødte immunceller. ASC Self-montering er kerneholdige af sin interaktion med specifikke proteiner, der selv har oligomeriseret ved binding patogen-eller fare-associerede molekylære mønstre. De ASC samlinger i sving kerne procaspase-1 til selv-samle og aktivere, fører til cytokin modning og pyroptose af cellen9,10. Den region ASC ansvarlig for sin forsamling tilhører døds domænet super familie, som består af over 100 medlemmer i den menneskelige proteome. På trods af de centrale roller døds domæner i medfødte immunitet og programmeret celledød, de fleste af dem er endnu ikke blevet karakteriseret med hensyn til selv-samling. Opdagelsen og karakterisering af yderligere proteiner med en sådan adfærd vil blive lettet betydeligt ved en direkte, enkelt celle aflæsning af protein selvsamling.
Klassisk protein biokemi tilgange til at studere protein selvsamling, såsom størrelses udelukkelse kromatografi og ultracentrifugering, er i vid udstrækning begrænset til populationsniveau vurderinger. Celle-til-celle-heterogenitet, der skyldes nukleation-begrænsede fase overgange, kan dog ikke modeles med dette detaljeringsniveau. Enkelt celle tilgange baseret på Fluorescens mikroskopi genvinde denne evne, men mangler det gennemløb, som er nødvendigt for nøjagtigt at kvantificere kimdannelse eller for at detektere sjældne samlinger. Desuden er opløselige selv-forsamlinger, såsom de fleste enzymer og præ-amyloid oligomerer, for små og mobile til at blive løst ved standard Light mikroskopi. De kan påvises ved mere sofistikerede tilgange såsom fluorescens korrelations spektroskopi, men disse er meget begrænset i celle nummer og gennemløb.
Nærheds baserede assays af protein samling, såsom fret og split fluoroforet komplementering, tilbyder en potentiel løsning på disse problemer. Men de generelt kræver brug af to forskellige konstruktioner, der udtrykker det protein af interesse smeltet til komplementære Tags-donor og acceptor fluorophores i tilfælde af FRET. Dette kompromitterer eksperimentel gennemstrømning og reducerer også følsomheden på grund af celle-til-celle variation i de relative niveauer af donor og acceptor. For at omgå dette, designede vi en analyse, der beskæftiger en foto konvertibel fluorophore, mEos 3.111, som giver mulighed for en enkelt konstruktion til at udtrykke både donor-og acceptor-mærkede protein. Emissionsspektret af ikke-konverterede mEos 3.1 (GFP-lignende donor) overlapper tilstrækkeligt med excitation spektrum af foto konverterede mEos 3.1 (dsRed-lignende acceptor) at tillade ÆRGRE at forekomme, når molekylerne er i umiddelbar nærhed (< 10 nm). Således, ved at udsætte cellerne for en empirisk bestemt dosis på 405 nm lys, som foto konverterer en optimal fraktion af total mEos 3.1 i acceptor form, vi opnår konsistente og reproducerbare relative niveauer af donor og acceptor på tværs af flere prøver, udtryks niveauer og eksperimenter. Vi måler den acceptor fluorescens, når ophidset enten direkte med 561 nm lys, eller indirekte (ved energioverførsel fra donor) med 488 nm lys (dvs. sensibiliseret emission FRET). Vi rapporterer protein samling som forholdet mellem disse to værdier og term det amphifluoric FRET eller AmFRET.
For at beregne proteinkoncentrationen ved flowcytometri beregner vi først den gennemsnitlige fluorescens intensitet af Spc42 Tagged med mEos 3.1. Da gærceller indeholder ca. 1000 molekyler Spc42, beregner vi fluorescens intensiteten af et enkelt fluorescerende grønt mEos 3.1-molekyle. Ved at udnytte den selv fotokonvertering ved alle cellulære koncentrationer (figur 1E), korrelerer vi de totale meos 3.1 fluorescens værdier for alle acceptor intensiteter efter foto konvertering. Vi er derefter i stand til at opdele det samlede antal mol af fluorescerende proteiner af den omtrentlige cytosolisk volumen (som bestemmes ved hjælp af Imaging flow cytometry) for at opnå den samlede cytosolisk koncentration af proteinet af interesse. For eksakte beregninger henvises til det originale manuskript8.
