Summary
Nous présentons une méthode assez simple et sensible pour la quantification précise de la densité de conduit biliaire dans le foie de souris. Cette méthode peut aider à déterminer les effets des modificateurs génétiques et environnementaux et l'efficacité des thérapies potentielles dans les modèles murins des maladies biliaires.
Abstract
La souris est largement utilisée comme organisme modèle pour étudier les maladies biliaires. Pour évaluer le développement et la fonction du système biliaire, diverses techniques sont utilisées, y compris la chimie du sérum, l'analyse histologique et l'immunostaining pour des marqueurs spécifiques. Bien que ces techniques puissent fournir des informations importantes sur le système biliaire, elles ne présentent souvent pas une image complète des défauts développementaux du canal biliaire (BD) sur l'ensemble du foie. Cela est dû en partie à la capacité robuste du foie de souris à drainer la bile, même chez les animaux ayant une déficience significative dans le développement biliaire. Ici, nous présentons une méthode simple pour calculer le nombre moyen de BD associés à chaque veine de portail (PV) dans les sections couvrant tous les lobes des souris mutantes/transgéniques. Dans cette méthode, les foies sont montés et sectionnés d'une manière stéréotypée pour faciliter la comparaison entre divers génotypes et conditions expérimentales. Les BD sont identifiés par microscopie légère des cholangiocytes teintés de cytokératine, puis comptés et divisés par le nombre total de PV présents dans la section de foie. À titre d'exemple, nous montrons comment cette méthode peut clairement distinguer entre les souris de type sauvage et un modèle de souris du syndrome d'Alagille. La méthode présentée ici ne peut se substituer aux techniques qui visualisent la structure tridimensionnelle de l'arbre biliaire. Cependant, il offre un moyen facile et direct d'évaluer quantitativement le développement de la BD et le degré de formation de réaction ductulaire chez la souris.
Introduction
L'arbre biliaire est une partie critique du foie des mammifères, permettant le passage de la bile des hépatocytes dans l'intestin. Les canaux biliaires intrahépatiques (BD) sont formés par des cholangiocytes, qui se différencient des hépatoblastes bipotentiels par Notch et TGFMD signalant1,2. La spécification et l'engagement appropriés des cholangiocytes et de leur assemblage dans les BD mûrs sont essentiels pour le développement de l'arbre biliaire intrahépatique. Comme le foie se développe pendant le développement ou lors de la régénération des organes, le système biliaire doit se développer le long du foie pour assurer un drainage biliaire approprié. En outre, un certain nombre de maladies syndromicmiques et non-syndromamiques ont comme conséquence le manque de BDs intrahépatiques3. En outre, un certain nombre de maladies hépatiques aigues et chroniques donnent lieu à des réactions dites canalulaires dans le foie, qui sont définies comme la présence d'un nombre important de cellules qui expriment des marqueurs biliaires, mais ne proviennent pas nécessairement de cellules biliaires ou de la forme brevet BDs4. Dans le désordre multisystème syndrome d'Alagille (ALGS), haploinsufficiency de la ligand de Notch degged1 (JAG1) a comme conséquence la formation pauvre de BD et la cholestasis5,6. Notre laboratoire a récemment démontré qu'une ligne de souris Heterozygous Jag1 déjà générée7 est un modèle animal de paucité BD dans ALGS8. Dans ce modèle de souris d'ALGS, les cholangiocytes sont toujours présents. Cependant, ils ne s'engagent pas à l'incorporation dans les BD de brevet mûrs8. Par conséquent, l'analyse du foie dans un modèle de manque de BD exige plus que la présence apparente ou l'absence des cholangiocytes. Il est important d'évaluer avec précision la mesure dans laquelle les BD matures sont présents dans le foie.
