Summary
We presenteren een vrij eenvoudige en gevoelige methode voor nauwkeurige kwantificering van de dichtheid van de gal duct in de lever van de muis. Deze methode kan helpen bij het bepalen van de effecten van genetische en omgevings modificatoren en de effectiviteit van mogelijke therapieën in muizen modellen van galziekten.
Abstract
Muis wordt in grote lijnen gebruikt als modelorganisme om biliaire ziekten te bestuderen. Om de ontwikkeling en functie van het biliaire systeem te evalueren, worden verschillende technieken gebruikt, waaronder serum chemie, histologische analyse en immunokleuring voor specifieke markers. Hoewel deze technieken belangrijke informatie over de galwegen kunnen bieden, presenteren ze vaak geen volledig beeld van de ontwikkelings defecten van galwegen (BD) over de hele lever. Dit is deels te wijten aan het robuuste vermogen van de muis lever om de gal af te voeren, zelfs bij dieren met een significante beperking in de biliaire ontwikkeling. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het berekenen van het gemiddelde aantal BDs dat is gekoppeld aan elke portaal ader (PV) in secties die alle lobben van Mutante/transgene muizen beslaan. Bij deze methode worden levers op type wijze gemonteerd en gesectioneerd om de vergelijking tussen verschillende genotypen en experimentele omstandigheden te vergemakkelijken. BDs worden geïdentificeerd door middel van lichte microscopie van cytokeratine-gekleurd cholangiocyten, en vervolgens geteld en gedeeld door het totale aantal Pv's aanwezig in de lever sectie. Als voorbeeld laten we zien hoe deze methode duidelijk onderscheid kan maken tussen wild-type muizen en een muismodel van Alagille syndroom. De hier gepresenteerde methode kan geen vervanging zijn voor technieken die de driedimensionale structuur van de biliaire boom visualiseren. Het biedt echter een eenvoudige en directe manier om de ontwikkeling van BD en de mate van ductulaire reactie vorming bij muizen kwantitatief te beoordelen.
Introduction
De biliaire boom is een cruciaal onderdeel van de lever van zoogdieren, waardoor de passage van gal van hepatocyten in de darm. Intrahepatische galwegen (BDs) worden gevormd door cholangiocyten, die differentiëren van bipotentiaal hepatoblasten door Inkeping en tgfβ signalering1,2. De juiste specificatie en toewijding van cholangiocyten en hun assemblage in volwassen BDs zijn van cruciaal belang voor de ontwikkeling van de Intrahepatische biliaire boom. Naarmate de lever groeit tijdens de ontwikkeling of bij orgaan regeneratie, moet het biliaire systeem langs de lever worden ontwikkeld om een goede galdrainage te garanderen. Bovendien resulteren een aantal syndromische en niet-syndromische ziekten in de paustad van de Intrahepatische BDs3. Bovendien geven een aantal acute en chronische leverziekten aanleiding tot zogenaamde ductular reacties in de lever, die worden gedefinieerd als de aanwezigheid van een significant aantal cellen die biliaire markers uitdrukken, maar niet noodzakelijkerwijs voortvloeien uit biliaire cellen of vorm Patent BDs4. In de multi systeem stoornis Alagille syndroom (algs), haploinsufficiëntie van de inkeping ligand jagged1 (JAG1) resulteert in een slechte BD vorming en cholestase5,6. Ons lab heeft onlangs aangetoond dat een eerder gegenereerde Jag1 heterozygoot Mouse line7 een diermodel is van BD gebrek aan in algs8. In dit muismodel van ALGS zijn cholangiocyten nog steeds aanwezig. Ze zijn echter niet verplicht om zich te integreren in volwassen, patent BDs8. Daarom, analyse van de lever in een model van BD gebrek aan vereist meer dan de schijnbare aanwezigheid of afwezigheid van cholangiocyten. Het is belangrijk om de mate waarin volwassen BDs aanwezig zijn in de lever nauwkeurig te beoordelen.