Ved at udtrykke mEos 3.1-smeltet protein fra en 2Μ plasmid i gær, sonde vi en ca tusind-fold vifte af proteinkoncentration i hver prøve8. Vi opnår det samme i HEK293T celler i kraft af variation i plasmid optagelse under transfection, og dermed variabel kopi nummer.
Den resulterende fordeling af AmFRET, eller DAmFRET, for mange tusinde celler afslører koncentrationen-afhængighed af selvsamling i cytosol for ethvert protein af interesse. Samlet set repræsenterer DAmFRET en mulig metode til at opdage og karakterisere protein selvsamling med en hidtil uset kombination af følsomhed, gennemløb og reproducerbarhed.
Mens du bruger et billedbehandlings-flowcytometer gør det muligt for os at opnå in vivo-protein koncentrationsmålinger, er sådanne cytometre endnu ikke tilgængelige på de fleste forskningsinstitutioner. Ikke desto mindre kan DAmFRET køres selv i en typisk non-Imaging flowcytometer for at få fordelinger af protein samling over rækken af protein udtryk.
Protocol
1. fremstilling af Saccharomyces cerevisiae til damfret assay
- Omdanne eksperimentelt relevante gærstammer med en 2Μ galactose-inducerbar plasmid, der udtrykker det protein af interesse8 mærket enten ved C eller N Terminus med meos 3.1 ved hjælp af en standard lithium acetat protokol12 .
- Dyrke gær i flydende kultur.
- For hver forespørgsels protein, inokulerede gær kolonier (omdannet), i tre eksemplarer, hver til 200 μL af passende ikke-inducerende vækstmedier (dvs. medier, der indeholder 2% dextrose, gær nitrogen base og aminosyrer til udvælgelse af plasmid) i en 96-brønd plade ( Figur 1c).
- Inkuber cellerne, mens der rystes på en plade shaker (Se tabellen over materialer) med 1,5 mm kredsløb ved 1200 rpm ved 30 °c i 16 timer.
- Inducerer ekspression af genet af interesse (repræsentativ protokol for 16 h-nogle proteiner kan tage mere eller mindre tid).
- Efter 16 h induktion, drej pladen på 2200 x g i 2 min ved stuetemperatur (RT0 til pellet prøverne.
- Fjern medier ved insisterende inversion. Resuspendere celler med 200 μL af passende induktions medier (dvs. medier, der indeholder 2% galactose, gær nitrogen base og aminosyrer til udvælgelse af plasmid). Se figur 1c.
- Inkuber cellerne under omrystning ved 30 °C i 12 timer.
- Centrifuge (Se tabellen over materialer) pladen på 2200 x g i 2 min ved rt at pille prøverne. Fjern medier ved insisterende inversion. Resuspension af celler med 200 μL af induktions mediet.
- Inkuber cellerne under omrystning ved 1200 rpm ved 30 °C i yderligere 4 timer. Denne opblanding i friske medier skal ske 4 h før du kører damfret, for at reducere autofluorescens.
2. oprettelse af mammalian plasmid
- Konstruere en pattedyr vektor, der har en konstitutiv promotor og mEos 3.1 med en pladsholder til at indsætte genet af interesse og en linker imellem dem.
Bemærk: vi konstruerede en Golden Gate kompatibel vektor, M1, fra en offentligt tilgængelig plasmid (Se tabellen over materialer) med følgende modifikationer: et eksisterende bsai-websted blev fjernet ved en punkt mutation G til a (i position 3719 som pr. den deponerede sekvens). meos 3.1 blev fremstillet ved hjælp af site-instrueret mutagenese af fluoroforet på I157V. Inverted BsaI sites efterfulgt af 4X (EAAAR) linker blev indsat, af Gibson assembly, i-frame mellem CMV promoter og mEos 3.1 at producere den endelige M1 vektor. Protein ekspression drives af CMV forstærker og promotor; og transskription ved SV40 polyadenyleringsignal. - Opret et bibliotek med skær, der er kompatibelt med den konstruerede vektor.