Dans la pathologie anatomique, il existe des méthodes quantitatives acceptées pour évaluer si le manque de BD existe9. Par exemple, les études sur l'ALGS chez les patients humains quantifient souvent le rapport BD à veine portail (PV) en analysant au moins 10 vaisseaux portailpar biopsie du foie9,10. L'analyse de la forme et de la présence globale ou de l'absence de BD de brevet, combinée avec la chimie de sérum, peut fournir l'information valable au sujet du développement de BD chez les souris11,12,13. Cependant, les souris peuvent perdre un nombre significatif de BD avec seulement une augmentation modeste du niveaudebilirubine de sérum 8. En conséquence, une méthode quantitative qui évalue le nombre de BD présents par PV peut fournir une mesure plus directe du degré de manque de BD chez les souris. Dans un rapport récent, nous avons quantifié le nombre de BD par PV sur tous les lobes dufoie et signalé une diminution significative du rapport BD/PV chez les animaux Jag1MD/8 . Au cours de notre analyse, nous avons remarqué que, malgré la variation significative du degré de réponse inflammatoire et des réactions ductulaires, le rapport BD/PV ne montre pas beaucoup de variabilité8. De plus, la quantification du ratio BD/PV nous a permis de démontrer que la suppression d'une copie du gène de glycosyltransferase Poglut1 chez les animaux Jag1MD/MD peut améliorer considérablement leur paucity BD8. Dans un contexte Jag1/ MD, la perte conditionnelle de Poglut1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires entraîne une augmentation progressive du nombre de BD, qui est modeste (20-30%) à P7, mais devient important chez les adultes8. Encore une fois, cette technique nous a permis de montrer que même à P7, l'augmentation de la densité de BD chez ces animaux est statistiquement significative. Il convient de noter que l'augmentation de la densité de BD dans ce génotype à l'âge de quatre mois a été validée par l'analyse de fonte de résine aussi bien. 8 Ces observations et d'autres rapports qui ont mesuré la densité de BD dans différents modèles de souris d'ALGS14,15 nous ont incités à incorporer cette méthode dans notre stratégie globale pour analyser des défauts biliaires dans divers mutants et les souris transgéniques.
Ici, nous détaillons une technique simple qui peut être utilisée pour examiner le degré de manque de BD dans les modèles murins de maladie du foie (Figure 1). Dans cette méthode, la co-coloration avec des marqueurs de cholangiocyte cytokatin (CK) 8 et CK19 (ci-après à large spectre CK, wsCK) est employée pour visualiser BDs et cholangiocytes non incorporés dans le foie de souris. Un anticorps contre l'actine musculaire alpha-lisse est ajouté à la coloration pour étiqueter les vaisseaux. L'analyse systématique du rapport BD/PV dans une section couvrant tous les lobes du foie garantit qu'un grand nombre de PV sont analysés pour chaque génotype. Étant donné que notre méthode repose sur la quantification des BD et des PV en images 2D, elle n'est pas adaptée pour étudier les effets d'une mutation donnée sur la structure 3D de l'arbre biliaire ou l'intégrité des petits conduits biliaires. Néanmoins, il fournit une stratégie simple et objective pour les chercheurs d'évaluer le développement biliaire chez la souris.
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Protocol
Tous les animaux ont été logés dans un établissement pour animaux de barrière au Baylor College of Medicine selon les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et en vertu de protocoles approuvés pour les animaux.
1. Collection de tissu de foie de souris
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Préparation de la souris pour la récolte du foie
- Euthanasier la souris à l'aide d'isoflurane.
- Effectuer la dislocation cervicale de la souris pour assurer la mort.
- Faire une incision transversale d'environ un pouce sous la cage thoracique.
- Exposer toute la surface ventrale du foie.
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Collection du foie de souris
- Soigneusement, avec de petits ciseaux, couper à travers les ligaments reliant le foie à d'autres organes de l'abdomen.
- Couper à travers le BD commun pour détacher le foie de l'intestin.
- Retirez soigneusement le foie en s'accrochant à la vésicule biliaire et placez-le immédiatement dans un tube de 50 ml rempli à trois quarts par 4 % de paraformaldéhyde (PFA).