In anatomische pathologie zijn er geaccepteerde kwantitatieve methoden om te beoordelen of BD gebrek aan9bestaat. Bijvoorbeeld, studies over algs bij menselijke patiënten kwantificeren vaak de BD naar portal ader (PV) ratio door het analyseren van ten minste 10 portaal vaten per leverbiopsie9,10. Analyse van de vorm en de algehele aanwezigheid of afwezigheid van patent BDs, gecombineerd met serum chemie, kan waardevolle informatie verschaffen over de ontwikkeling van BD in muizen11,12,13. Muizen kunnen echter een significant aantal Bdeen verliezen met slechts een bescheiden toename van het serum bilirubine niveau8. Dienovereenkomstig kan een kwantitatieve methode die het aantal aanwezige bd's per PV evalueert, een directere meting van de mate van BD gebrek aan bij muizen opleveren. In een recent rapport kwantificeren we het aantal Bd's per PV over alle lever lobben en rapporteerden we een significante afname in de BD-naar-PV-verhouding in Jag1 +/– dieren8. In de loop van onze analyse merkten we dat ondanks de significante variatie in de mate van inflammatoire respons en ductular reacties, de BD-naar-PV-verhouding niet veel variabiliteit toont8. Bovendien konden we met de kwantificering van de BD-naar-PV-ratio aantonen dat het verwijderen van één exemplaar van het glycosyltransferase gen Poglut1 in Jag1 +/– dieren hun BD gebrek aan8aanzienlijk kan verbeteren. In een Jag1 +/+ achtergrond resulteert voorwaardelijk verlies van Poglut1 in vasculaire gladde spiercellen in een progressieve toename van BD-getallen, wat bescheiden is (20-30%) bij P7 maar wordt prominent bij volwassenen8. Nogmaals, deze techniek liet ons toe om te laten zien dat zelfs bij P7, de toename van BD dichtheid bij deze dieren statistisch significant is. De verhoogde BD-dichtheid in dit genotype op vier maanden leeftijd werd ook gevalideerd door middel van hars giet analyse. 8 deze observaties en andere rapporten die de dichtheid van BD in verschillende algs-muizen modellen14,15 hebben gemeten, hebben ons ertoe aangezet deze methode in onze algemene strategie op te nemen om biliaire defecten in verschillende mutanten te analyseren en transgene muizen.
Hier, we detail een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om te onderzoeken de mate van BD gebrek aan in muismodellen van leverziekte (Figuur 1). Bij deze methode wordt co-kleuring met cholangiocyte markers cytokeratine (CK) 8 en CK19 (hierna Wide-spectrum CK, wsCK) gebruikt om Bd's en cholangiocyten in de muis te visualiseren. Een antilichaam tegen alpha-glad spier actine (αsma) wordt toegevoegd aan de kleuring om schepen te labelen. Systematische analyse van de BD-naar-PV-verhouding in een gedeelte dat alle lever lobben omvat, zorgt ervoor dat een groot aantal Pv's voor elk genotype wordt geanalyseerd. Omdat onze methode gebaseerd is op het kwantificeren van BDs en PVs in 2D-beelden, is het niet geschikt voor het bestuderen van de effecten van een bepaalde mutatie op de 3D-structuur van de galstructuur of de integriteit van de kleine galbuizen. Niettemin biedt het een eenvoudige en objectieve strategie voor onderzoekers om de biliaire ontwikkeling in de muis te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden ondergebracht in een barrière dierenfaciliteit aan Baylor College of Medicine per institutionele richtlijnen voor dierenverzorging en-gebruik en onder erkende dier protocollen.
1. verzameling van muis leverweefsel
-
Bereiding van de muis voor de oogst van de lever
- Euthanas de muis met behulp van isoflurane.
- Voer cervicale dislocatie van de muis om de dood te garanderen.
- Maak een dwarse incisie ongeveer één inch onder de ribbenkast.
- Het gehele ventrale oppervlak van de lever blootstellen.
-
Verzameling van de muis lever
- Zorgvuldig, met kleine schaar, snijd door de ligamenten die de lever verbinden met andere organen in de buik.
- Snijd door de gemeenschappelijke BD om de lever los te maken van de darm.
- Verwijder voorzichtig de lever door op de galblaas te houden en plaats onmiddellijk in een 50 mL buis gevuld tot driekwart met 4% Paraformaldehyde (PFA).