Bemærk: vi bestiller vores skær til Golden Gate assembly som syntetiske lineære fragmenter (se tabel over materialer) flankeret af bsai sites for ligering til M1 mellem CMV promoter og 4X (eaaar)-meos 3.1.
3. dyrkning af pattedyrsceller og transfektering
- Kultur HEK293T celler i DMEM + 10% FBS + 1x PenStrep medier ved 37 °C ved 5% CO2.
- På dagen før transfection, frø 5 x 105 celler i en 6-brønd plade med 2 ml medier.
- Transfect-celler med 2 μg plasmid-DNA ved hjælp af et transfektering reagens (Se tabellen over materialer) i et forhold på 3:1 (transfektering reagens: DNA). Bland komponenterne i 150 μL reducerede serum medier (Se tabel over materialer) og Inkuber det ved rt i 15 min, tilsæt blandingen til hver brønd og inkuber for 48 h for protein ekspression.
- Bekræft protein ekspression efter 24 timer ved epifluorescens mikroskopi (488 nm excitation, 515 nm emission).
4. klargøring af pattedyrsceller til DAmFRET assay
- Efter 48 h protein ekspression, Fjern mediet fra hver brønd og vask forsigtigt cellerne med 1 mL 37 °C fosfat-bufferet saltvand (PBS). Efter vask, aspirere PBS.
- Tilsæt 0,5 mL trypsin-ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) (0,25%) og Inkuber i 5 min ved 37 °C.
- Tilsæt 0,5 mL komplet DMEM-medie til hver brønd, resuspender cellerne, og sørg for, at ingen store klumper er synlige.
- Hele volumenet af hver brønd overføres til 1,5 mL rør.
- Spin celler i 5 min ved 1000 x g ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
- Drej cellerne i 5 minutter ved 1000 x g ved rt.
- Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) + 10 mM EDTA i PBS.
- Fix celler for 5 min på en rystebord med konstant bevægelse.
- Spin celler i 5 min ved 1000 x g ved rt.
- Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
- Spin celler i 5 min ved 1000 x g ved rt.
- Supernatanten fjernes, og cellerne opslæmmes i tilstrækkelig mængde buffer til cytometri-kørslen (for 1 brønd af en 96-brønd plade brug 200 μL PBS + 10 mM EDTA).
- Overfør de resuspenderede celler til en brønd af en rund bund 96-brønd plade.
5. fotoomdannelse af gær og pattedyrsceller til analysen
- Photoconvert prøver i en mikropladen uden låg ved hjælp af en UV-lampe (Se tabellen over materialer) udstyret med et 320-500 nm (violet) filter og en stråle kollimator, placeret 45 cm over pladen, for en varighed på 25 min under omrystning. Disse betingelser er hensigtsmæssige, når stråle effekten på pladen er 11,25 mW/cm2, med ca. 17.000 MJ/cm2 af total foton dosis8.
6. DAmFRET dataindsamling
- Analyse celler ved hjælp af et flowcytometer med non-collinear 488/561 lasere. Følgende data er minimumskravene til beregning af FRET.
- Brug en 488 nm excitation/515 nm emissions kanal til indsamling af donor fluorescens.
- Brug en 488 nm-excitation/595 nm-emissions kanal til opsamling af et FRET-Signals fluorescens.
- Brug en 561 nm excitation/595 nm emissions kanal (ikke-collinear med 488/595 kanalen) til opsamling af acceptoren fluorescens.
- Brug en 405 nm excitation/457 nm emissions kanal til opsamling af Auto luorescens8.
- Udnyt en lysfelt billed kanal til volumenberegning.