2. Fixation et intégration du foie dans la paraffine
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fixation
- Fixer le tissu hépatique pendant 48 h dans 4% de PFA à 4 oC.
- Laver le tissu à l'etohetOH à 70 % pendant 1 h à 4 oC.
- Laver le tissu deux fois avec 95% EtOH pendant 1 h chacun à 4 oC.
- Laver le tissu deux fois avec 100% EtOH pendant 1 h chacun à 4 oC.
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clairière
- Laver le tissu hépatique avec l'agent de compensation (Table des matériaux) trois fois pendant 30 min chacun à température ambiante.
REMARQUE: Le foie doit se sentir rigide après le troisième lavage.
- Laver le tissu hépatique avec l'agent de compensation (Table des matériaux) trois fois pendant 30 min chacun à température ambiante.
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Intégration dans la paraffine
- Placer la cassette de tissu dans un moule de tissu dans la cire de paraffine pendant 3 lavages, 30 min chacun. La cire doit être préchauffée à 60 oC.
- Remplir le moule de tissu de cire de paraffine à trois quarts de hauteur et de garder sur un bloc de chauffage à 60 oC.
- Placez le foie dans le moule avec le côté ventral vers le haut.
- Retirez soigneusement le moule du bloc chauffant.
- Placer le dessus de la cassette sur le moule et garnir de paraffine liquide chaude.
- Laisser refroidir le moule et le bloc à température ambiante pendant la nuit.
REMARQUE: Les blocs de tissus peuvent maintenant être stockés à température ambiante.
3. Sectiondure le tissu hépatique
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Préparation du bloc pour la sectionnement
- Placer le moule sur la glace pendant 5 min avant de retirer le bloc du moule.
- Placez le bloc sur la glace avec un papier de tissu de laboratoire présent entre le bloc et la glace.
- Gardez le bloc sur la glace lorsqu'il n'est pas sectionné pour obtenir les meilleurs résultats de découpe des tissus.
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Sectiondes des blocs de foie
- À l'aide d'un microtome, commencez par sectionner à travers le côté superficiel et dorsal du foie. Les sections doivent être de 5 m.
- Vérifiez les sections superficielles sous un microscope de dissection pour s'assurer que les sections ne sont pas cisaises ou pliées.
- Prenez une section du foie qui comprend le lobe caudate.
REMARQUE: Pour certains blocs, vous aurez la gauche, médial, droit et lobes caudate sur la même tranche de tissu. - Pour les blocs où les quatre lobes ne sont pas présents sur la même diapositive, continuer à trancher jusqu'à ce que les lobes gauche, médial et droit sont présents sur la même diapositive.
4. Immunohistochimie pour wsCK et SMA
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Traitement des diapositives pour immunohistochimie
- Sélectionnez une diapositive par génotype à analyser.
- Laver la glissière pendant 15 min en xylène, 100% EtOH, 95% EtOH et enfin 70% EtOH (3 x 5 min dans chaque solution).
- Laver la glissière pendant 5 min en H2O déionisée.
- Immerger la diapositive dans la solution de récupération d'antigène (tris à base, pH élevé).
- Chauffer sous pression dans un autocuiseur pendant 3 min à 10 psi.
- Laisser refroidir la glissière à température ambiante (environ 35 min).
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Blocage des sections tissulaires
- À l'aide d'un stylo Pap, esquissez les sections de la diapositive.
- Appliquer la saline tamponnée en phosphate (PBS) à 0,1 % de tween pour couvrir la section deux fois, 5 min chacune.
- Faire tampon de blocage en mélangeant normal sérum de chèvre (NGS) à 1:50 dans PBS - 0,3% Triton. Pour avoir suffisamment de tampon pour bloquer et l'application d'anticorps primaires, 100 L par section est suffisant.
- Appliquer 100 ll de solution de blocage par section.
- Incuber les glissières recouvertes de la solution de blocage à 4 oC pendant 1 h.