2. fixatie en inbedding van de lever in paraffine
-
Fixatie
- Bevestig het leverweefsel voor 48 h in 4% PFA bij 4 °C.
- Was het weefsel met 70% EtOH voor 1 uur bij 4 °C.
- Was het weefsel tweemaal met 95% EtOH voor 1 h elk bij 4 °C.
- Was het weefsel tweemaal met 100% EtOH voor 1 h elk bij 4 °C.
-
Clearing
- Was het leverweefsel met clearing agent (tabel van de materialen) driemaal gedurende 30 min elk bij kamertemperatuur.
Opmerking: De lever moet stijf aanvoelen na de derde was.
- Was het leverweefsel met clearing agent (tabel van de materialen) driemaal gedurende 30 min elk bij kamertemperatuur.
-
Inbedding in paraffine
- Plaats de weefsel cassette in een weefsel mal in paraffinewas voor 3 wasplaatsen, elk 30 minuten. Wax moet worden voorverwarmd tot 60 °C.
- Vul de weefsel mal met paraffinewas tot driekwart hoogte en bewaar op een verwarmingsblok bij 60 °C.
- Plaats de lever in de mal met de ventrale zijde naar boven gericht.
- Verwijder voorzichtig de mal uit het verwarmingsblok.
- Plaats de bovenkant van de cassette op de mal en top af met hete vloeibare paraffine.
- Laat de mal en blok afkoelen tot kamertemperatuur 's nachts.
Opmerking: Weefsel blokken kunnen nu bij kamertemperatuur worden bewaard.
3. snijden leverweefsel
-
Voorbereiding van het blok voor snijden
- Plaats de mal 5 minuten op het ijs voordat u het blok uit de mal verwijdert.
- Plaats het blok op ijs met een tissuepapier aanwezig tussen blok en ijs.
- Houd het blok op ijs bij het niet snijden voor de beste weefsel snijden resultaten.
-
Snijden van de lever blokken
- Met behulp van een microtoom, beginnen door het snijden door de oppervlakkige, dorsale kant van de lever. Secties moeten 5 μm zijn.
- Controleer de oppervlakkige secties onder een dissectie Microscoop om ervoor te zorgen dat secties niet worden geschoren of gevouwen.
- Neem een deel van de lever dat de caudatumlob bevat.
Opmerking: Voor sommige blokken, zult u de linker, mediale, rechts en caudatus lobben op hetzelfde weefsel segment. - Voor die blokken waar alle vier lobben niet op dezelfde dia aanwezig zijn, blijven snijden totdat de linker, mediale en rechter lobben aanwezig zijn op dezelfde dia.
4. immunohistochemie voor wsCK en αSMA
-
Verwerking van slides voor immunohistochemie
- Selecteer één dia per genotype dat moet worden geanalyseerd.
- Was de glijbaan 15 min in xylene, 100% EtOH, 95% EtOH en tot slot 70% EtOH (3 x 5 min in elke oplossing).
- Was de glijbaan 5 min in gedeïoniseerde H2O.
- Dompel de dia onder in de oplossing voor het ophalen van antigeen (tris-based, High pH).
- Verwarm onder druk in een snelkookpan gedurende 3 min bij 10 psi.
- Laat de glijbaan afkoelen tot kamertemperatuur (ongeveer 35 min).
-
Het blokkeren van de weefsel secties
- Gebruik een PAP-pen om de gedeelten van de dia te schetsen.
- Breng fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,1% tween aan om de sectie tweemaal te bedekken, elk 5 min.
- Maak een blokkerende buffer door normaal Goat serum (NGS) te mengen op 1:50 in PBS + 0,3% Triton. Om voldoende buffer te hebben voor zowel het blokkeren als het primaire antilichaam, is 100 μL per sectie voldoende.
- Breng 100 μL blokkerende oplossing per sectie aan.
- Inbroed de glaasjes bedekt met de blokkerende oplossing bij 4 °C gedurende 1 uur.