Bemærk: billedbehandlings flowcytometer-indstillinger for S. cerevisiae er som følger: 60x mål ved lav strømningshastighed og høj følsomhed; laser kræfter indstillet til 405 nm ved 15 mW, 488 nm ved 15 mW, 561 nm ved 20 mW. indstillinger for billed flowcytometer for HEK293T-celler er som følger: 40x mål ved lav strømningshastighed og høj følsomhed; laser kræfter indstillet til 405 nm ved 15 mW, 488 nm ved 15 mW, 561 nm ved 20 mW. Bemærk også, at vores billedbehandling flowcytometer var specialdesignet til at have rumligt adskilte 488 nm og 561 nm lasere (dvs. på forskellige kameraer) for at opnå en klar opløsning af FRET fra acceptor fluorescen Ce.
- Indsaml data for 20000-50000 enkeltceller pr. prøve i en fluorescens positiv port.
- Gate enkeltceller med et højt højde-bredde-forhold og et lille celleområde i modsætning til klumpede celler eller snavs, som ville have lavt højde-bredde-forhold og store eller meget små celleområder hhv.
Bemærk: de tilsvarende parametre i et ikke-billedbehandlings-flowcytometer er FSC (Forward scatter) for omtrentlig Cellestørrelse og SSC (side scatter) for celle granularitet. Derudover skal du bruge FSC Pulse højde versus pulsbredde som en proxy for enkelt celle gating. Derudover er det afgørende at ikke indsamle hændelser, der har fluorescens værdier ud over den øvre grænse for følsomhed af cytometer. I vores billedbehandlings cytometer begrænser vi indsamlingen af hændelser til en rå maksimum pixelværdi på en mindre end mætnings grænsen for hver fluorescerende kanal, vi indsamler. På samme måde bør datapunkter i den højeste intensitets beholder (som omfatter hændelser, der ligger uden for det dynamiske detektionsområde) ikke analyseres for konventionelle flow-cytometre.
- Gate enkeltceller med et højt højde-bredde-forhold og et lille celleområde i modsætning til klumpede celler eller snavs, som ville have lavt højde-bredde-forhold og store eller meget små celleområder hhv.
7. data analyse
- Udfør kompensation ved hjælp af en ikke-foto konverteret meos 3.1 prøve til det rene donor signal og mono DsRed2, som har et lignende spektrum til den røde form af meos 3.1, til det rene acceptor signal13. For mere følsomhed, sikre, at fret detektor kanal også betragtes som en afsmittende mål, i analyseprogrammet.
- Stikprøver for kun at udvælge enkeltceller, der er fluorescens positive (som i figur 2).
- Beregn AmFRET parameteren som forholdet mellem total FRET signal (488ex/595em) divideret med det totale FRET acceptor (561ex/595em) signal.
- Visualiser data ved hjælp af en flow flowcytometri-software (Se tabellen over materialer).
Bemærk: Cytosolic koncentrationer for S. cerevisiae i dette studie blev beregnet med nedenstående indstillinger som i Khan et al.8. Data analyse blev udført ved hjælp af flow flowcytometri software (Se tabel over materialer).