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Coloration pour wsCK et SMA
- Diluer les anticorps anti-CK8 et anti-CK1916 (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I et TROMA-III, respectivement) 1:20 en bloquant le tampon à tacher pour wsCK. Diluer l'anticorps anti-SMA17 (Tableau des Matériaux) à 1:200 dans le même tampon.
- Appliquer 100 l de la solution d'anticorps dilué contenant les trois anticorps à chaque section.
- Incuber les lames recouvertes de la solution d'anticorps à 4 oC pendant la nuit.
- Laver les diapositives avec PBS - 0,1% Triton trois fois, 5 min chacun.
- Diluer les anticorps secondaires (anti-rat-Alexa488 et anti-souris-Cy5) 1:200 dans PBS - 0,3% Triton.
- Appliquer 100 l de la solution d'anticorps secondaire contenant les deux anticorps secondaires sur les diapositives.
- Incuber à température ambiante pendant 1 h.
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DAPI coloration nucléaire et le montage
- Laver les toboggans trois fois, 5 min chacun.
- Appliquer 100 l de DAPI (1:3000) sur chaque section pendant 10 min.
- Appliquer Antifade Mounting Medium (Table of Materials) sur les diapositives et placer une feuille de verre sur les sections de tissu. Laisser les toboggans à 4 oC toute la nuit. Scellez les diapositives le lendemain.
- Conserver les diapositives à 4 oC et l'image dans la semaine suivant le montage.
5. Imagerie et quantification des BD
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Imagerie des sections du foie
- Avant l'imagerie, aveuglez-vous au génotype de l'échantillon avec l'aide d'un membre du laboratoire. Assurez-vous que tous les fichiers d'imagerie sont dépourvus de génotype ou d'autres informations d'identification spécifiques en plus d'un numéro animal/échantillon.
- À l'aide d'un microscope fluorescent, prendre des images 20x à 1x zoom de chaque section et s'assurer que chaque PV à travers le foie est image. Inclure les lobes gauche, médial, droit et caudate.
REMARQUE: Nous trouvons habituellement 60-90 voies de portail par animal selon la taille du foie. - Pour identifier les PV, recherchez la coloration de l'ASSa et de la wsCK. Les structures qui sont positives à l'ASM mais qui manquent de coloration wsCK ne sont pas des structures de portail.
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Identification et comptage des BD
- Créez une feuille de calcul avec les colonnes suivantes : Numéro animal/échantillon, Numéro d'image, Nombre de PV et Nombre de BD.
- En parcourant chaque image, identifiez et enregistrez le nombre de PV par image.
- Identifiez les BD brevetés dans chaque image par la présence de cholangiocytes (wsCKMD) entourant un lumen définissable. Les structures doivent être distinctes et séparées par le mésenchyme des autres cellules wsCKMD.
- Comptez chaque brevet BD et placez-le dans la même colonne que le numéro d'image.
- Faites ceci pour chaque image prise d'un PV.
- Calculez la somme de tous les PV et de tous les BD de l'échantillon de foie.
- Calculer le rapport BD/PV pour l'échantillon de foie.
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Representative Results
Nous avons précédemment documenté des défauts biliaires chez les animaux Jag1MD/ , un modèle de souris d'ALGS8. Pour déterminer le rapport BD/PV, nous avons sectionné les foies de souris P30 et les avons tachés pour CK8 et CK19 (wsCK) avec le marqueur vasculaire 'SMA. Nous avons ensuite photographié tous les PV dans chacun des lobes du foie. Comme le montre la figure 2A, nous avons défini les PV comme des navires tachés de SMA qui ont des taches de wsCK adjacentes (pointes de flèche). Les structures tachées par la SMA sans wsCK étaient des veines centrales et ne devraient pas être incluses dans l'analyse (flèche).