-
Kleuring voor wsCK en αSMA
- Verdun anti-CK8 en anti-CK19 antilichamen16 (ontwikkelings studies hybridoma Bank, Troma-I en TROMA-III, respectievelijk) 1:20 in blokkerende buffer tot vlek voor wsck. Verdun het anti-αSMA antilichaam17 (tabel van de materialen) tot 1:200 in dezelfde buffer.
- Breng 100 μL van de verdunde antilichaam oplossing met alle drie de antilichamen aan op elke sectie.
- Inbroed de met de antilichaam oplossing bedekte glijbanen bij 4 °C 's nachts.
- Was de glijbanen met PBS + 0,1% Triton drie keer, 5 min elk.
- Verdunde secundaire antilichamen (anti-rat-Alexa488 en anti-Mouse-Cy5) 1:200 in PBS + 0,3% Triton.
- Breng 100 μL van de secundaire antilichaam oplossing met beide secundaire antilichamen aan op de glaasjes.
- Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
-
DAPI nucleaire kleuring en montage
- Was de dia's drie keer, 5 min elk.
- Breng 100 μL DAPI (1:3000) aan op elke sectie gedurende 10 min.
- Breng anti fade montage medium (inhoudstafel) aan op de dia's en plaats een glazen dekslip bovenop de weefsel secties. Laat de glijbanen 's nachts bij 4 °C liggen. De dia's de volgende dag verzegelen.
- Bewaar de dia's bij 4 °C en de afbeelding binnen 1 week na de montage.
5. beeldvorming en kwantificering van BDs
-
Imaging lever secties
- Vóór de beeldvorming, blind zijn voor het genotype van het monster met behulp van een lablid. Zorg ervoor dat alle beeldvormings bestanden geen genotype of andere specifieke identificerende informatie hebben naast een dier/monster nummer.
- Met behulp van een fluorescerende Microscoop, nemen 20x beelden met 1x zoom van elke sectie en ervoor te zorgen dat elke PV over de lever wordt imaged. Neem de linker, mediale, rechter en caudatumlobben.
Opmerking: We vinden meestal 60-90 Portal Tracts per dier, afhankelijk van de grootte van de lever. - Op zoek naar αSMA plus wsCK kleuring om de PVs te legitimeren. Structuren die αSMA positief zijn maar niet wsCK kleuring zijn geen portaal structuren.
-
Identificatie en telling van BDs
- Maak een werkblad met de volgende kolommen: dier/monster nummer, afbeeldingsnummer, aantal Pv's en aantal Bdeen.
- Door elke afbeelding te gaan, het aantal Pv's per afbeelding te identificeren en op te nemen.
- Identificeer patent BDs in elke afbeelding door de aanwezigheid van cholangiocyten (wsCK +) rondom een definieerbaar lumen. Structuren moeten worden onderscheiden en gescheiden door mesenchym uit andere wsck + cellen.
- Tel elk octrooi BD en plaats in dezelfde kolom als het afbeeldingsnummer.
- Doe dit voor elke afbeelding genomen van een PV.
- Bereken de som van alle Pv's en alle Bd's in het lever monster.
- Bereken de BD-naar-PV-verhouding voor het lever monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We eerder gedocumenteerde biliaire gebreken in Jag1 +/– dieren, een muismodel van algs8. Om de BD-naar-PV-verhouding te bepalen, hebben we P30-muis levers verdeeld en ze samen met de vasculaire marker αSMA aan CK8 en CK19 (wsCK) gekoppeld. Vervolgens hebben we alle Pv's in elk van de lever lobben gefotografeerd. Zoals weergegeven in Fig. 2a, hebben we pv's gedefinieerd als αsma-bevlekte schepen met aangrenzende wsck-kleuring (pijlpunten). De met αSMA bevlekte structuren zonder wsCK waren centrale aders en mogen niet worden opgenomen in de analyse (Arrow).