Representative Results
Påvisning af oligomerer, der ikke udgør punkta
Vi har tidligere anvendt DAmFRET til karakterisering af protein faseseparation, som typisk resulterer i dannelsen af store protein samlinger, der også kan påvises ved Fluorescens mikroskopi. For at demonstrere anvendeligheden af DAmFRET til diffraktion-begrænsede protein samlinger, analyserede vi et biokemisk velkarakteriseret protein, der danner diskrete homo-heptamere, der er alt for små til at blive visualiseret af let mikroskopi: den menneskelige Co-chaperonin, HSPE114. Vi sammenlignede DAmFRET profilerne af gærceller, som udtrykker mEos 3.1 alene, eller HSPE1-mEos 3.1. Sidstnævnte udviste ensartede positive AmFRET værdier, mens førstnævnte udviste ubetydelig AmFRET (figur 3a). Billederne af celler erhvervet af billedbehandlings strømmen flowcytometer (Se tabellen over materialer) afslørede diffus fluorescens i alle kanaler-donor, fret og acceptor, for både meos 3.1-og HSPE1-meos 3.1-udtrykte celler (figur 3b). For at bekræfte denne konstatering ved højere optisk opløsning brugte vi Konfokal mikroskopi til at fange z-stakke for flere felter af celler. Fluorescensen blev således jævnt fordelt over hele cytosol uden påviselige punkta, uanset om cellerne udtrykte HSPE1-meos 3.1 eller fluoroforet alene (figur 3c). Bemærk, at den karakteriserede Kd af HSPE1 er omkring 3 μM, som er lidt under følsomheden af vores system, og dermed vi ikke observere sigmoidal forholdet af Fret til koncentration, der ville forventes for denne diskrete homo-oligomer. Ikke desto mindre konkluderer vi, at DAmFRET robust registrerer opløseligt homo-oligomerisering in vivo ved en enkelt celle opløsning.
Påvisning af nukleation-begrænsede samlinger
For at fremvise muligheden for DAmFRET at skelne diskrete homo-oligomerer fra nukleation-begrænsede samlinger som prions, vi analyserede den menneskelige inflammasome protein ASC. Mens WT ASCPYD danner filamenter in vivo, er den inaktive R41E mutant af ASCPYD ikke9,10. Vi udtrykte i gærceller enten mEos 3.1 alene, eller mEos 3.1 fvant til enten WT eller R41E ASCPYD. Gærceller, der udtrykker fluoroforet alene eller den mutante form af ASCPYD udviste ubetydelig amfret over hele koncentrationsintervallet, hvilket indikerer en manglende evne til selv at interagere. I modsætning hertil udviste WT ASCPYD en damfret profil med to populationer: en med ubetydelig amfret og den anden med høj amfret (figur 4a). Som bekræftet af fluorescensbilleder (figur 4b) repræsenterer disse populationer celler, der kun indeholder opløseligt protein eller i stedet hovedsageligt indeholder selv samlet protein. Det diskontinuerligt forhold mellem befolkningerne, og det faktum, at de opstår ved overlappende koncentrationer indikerer, at en nukleations barriere stabiliserer den monomeriske form af proteinet og kan holde det fra montering i løbet af eksperimentets varighed 8. hullet i amfret mellem de to populationer indikerer, at, når nukleation opstår, det i nærheden af øjeblikkeligt skabeloner andre monomerer til den samlede form og opnår en ny Steady State niveau af amfret. DAmFRET bekræftede tidligere strukturelle data, at det punkt mutant ASCPYD R41E forstyrrede nukleationen på tværs af de koncentrationer, der opnåes ved dette udtryks system (figur 4a).
Anvendelse af DAmFRET i pattedyrsceller
Selvom gærceller er ideelle værtsceller for DAmFRET, ønskede vi at udvide anvendeligheden af DAmFRET til pattedyrsceller. For at undgå celledød forårsaget af funktionelle ASC polymerer, testede vi DAmFRET i HEK293T celler, der mangler caspase-1 udtryk. Vi udtrykte de samme proteiner i HEK293T celler, som vi gjorde i gærceller i figur 4a. De resulterende DAmFRET profiler i HEK293T celler kvalitativt ligner dem i gærceller (figur 4a,C). DAmFRET, således, fungerer som den mest alsidige in vivo metode til at detektere og kvantificere nukleated protein selv-forsamlinger ved enkelt celle opløsning med høj gennemløb uanset både tilstedeværelsen af mikroskopisk synlige punkta samt celletype.