Une fois que les PV ont été identifiés, nous avons identifié les BD de brevet par leur forme caractéristique. Comme le montre la figure3, les conduits de brevet ont un lumen clairement définissable qui est entouré de cholangiocytes wsCKMD. Les conduits sont généralement séparés des conduits ou des cholangiocytes à proximité par le mesenchyme (tête de flèche). les cellules wsCKMD qui n'ont pas de lumen définissable, qui sont fixées à des cellules adjacentes ou qui apparaissent isolément ne sont pas comptées dans le nombre total de BD (flèches). La figure 3A montre une section de foie de type sauvage avec un PV qui est associé à un conduit entièrement breveté avec plusieurs cellules non incorporées. La figure 3B est une section hépatique représentative d'un animal P30 Jag1MD.MD. Aucun BD breveté n'est présent autour des trois PV de cette section. Toutes les cellules wsCKMD ne sont pas incorporées et ne doivent donc pas être comptées. Cette image souligne l'importance d'un comptage soigneux de la DB, car la présence ou l'absence de cellules wsCKMD ne différencie pas les foies Jag1MD et sauvages.
Comme le montre la figure 1D, l'analyse du rapport BD/PV consiste à compter chaque PV dans la section hépatique ainsi que le nombre total de BD brevetés présents autour de chaque PV. En analysant les foies Jag1MD/, nous avons remarqué que différents lobes ne sont pas nécessairement affectés dans la même mesure chez ces animaux (données non publiées). Par conséquent, nous comptons habituellement des PV à travers la gauche, les lobes médial, droit et caudate pour assurer la couverture complète du foie. Après la tabulation du nombre total de PV et de BD, le ratio est calculé pour l'ensemble de la section.
Dans la figure 4, nous avons montré l'analyse des rapports BD/PV pour 3 animaux de type sauvage et 3 Jag1MD/MD. Ce graphique montre comment les deux génotypes peuvent être facilement distingués en fonction du nombre de BD. En outre, cette méthode fournit une mesure quantitative pour l'analyse du degré de sauvetage du phénotype Jag1 / par des manipulations génétiques, comme indiqué précédemment8.
Figure 1 : Schéma du processus expérimental. (A) Le foie est récolté entier à partir de la souris. (B) Les échantillons de foie sont fixés à 48 h, déshydratés et effacés. (C) Le tissu hépatique est incorporé dans la paraffine. Les sections sont faites et placées sur des glissières chargées et tachées pour wsCK et SMA. (D) Les diapositives sont représentées et le nombre de PV et de BD sont enregistrés. Le rapport BD/PV (BD:PV) est calculé pour toute la section hépatique. HA - artère hépatique; CV et veine centrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Distinguer les veines centrales des PVs. (A) Un PV est identifié par la présence de tacles de 'SMA' et de cholangiocytes wsCKMD environnants (pointes de flèche). (B) Les veines centrales sont identifiées par la présence de taches de sMA sans cholangiocytes wsCKMD présents autour de la structure (flèche). (A' et B') Images à l'échelle grise montrant les canaux de l'A et de la B, respectivement. Barre d'échelle de 100 m et s'applique à tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Identification des BD de brevets. (A-A') Dans les foies de type sauvage P30, nous comptons les structures ellipsoïdes rondes aux structures ellipsoïdes avec un lumen discernable entouré de cholangiocytes wsCKMD comme brevet BD (arrowhead). Les cholangiocytes qui n'entourent pas un lumen sont considérés comme non incorporés et ne sont pas comptés (flèches). (B-B') Dans les foies Jag1MD/, les cholangiocytes sont toujours présents (flèches). Cependant, la plupart ne sont pas incorporés dans les BD brevetés. Barre d'échelle de 100 m et s'applique à tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Le graphique BD à PV des foies de souris P30. Les BD et les PV sont quantifiés et le rapport BD/PV est généré. Comme indiqué précédemment8, les animaux Jag1MD/MD ont une diminution caractéristique et significative du ratio BD/PV par rapport aux animaux de type sauvage. Pour l'analyse statistique, le test tbidirectionnel a été effectué. Les lignes horizontales montrent les moyens. P'lt;0.001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'analyse