Toen de PVs werden geïdentificeerd, identificeerden we patent BDs door hun karakteristieke vorm. Zoals weergegeven in Figuur 3, hebben octrooi kanalen een duidelijk definieerbare lumen die wordt omgeven door wsck + cholangiocyten. De kanalen zijn meestal gescheiden van nabijgelegen kanalen of cholangiocyten door mesenchym (pijlpunt). wsCK + cellen die niet een definieerbaar lumen hebben, worden aan aangrenzende cellen bevestigd of in afzondering weergegeven, worden niet meegeteld voor het totale aantal BDs (pijlen). Afbeelding 3a toont een wild-type lever sectie met een PV die wordt geassocieerd met een volledig patent duct samen met verschillende cellen van het rechtsstelsel. Figuur 3b is een representatieve lever sectie van een P30 Jag1 +/– dier. Er zijn geen patent BDs aanwezig rond de drie Pv's in deze sectie. Alle wsCK +-cellen zijn zonder rechtspersoonlijkheid en mogen daarom niet worden geteld. Deze afbeelding benadrukt het belang van zorgvuldige BD-telling, aangezien de aanwezigheid of afwezigheid van wsCK +-cellen de Jag1 +/– en wild-type levers niet onderscheidt.
Zoals in figuur 1dis aangetoond, omvat de analyse van de BD-naar-PV-verhouding elke pv in de lever sectie, samen met het totale aantal octrooi bd's dat rond elke PV aanwezig is. Tijdens het analyseren van de Jag1 +/– levers, merkten we dat verschillende lobben niet noodzakelijkerwijs in dezelfde mate worden beïnvloed bij deze dieren (niet-gepubliceerde gegevens). Daarom tellen we meestal PVs over de linker, mediale, rechter en caudatumlobben om een volledige lever dekking te garanderen. Na de Tabulatie van de totale PVs en Bdeen wordt de verhouding berekend voor de hele sectie.
In Figuur 4toonden we de analyse van de BD naar PV verhoudingen voor 3 wild-type en 3 Jag1 +/– dieren. Deze grafiek laat zien hoe de twee genotypen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden op basis van BD tellingen. Bovendien biedt deze methode een kwantitatieve maatstaf voor de analyse van de mate van redding van het Jag1 +/– fenotype door genetische manipulaties, zoals eerder gemeld8.
Figuur 1: schematische voorstelling van het experimentele proces. A) de lever wordt geheel van de muis geoogst. B) lever monsters zijn vastgesteld voor 48 h, gedehydrateerd en geklaard. C) het leverweefsel is ingebed in paraffine. Secties worden gemaakt en geplaatst op geladen dia's en gekleurd voor wsCK en αSMA. D) de dia's worden afgebeeld en het aantal Pv's en bd's wordt geregistreerd. De BD-naar-PV-verhouding (BD: PV) wordt berekend voor de gehele lever sectie. HA = hepatische slagader; CV = centrale ader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: centrale aderen onderscheiden van PVs. A) een PV wordt geïdentificeerd door de aanwezigheid van αsma-kleuring en de omringende wsck + cholangiocyten (pijlpunten). B) de centrale aders worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van αsma-kleuring zonder wsck + cholangiocyten rond de structuur (pijl). (A ' en B ') Grijswaardenafbeeldingen die de αSMA-kanalen van respectievelijk A en B tonen. Schaalbalk = 100 μm en is van toepassing op alle panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: identificatie van patent BDs. (a-a ') In P30 wild-type levers tellen we rond tot ellipsoïde structuren met een onderscheidingsvermogen, omringd door wsck + cholangiocyten als een octrooi BD (pijlpunt). Cholangiocyten die niet rond een lumen worden beschouwd als een plaats en worden niet geteld (pijlen). (b-b ') In Jag1 +/– levers zijn cholangiocyten nog steeds aanwezig (pijlen). De meeste zijn echter niet opgenomen in patent BDs. schaalbalk = 100 μm en is van toepassing op alle panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: de BD naar PV Graph van P30 muis levers. Bd's en Pv's worden gekwantificeerd en de BD-naar-PV-verhouding wordt gegenereerd. Zoals eerder gemeld8, Jag1 +/– dieren hebben een karakteristieke en significante afname van BD naar PV verhouding in vergelijking met wild-type dieren. Voor statistische analyse werd een tweeweg- t-toets uitgevoerd. Horizontale lijnen tonen middelen. P< 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse van de ontwikkeling en reparatie van BD bij muizen is een belangrijk hulpmiddel bij het bestuderen van de pathogenese en het mechanisme van cholestatische aandoeningen. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe therapieën deels afhankelijk van het tot stand brengen van een reproduceerbare en bij voorkeur kwantificeerbaar fenotype. Huidige fenotyping in muismodellen omvat meestal serum chemie, lever histologie en immunokleuring voor cel-type specifieke markers. Hoewel deze technieken waardevolle informatie genereren over de structuur en functie van het galsysteem, bieden ze geen directe meting van de effecten van een bepaalde genetische manipulatie op het aantal Bd's. In anatomische pathologie wordt BD gebrek aan bij humane patiënten bepaald door de analyse van BD naar PV ratio in een biopsie sectie9. Terwijl clinici serum chemie analyse gebruiken om de ernst van cholestase en leverziekte in algs en andere cholestatische ziekten te bepalen18,19, histologische beoordeling in muismodellen is essentieel voor beide begrijpen de effecten van ziekte modificatoren op de ontwikkeling van BD en de effectiviteit van therapieën op het herstel van de normale kanaal ontwikkeling. Dit is deels omdat muizen een ernstige afname van het aantal patent BDs kunnen hebben, maar nog steeds slechts een bescheiden toename van het serum bilirubine niveau8vertonen, waarschijnlijk als gevolg van de zeer efficiënte galdrainage in de muis lever. Ons vorige werk heeft aangetoond dat Jag1 heterozygosity resulteert in verminderde BD rijping, maar niet de afwezigheid van cholangcioytes8. Dus, om de ontwikkeling van BD te analyseren en de ernst van de ziekte in muizen modellen te beoordelen, is het niet voldoende om alleen de afwezigheid of aanwezigheid van cholangiocyten te onderzoeken. Om dit probleem op te lossen, hebben we hier een eenvoudige methode voor objectieve meting van patent BD-nummers in de lever van de muis gepresenteerd.
Onze analyse is afhankelijk van de juiste fixatie en inbedding van de muis lever. Livers zijn ingesloten ventrale zijde omhoog om te zorgen voor vergelijkbare snijden van het ene monster naar het andere. Dit is de meest stabiele positie. De voor de kleuring gebruikte secties moeten diep genoeg in de lever lobben zijn, omdat er verschillen zijn in het aantal Bd's en de grootte van de Pv's in de periferie versus het Hilum van de lever. We zien af en toe PVs die longitudinaal worden gesneden. In die gevallen is er meestal een naburige BD die ook longitudinaal wordt gesneden en als een lange open buis lijkt. Om de reproduceerbaarheid te garanderen, tellen we deze lange buizen als één BD. identificatie van patent BDs is voor het grootste deel eenduidig. Sommige galstructuren lijken echter gelumeniseerd, maar tonen niet de ronde aan de ellipsoïde morfologie die meestal wordt gezien in normaal BDs14. In onze handen kan dit soms resulteren in een structuur die een BD wordt genoemd door een onderzoeker, maar niet door een andere collega. Om consistentie en reproduceerbaarheid in gegevensanalyse en-presentatie te garanderen, raden we daarom aan om alle monsters met betrekking tot een specifiek project afzonderlijk te analyseren door twee onderzoekers.
Anti-CK8 is aangetoond dat onrijpe en volwassen biliaire cellen markeren, terwijl anti-CK19 alleen volwassen biliaire cellen12,20markeert. Daarom, zelfs als een PV niet is gekoppeld aan een volwassen BD, het kan gemakkelijk worden onderscheiden van centrale aders vanwege de aanwezigheid van CK8 + cellen. Het gebruik van deze twee antilichamen in combinatie met anti-αSMA zorgt voor een volledige dekking van portal Tracts in onze kwantificering. Bovendien genereert de individuele CK19-of CK8 kleuring van de biliaire cellen in onze handen een relatief zwak signaal en wordt het geassocieerd met enige achtergrondkleuring. Het mengen van de twee CK-antilichamen resulteert in een consistent sterk signaal in biliaire cellen en vergemakkelijkt daarom de kwantificering.
