Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis
Summary
We presenteren een vrij eenvoudige en gevoelige methode voor nauwkeurige kwantificering van de dichtheid van de gal duct in de lever van de muis. Deze methode kan helpen bij het bepalen van de effecten van genetische en omgevings modificatoren en de effectiviteit van mogelijke therapieën in muizen modellen van galziekten.
Abstract
Muis wordt in grote lijnen gebruikt als modelorganisme om biliaire ziekten te bestuderen. Om de ontwikkeling en functie van het biliaire systeem te evalueren, worden verschillende technieken gebruikt, waaronder serum chemie, histologische analyse en immunokleuring voor specifieke markers. Hoewel deze technieken belangrijke informatie over de galwegen kunnen bieden, presenteren ze vaak geen volledig beeld van de ontwikkelings defecten van galwegen (BD) over de hele lever. Dit is deels te wijten aan het robuuste vermogen van de muis lever om de gal af te voeren, zelfs bij dieren met een significante beperking in de biliaire ontwikkeling. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het berekenen van het gemiddelde aantal BDs dat is gekoppeld aan elke portaal ader (PV) in secties die alle lobben van Mutante/transgene muizen beslaan. Bij deze methode worden levers op type wijze gemonteerd en gesectioneerd om de vergelijking tussen verschillende genotypen en experimentele omstandigheden te vergemakkelijken. BDs worden geïdentificeerd door middel van lichte microscopie van cytokeratine-gekleurd cholangiocyten, en vervolgens geteld en gedeeld door het totale aantal Pv’s aanwezig in de lever sectie. Als voorbeeld laten we zien hoe deze methode duidelijk onderscheid kan maken tussen wild-type muizen en een muismodel van Alagille syndroom. De hier gepresenteerde methode kan geen vervanging zijn voor technieken die de driedimensionale structuur van de biliaire boom visualiseren. Het biedt echter een eenvoudige en directe manier om de ontwikkeling van BD en de mate van ductulaire reactie vorming bij muizen kwantitatief te beoordelen.
Introduction
De biliaire boom is een cruciaal onderdeel van de lever van zoogdieren, waardoor de passage van gal van hepatocyten in de darm. Intrahepatische galwegen (BDs) worden gevormd door cholangiocyten, die differentiëren van bipotentiaal hepatoblasten door Inkeping en tgfβ signalering1,2. De juiste specificatie en toewijding van cholangiocyten en hun assemblage in volwassen BDs zijn van cruciaal belang voor de ontwikkeling van de Intrahepatische biliaire boom. Naarmate de lever groeit tijdens de ontwikkeling of bij orgaan regeneratie, moet het biliaire systeem langs de lever worden ontwikkeld om een goede galdrainage te garanderen. Bovendien resulteren een aantal syndromische en niet-syndromische ziekten in de paustad van de Intrahepatische BDs3. Bovendien geven een aantal acute en chronische leverziekten aanleiding tot zogenaamde ductular reacties in de lever, die worden gedefinieerd als de aanwezigheid van een significant aantal cellen die biliaire markers uitdrukken, maar niet noodzakelijkerwijs voortvloeien uit biliaire cellen of vorm Patent BDs4. In de multi systeem stoornis Alagille syndroom (algs), haploinsufficiëntie van de inkeping ligand jagged1 (JAG1) resulteert in een slechte BD vorming en cholestase5,6. Ons lab heeft onlangs aangetoond dat een eerder gegenereerde Jag1 heterozygoot Mouse line7 een diermodel is van BD gebrek aan in algs8. In dit muismodel van ALGS zijn cholangiocyten nog steeds aanwezig. Ze zijn echter niet verplicht om zich te integreren in volwassen, patent BDs8. Daarom, analyse van de lever in een model van BD gebrek aan vereist meer dan de schijnbare aanwezigheid of afwezigheid van cholangiocyten. Het is belangrijk om de mate waarin volwassen BDs aanwezig zijn in de lever nauwkeurig te beoordelen.