Figur 1 : Oversigt over eksperimentel design S. cerevisiae. Dette tal er blevet tilpasset fra Khan et al.8 med tilladelse. (A) 2 μ plasmid kort, der viser den åbne læse ramme for det protein af interesse, mærket med Photoconvertible meos 3.1 og drevet af en inducerbar promotor. (B) når det omdannes til gærceller, fører 2Μ-Replikerings systemet til en høj kopi nummer variation blandt cellerne. Denne variation, kombineret med den transkriptionelle støj fra GAL1 promotoren, resulterer i en bred fordeling af protein ekspression i en population af celler. C) eksperimentel oversigt for gær damfret assay. For at sikre sunde celler til analysen, er kolonier først vaccineret for spredning over 16 timer i syntetiske medier, der indeholder den ikke-inducerende kulstofkilde, dextrose. Efter spredning, celler overføres til syntetiske medier, der indeholder inducerende kulstofkilde, galactose, for 16 h. Efter induktion er cellerne delvist og ensartet fotokonverteret ved udsættelse for 405 nm-lys. D) prøverne analyseres derefter ved hjælp af billedbehandlings flow cytometri. Spektrene og intensiteten af grønne og røde mEos 3.1 gør dem velegnede til henholdsvis en FRET donor og acceptor. Når der i umiddelbar nærhed af hinanden, som forekommer i polymeren afbildet i den nederste celle, vil de røde molekyler fluorescens ved excitation af grønne molekyler (FRET). (E) plot af donor versus acceptor intensiteter, der viser et stramt lineært forhold ved foto konvertering, viser, at effektiviteten af foto konvertering ikke påvirkes af ekspressionsniveau. F) scatter plot af gennemsnitlig acceptor versus donor intensiteter fra populationer af celler, der udtrykker en række meos-mærkede proteiner, i både opløselige og amyloide former, hvilket viser, at effektiviteten af fotoomdannelse ikke påvirkes af fusions partner eller opløselighed (fejllinjer indikerer standardafvigelse for biologiske triplicater). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Damfret gating-strategi for cytometri-data for billedbehandlings flow. Gating strategi bruges til at analysere kun fokuserede, unbudded enkeltceller, som har lav Auto luorescens og udtrykker det fluorescerende protein. (A) hierarki af Gates for at opnå velfokuserede, levende, enkeltceller til analyse. (B) histogram over gradient RMS af lysfelt Channel. Denne måling giver mulighed for udvælgelse af celler, der er korrekt fokuseret under transmitteret lys. (C) tæthed plot af cirkularitet versus område viser gated population af unbudded sfæriske enkeltceller. (D) tæthed plot viser autofluorescens (Ch07) versus donor fluorescens (Ch02) intensitet viser separate populationer af udtrykker celler (gated) og mørke celler. (E) punktplot af donor versus acceptor intensiteter, der viser et klart tab i donor fluorescens i en delmængde af celler, som følge af Fret mellem donor og acceptor fluorophores. F) endeligt damfret plot. Celler, der indeholder usamlet protein, er centreret omkring nul AmFRET, mens celler, der indeholder selv samlet protein, udviser en positiv AmFRET værdi. To overlappende populationer i plottet er tegn på en begrænset barriere for at nukleisere det protein i højere rækkefølge samlinger såsom amyloider. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative data for monomeriske og heptameriske proteiner ved flow cytometri og mikroskopi. (A) damfret profil af mono meos 3.1 protein (venstre) og heptameric HSPE1 Tagged med meos 3.1 (højre) viser øget ratiometrisk fret som følge af homotypisk samling. (B) billeder fra cytometer, af celler, der udtrykker meos 3.1 (venstre) og HSPE1 (højre) vist i alle tilfangetagne kanaler. C) repræsentative billeder af gærceller, som udtrykker monomerisk meos 3.1 (venstre) og HSPE1 (højre). Billederne er sumprojektioner af konfokale skiver. Mindst 50 celler blev afbildet for at underbygge denne observation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Damfret profiler viser lignende selv montage opførsel af human ASCPYD protein i S. cerevisiae og HEK293T celler. A) massefylde områder, der viser amfret versus cytosolisk koncentration (i μM) af meos 3.1 (venstre), eller meos 3.1 smeltet til WT (Center) eller monomerizing mutant af ASCPYD (højre) i S. cerevisiae. B) billeder fra cytometer af celler fra de nedre og øvre porte (henholdsvis venstre-og midterpaneler), som udtrykker WT ASCPYD; og af celler, som udtrykker ASCPYD R41E af den angivne port (højre panel). C) massefylde områder, der viser amfret versus acceptor intensitet for den samme serie af proteiner som i (a), men udtrykt i HEK293T celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
DAmFRET er den mest omfattende metode til påvisning af protein-selv montage in vivo. DAmFRET kombinerer direkte Oplæsning af Homotypiske protein-protein interaktioner over en bred vifte af koncentration, med enkelt celle opløsning og høj gennemløb. Direkte læsning af DAmFRET og det faktum, at de smeltet proteiner ikke kræver en specifik subcellulær lokalisering eller uopløselig tilstand eliminerer falske positiver og udvider dets anvendelighed til en bred vifte af proteiner på deres indfødte subcellulære steder. Især ved at tagge organeller med fluorophorer, der er spektralt kompatible med mEos 3.1, såsom T-Sapphire og mCardinal, kan den subcellulære lokalisering af opløselige og samlede former for proteiner bestemmes sammen med DAmFRET.