Rijping van de Intrahepatische biliaire boom treedt op in een hilar-naar-perifere richting en gaat verder dan postnataal21. Inderdaad, er zijn veel meer onrijpe cholangiocyten in vroege postnatale levers, vooral in perifere gebieden, die op het leidende front van postnatale lever expansie. Bovendien, we waargenomen een verandering in BD getallen als de dieren leeftijd8, met meer kanalen in oudere dieren. Daarnaast bevatten sommige portaal structuren meerdere Bd's, terwijl andere een of geen kanalen hebben, met name langs de periferie van de lever. We gebruiken een microscopie dia die alle lever lobben voor elk dier bedekt en systematisch de BD-naar-PV-verhouding over de hele glijbaan kwantificeren. Hoewel dit niet essentieel is, het zorgt ervoor dat ruime Portal Tracts worden geanalyseerd voor elk dier ongeacht leeftijd en lever grootte (60-90 PVs per lever afhankelijk van het genotype en leeftijd). Bovendien, door het analyseren van alle pv's op de glijbaan, zorgen we ervoor dat zowel volwassen aanhangsel en minder volwassen perifere gebieden worden geteld in alle stadia van de ontwikkeling van de lever. Het bedekken van alle lever lobben voor elk dier kan ook de variabiliteit in metingen verminderen als een bepaalde mutatie de ontwikkeling van BD niet gelijkmatig over de lever beïnvloedt.
De methode is beperkt in het onderscheiden van kleinere gal leidingen uit groepen van het rechtsgebied biliaire cellen. De gal ductules4 zijn meestal te klein om te worden herkend als een gelumeniseerde structuur in de vergroting die we gebruiken om deze kleuringen te analyseren. Daarom zullen ze waarschijnlijk worden uitgesloten van onze kwantificaties, en dus is de methode scheefgetrokken naar het identificeren van medium tot grote kanalen. Ondanks deze beperking maakt de hier beschreven methode gemakkelijk onderscheid tussen de Jag1 +/– en Jag1 +/+ Livers. Bovendien is het gevoelig genoeg om de gedeeltelijke redding van de Jag1 +/– BD gebrek aan te detecteren bij gelijktijdig verlies van één exemplaar van Polgut1 +/– en de bescheiden toename van de BD-dichtheid in Jag1 +/+ dieren met voorwaardelijk verlies van Poglut1 in vasculaire gladde spiercellen8. Deze waarnemingen wijzen op het nut van deze methode bij het bepalen van wijzigingen in de dichtheid van BD in verschillende genetische achtergronden, zelfs wanneer de veranderingen in het BD-nummer bescheiden zijn.
In de afgelopen jaren is visualisatie van de 3D-structuur van de biliaire boom door verschillende groepen gebruikt om de ontwikkeling van BD22,23,24,25te analyseren. Deze elegante methoden zijn afhankelijk van het vullen van de galboom van de gemeenschappelijke BD door inkt of hars, en onderzoeken daarom de doorgankelijkheid van het galstelsel. Bovendien geven ze informatie over de 3D-structuur van de biliaire boom en de vorming ervan in de lever periferie naarmate de lever groeit, wat niet kan worden beoordeeld door 2D-beoordeling die wordt gebruikt in protocollen zoals die hier worden gepresenteerd. Succesvolle prestaties van deze 3D-visualisatietechnieken vereisen echter een aanzienlijke expertise26. De hier gepresenteerde techniek daarentegen is vrij eenvoudig en kan worden uitgevoerd door elke groep met toegang tot routine apparatuur voor histologische en imaging-analyse. Bovendien, analyse van de secties dubbel gekleurd voor wsck en αsma zal ook aantonen of ductular reacties of vasculaire gladde spiercellen afwijkingen bestaan in de lever8,27,28. We stellen voor dat het kwantificeren van de BD-naar-PV-verhouding in de hele lever secties een gevoelige en reproduceerbare meting van de biliaire ontwikkeling bij muizen kan opleveren en kan dienen als een relatief eenvoudige techniek om de onderzoekers te helpen beslissen of ze meer moeten overwegen geavanceerde technieken zoals 3D-visualisatie van de biliaire boom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 en R01 DK109982), een pilot/haalbaarheids Award van de Texas Medical Center spijsvertering ziekte centrum onder NIH P30 DK56338, en een Alagille syndroom Accelerator Award van De medische basis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