du développement et de la réparation de BD chez les souris est un outil important en étudiant la pathogénie et le mécanisme des désordres cholestatic. En outre, le développement de nouvelles thérapies dépend en partie de l'établissement d'un phénotype reproductible et de préférence quantifiable. Le phénotypage actuel dans les modèles de souris implique habituellement la chimie de sérum, l'histologie de foie et l'immunostaining pour des marqueurs spécifiques de cellules-type. Bien que ces techniques génèrent des informations précieuses sur la structure et la fonction du système biliaire, elles ne fournissent pas une mesure directe des effets d'une manipulation génétique donnée sur le nombre de BD. Dans la pathologie anatomique, le manque de BD dans les patients humains est déterminé par l'analyse du rapport BD/PV dans une section9de biopsie. Tandis que les cliniciens emploient l'analyse de chimie de sérum pour déterminer la sévérité de la cholestasis et de la maladie de foie dans ALGS et d'autres maladies cholestatiques18,19, l'évaluation histologique dans les modèles de souris est critique à la fois pour comprendre les effets des modificateurs de la maladie sur le développement de la Maladie d'Alzheimer et l'efficacité des thérapies sur le rétablissement du développement normal des canaux. C'est en partie parce que les souris peuvent avoir une diminution grave du nombre de BD de brevet mais montrent toujours seulement une augmentation modeste du niveau8de bilirubin de sérum, probablement dû au drainage très efficace de bile dans le foie de souris. Nos travaux précédents ont montré que l'hétérozygosité Jag1 entraîne une altération de la maturation de la DB, mais pas l'absence de cholangcioytes8. Ainsi, pour analyser le développement de la Maladie d'Alzheimer et évaluer la gravité de la maladie dans les modèles murins, il ne suffit pas d'examiner simplement l'absence ou la présence de cholangiocytes. Pour résoudre ce problème, nous avons présenté ici une méthode simple pour la mesure objective des nombres de BD de brevet dans le foie de souris.
Notre analyse dépend de la fixation et de l'intégration appropriées du foie de souris. Les foies sont intégrés côté ventral vers le haut pour assurer une section similaire d'un échantillon à l'autre. C'est la position la plus stable. Les sections utilisées pour la coloration doivent être suffisamment profondes dans les lobes du foie, car il existe des différences dans le nombre de BD et la taille des PV dans la périphérie par rapport au hilum du foie. Nous voyons parfois des PV qui sont coupés longitudinalement. Dans ces cas, il ya généralement un BD voisin qui est également coupé longitudinalement et apparaît comme un long tube ouvert. Pour assurer la reproductibilité, nous comptons ces tubes longs comme un seul BD. L'identification des BD de brevet est pour la plupart sans ambiguïté. Cependant, certaines structures biliaires semblent lumenisées, mais ne montrent pas la morphologie ronde à ellipsoïde généralement observée dans les BD normaux14. Dans nos mains, cela peut parfois entraîner une structure appelée un BD par un enquêteur, mais pas par un autre collègue. Par conséquent, afin d'assurer l'uniformité et la reproductibilité dans l'analyse et la présentation des données, nous recommandons que tous les échantillons liés à un projet spécifique soient analysés par deux chercheurs de façon indépendante.
Anti-CK8 a été montré pour marquer les cellules biliaires immatures et matures, tandis que l'anti-CK19 ne marque que les cellules biliaires matures12,20. Par conséquent, même si un PV n'est pas associé à un BD mature, il peut être facilement différencié des veines centrales en raison de la présence de cellules CK8. L'utilisation de ces deux anticorps en combinaison avec l'anti-SMA assure une couverture complète des voies de portail dans notre quantification. En outre, dans nos mains, la coloration ck19 ou CK8 individuelle des cellules biliaires génère un signal relativement faible et est associée à une certaine coloration de fond. Le mélange des deux anticorps CK donne un signal constamment fort dans les cellules biliaires et facilite donc la quantification.