Ved hjælp af Imaging flow flowcytometer som beskrevet her, det tager 8 h at analysere en 96-brønd plade med ca 20.000 gated celler per brønd. Vi udfører dog også rutinemæssigt DAmFRET med standard (non-Imaging) cytometre, der opnår meget højere gennemløb (op til 20 prøver pr. minut). Faktisk, enhver flow flowcytometer med rumligt adskilt 488 og 561 nm lasere, der er fri for Log amp artefakter og har de relevante PMTs og filtre til påvisning donor, FRET, og acceptor signaler er tilstrækkelig til at udføre DAmFRET. På nuværende tidspunkt kommer denne gevinst i gennemløb på bekostning af lokaliseringsoplysninger og volumenbestemmelse, således at selvsamling skal analyseres som en funktion af protein ekspression snarere end koncentration. Dette er ikke et problem for kvalitative analyser. Derudover kan det være muligt at estimere cytosolisk volumen ved at fusing en spektralt distinkt fluoroforet til en endogene "husholdning" protein, hvis udtryk stramt korrelerer med cytosolisk volumen.
Som vi har demonstreret gennem vores indsættelse af DAmFRET i både gær og pattedyrceller, kan DAmFRET let tilpasses til forskellige udtryks systemer. Dette gør det muligt for den selv-samling af proteiner, der skal undersøgt i deres indfødte cellulære sammenhænge. Desuden giver det mulighed for at sammenligne protein samling på tværs af vidt forskellige celle-kultur modeller for at studere bevarelsen af mekanismer, der styrer protein selvsamling.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Jeff lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan og Ellen ketter for deres arbejde hen imod udvikling af analysen. Dette arbejde blev gjort for at opfylde, til dels, krav til PhD afhandling Research for T.S.K. og A. R. G som studerende er registreret hos Open University, UK, og Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, hhv. Yderligere analyse relaterede oplysninger kan findes på https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Oprindelige data underliggende dette manuskript kan tilgås fra Stowers oprindelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Dette arbejde blev finansieret af NIH instruktørens tidlige uafhængigheds pris DP5-OD009152, marts af Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-32, og Stowers Institute for Medical Research.
Forfatter bidrag er som følger. Konceptualisering: T.S.K., S.V. og RH; Metode: T.S.K., S.V., A.R.G. og A. B; Undersøgelse: S.V., T.S.K. og A.R.G.; Formel analyse: S.V. og T.S.K.; Data-curation: T.S.K.; Visualisering: T. S. K og S.V., skrivning (oprindeligt udkast): S.V., og T.S.K.; Skrivning (gennemgang, redigering): S.V. og T.S.K.; og finansiering erhvervelse: RH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
- Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
- Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
- Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
- Matthews, J. M., Sunde, M. Dimers, oligomers, everywhere. Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).
- Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
- Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
- Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
- Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
- Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425 (1992).
- Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
- Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).