In anatomische pathologie zijn er geaccepteerde kwantitatieve methoden om te beoordelen of BD gebrek aan9bestaat. Bijvoorbeeld, studies over algs bij menselijke patiënten kwantificeren vaak de BD naar portal ader (PV) ratio door het analyseren van ten minste 10 portaal vaten per leverbiopsie9,10. Analyse van de vorm en de algehele aanwezigheid of afwezigheid van patent BDs, gecombineerd met serum chemie, kan waardevolle informatie verschaffen over de ontwikkeling van BD in muizen11,12,13. Muizen kunnen echter een significant aantal Bdeen verliezen met slechts een bescheiden toename van het serum bilirubine niveau8. Dienovereenkomstig kan een kwantitatieve methode die het aantal aanwezige bd’s per PV evalueert, een directere meting van de mate van BD gebrek aan bij muizen opleveren. In een recent rapport kwantificeren we het aantal Bd’s per PV over alle lever lobben en rapporteerden we een significante afname in de BD-naar-PV-verhouding in Jag1 +/– dieren8. In de loop van onze analyse merkten we dat ondanks de significante variatie in de mate van inflammatoire respons en ductular reacties, de BD-naar-PV-verhouding niet veel variabiliteit toont8. Bovendien konden we met de kwantificering van de BD-naar-PV-ratio aantonen dat het verwijderen van één exemplaar van het glycosyltransferase gen Poglut1 in Jag1 +/– dieren hun BD gebrek aan8aanzienlijk kan verbeteren. In een Jag1 +/+ achtergrond resulteert voorwaardelijk verlies van Poglut1 in vasculaire gladde spiercellen in een progressieve toename van BD-getallen, wat bescheiden is (20-30%) bij P7 maar wordt prominent bij volwassenen8. Nogmaals, deze techniek liet ons toe om te laten zien dat zelfs bij P7, de toename van BD dichtheid bij deze dieren statistisch significant is. De verhoogde BD-dichtheid in dit genotype op vier maanden leeftijd werd ook gevalideerd door middel van hars giet analyse. 8 deze observaties en andere rapporten die de dichtheid van BD in verschillende algs-muizen modellen14,15 hebben gemeten, hebben ons ertoe aangezet deze methode in onze algemene strategie op te nemen om biliaire defecten in verschillende mutanten te analyseren en transgene muizen.
Hier, we detail een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om te onderzoeken de mate van BD gebrek aan in muismodellen van leverziekte (Figuur 1). Bij deze methode wordt co-kleuring met cholangiocyte markers cytokeratine (CK) 8 en CK19 (hierna Wide-spectrum CK, wsCK) gebruikt om Bd’s en cholangiocyten in de muis te visualiseren. Een antilichaam tegen alpha-glad spier actine (αsma) wordt toegevoegd aan de kleuring om schepen te labelen. Systematische analyse van de BD-naar-PV-verhouding in een gedeelte dat alle lever lobben omvat, zorgt ervoor dat een groot aantal Pv’s voor elk genotype wordt geanalyseerd. Omdat onze methode gebaseerd is op het kwantificeren van BDs en PVs in 2D-beelden, is het niet geschikt voor het bestuderen van de effecten van een bepaalde mutatie op de 3D-structuur van de galstructuur of de integriteit van de kleine galbuizen. Niettemin biedt het een eenvoudige en objectieve strategie voor onderzoekers om de biliaire ontwikkeling in de muis te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse van de ontwikkeling en reparatie van BD bij muizen is een belangrijk hulpmiddel bij het bestuderen van de pathogenese en het mechanisme van cholestatische aandoeningen. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe therapieën deels afhankelijk van het tot stand brengen van een reproduceerbare en bij voorkeur kwantificeerbaar fenotype. Huidige fenotyping in muismodellen omvat meestal serum chemie, lever histologie en immunokleuring voor cel-type specifieke markers. Hoewel deze technieken waardevolle informatie generere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 en R01 DK109982), een pilot/haalbaarheids Award van de Texas Medical Center spijsvertering ziekte centrum onder NIH P30 DK56338, en een Alagille syndroom Accelerator Award van De medische basis.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