La maturation de l'arbre biliaire intrahépatique se produit dans une direction hilar-à-périphérique et continue postnatalement21. En effet, il y a beaucoup plus de cholangiocytes immatures dans les foies postnatals tôt, particulièrement dans les secteurs périphériques, qui sont à l'avant principal de l'expansion postnatale de foie. En outre, nous avons observé un changementdans les nombres de BD pendant que les animaux vieillissent 8, avec plus de conduits chez les animaux plus âgés. En outre, certaines structures de portail contiennent plusieurs BD tandis que d'autres ont un ou aucun conduit, en particulier le long de la périphérie du foie. Nous utilisons une diapositive de microscopie couvrant tous les lobes du foie pour chaque animal et quantifions systématiquement le rapport BD/PV sur l'ensemble de la diapositive. Bien que ce n'est pas essentiel, il garantit que de vastes voies portail sont analysés pour chaque animal indépendamment de l'âge et la taille du foie (60-90 PV par foie en fonction du génotype et l'âge). De plus, en analysant tous les PV sur la diapositive, nous veillons à ce que les zones périphériques plus matures et les zones périphériques moins matures soient comptées à tous les stades du développement du foie. La couverture de tous les lobes du foie pour chaque animal peut également diminuer la variabilité des mesures si une mutation donnée n'affecte pas uniformément le développement de la BD dans l'ensemble du foie.
La méthode est limitée dans la distinction des conduits biliaires plus petits des groupes de cellules biliaires non incorporées. Les ductules biliaires4 sont généralement trop petites pour être reconnues comme une structure lumenisée dans le grossissement que nous utilisons pour analyser ces taches. Par conséquent, ils sont susceptibles d'être exclus de nos quantifications, et donc la méthode est biaisée vers l'identification des canaux moyens à grands. Malgré cette limitation, la méthode décrite ici fait facilement la distinction entre les foies Jag1MD et Jag1MD/MD. De plus, il est suffisamment sensible pour détecter le sauvetage partiel du manque de Jag1/ BD après la perte simultanée d'une copie de Polgut1et et l'augmentation modeste de la densité de BD chez les animaux Jag1MD/MD avec perte conditionnelle de Poglut1 dans les cellules musculaires vasculaires lisses8. Ces observations indiquent l'utilité de cette méthode pour déterminer les altérations de la densité de la DB dans divers milieux génétiques, même lorsque les changements dans le nombre de BD sont modestes.
Ces dernières années, la visualisation de la structure 3D de l'arbre biliaire a été utilisée par plusieurs groupes pour analyser le développement BD22,23,24,25. Ces méthodes élégantes reposent sur le remplissage de l'arbre biliaire de la BD commune par l'encre ou la résine, et donc examiner la patency du système biliaire. En outre, ils fournissent des informations sur la structure 3D de l'arbre biliaire et sa formation dans la périphérie du foie à mesure que le foie se développe, qui ne peut pas être évalué par l'évaluation 2D utilisée dans des protocoles comme celui présenté ici. Cependant, la réussite de ces techniques de visualisation 3D nécessite une expertise considérable26. En revanche, la technique présentée ici est assez simple et peut être exécutée par n'importe quel groupe ayant accès à des équipements de routine pour l'analyse histologique et d'imagerie. En outre, l'analyse des sections double-tachées pour wsCK et SMA montrera également si des réactions ductulaires ou des anomalies vasculaires de cellules musculaires lisses existent dans le foie8,27,28. Nous suggérons que la quantification du rapport BD/PV dans l'ensemble des sections hépatiques peut fournir une mesure sensible et reproductible du développement biliaire chez la souris et peut servir de technique relativement facile pour aider les chercheurs à décider s'ils devraient envisager plus techniques sophistiquées comme la visualisation 3D de l'arbre biliaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien des National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 et R01 DK109982), un Prix pilote/faisabilité du Texas Medical Center Digestive Disease Center sous NIH P30 DK56338, et un Alagille Syndrome Accelerator Award de La Fondation Médicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
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