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Developmental Biology

माउस लिवर में पित्त Duct घनत्व का निर्धारण

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59587
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

Summary

हम माउस जिगर में पित्त नली घनत्व का सही परिमाणीकरण के लिए एक बल्कि सरल और संवेदनशील विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि आनुवंशिक और पर्यावरण संशोधक के प्रभाव और पित्त रोगों के माउस मॉडल में संभावित उपचार की प्रभावशीलता का निर्धारण करने में सहायता कर सकते हैं.

Abstract

माउस मोटे तौर पर पित्त रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है। पित्त प्रणाली के विकास और समारोह का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है, सीरम रसायन विज्ञान सहित, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, और विशिष्ट मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। हालांकि इन तकनीकों पित्त प्रणाली के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, वे अक्सर पूरे जिगर भर में पित्त नली (बीडी) विकास दोष की एक पूरी तस्वीर पेश नहीं करते. यह पित्त विकास में महत्वपूर्ण हानि के साथ जानवरों में भी पित्त नाली करने के लिए माउस जिगर की मजबूत क्षमता के कारण भाग में है। यहाँ हम उत्परिवर्ती/ट्रांसजेनिक चूहों के सभी खण्डों को कवर करने वाले वर्गों में प्रत्येक पोर्टल नस (पीवी) से संबद्ध बीडी की औसत संख्या की गणना करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि में, जिगर घुड़सवार और विभिन्न जीनोटाइप और प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच तुलना की सुविधा के लिए एक stereotypic तरीके से काट रहे हैं. बीडी साइटोकेराटिन-सना हुआ cholangiocytes के प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पहचाने जाते हैं, और फिर जिगर अनुभाग में मौजूद PVs की कुल संख्या से गिना और विभाजित किया जाता है। एक उदाहरण के रूप में, हम बताते हैं कि कैसे इस विधि स्पष्ट रूप से जंगली प्रकार चूहों और Alagille सिंड्रोम के एक माउस मॉडल के बीच भेद कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत विधि उन तकनीकों के लिए विकल्प नहीं दे सकती जो पित्ती वृक्ष की त्रि-आयामी संरचना को विज़ुअलाइज़ करती हैं। हालांकि, यह मात्रात्मक बीडी विकास और चूहों में डक्ट्युलर प्रतिक्रिया गठन की डिग्री का आकलन करने के लिए एक आसान और सीधा तरीका प्रदान करता है।

Introduction

पित्त का पेड़ स्तनधारी जिगर का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, पेट में hepatocytes से पित्त के पारित होने की अनुमति. इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं (बीडी) कोलंग्योसाइट्स द्वारा बनाई जाती हैं, जो नोच और टीजीएफ के माध्यम से द्वि-क्षमता हेपाटोब्लास्टों से अंतर करती हैं 1,2. उचित विनिर्देश और cholangiocytes और परिपक्व बीडी में उनकी विधानसभा की प्रतिबद्धता intrahepatic पित्ती पेड़ के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं. के रूप में जिगर के विकास के दौरान या अंग पुनर्जनन पर बढ़ता है, पित्त प्रणाली उचित पित्त जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए जिगर के साथ विकसित करने की जरूरत है. इसके अलावा, syndromic और गैर-syndromic रोगों की एक संख्या intrahepatic बीडीएस3की कमी में परिणाम. इसके अलावा, तीव्र और पुरानी जिगर की बीमारियों की एक संख्या जिगर में तथाकथित डक्युलर प्रतिक्रियाओं को जन्म देती है, जो कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या की उपस्थिति के रूप में परिभाषित की जाती है जो पित्त मार्करों को व्यक्त करती हैं लेकिन अनिवार्य रूप से पित्त कोशिकाओं या रूप से उत्पन्न नहीं होती हैं पेटेंट बीडी4| मल्टीसिस्टम डिसऑर्डर में ऐगिले सिंड्रोम (एएलजीएस ) में , नच लिगेंड 1 (JAG1) की क्षमता खराब बीडी गठन और कोलेस्टेसिस5,6में होती है . हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में दिखा दिया है कि एक पहले से उत्पन्न Jag1 heterozygous माउस लाइन7 ALGS8में बीडी कमी का एक पशु मॉडल है . ALGS के इस माउस मॉडल में, cholangiocytes अभी भी मौजूद हैं. हालांकि, वे परिपक्व, पेटेंट बीडी8में शामिल करने के लिए प्रतिबद्ध करने में विफल। इसलिए, बीडी कमी के एक मॉडल में जिगर के विश्लेषण स्पष्ट उपस्थिति या cholangiocytes की अनुपस्थिति से अधिक की आवश्यकता है. यह सही डिग्री जो परिपक्व बीडी जिगर में मौजूद हैं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

परमाणु विकृति में, यह आकलन करने के लिए मात्रात्मक तरीके स्वीकार किए जाते हैं कि बीडी की कमी9है या नहीं। उदाहरण के लिए, मानव रोगियों में एएलजीएस पर किए गए अध्ययन ों में अक्सर बीडी को यकृत बायोप्सी9,10 प्रति कम से कम 10 पोर्टल जहाजों का विश्लेषण करके पोर्टल नस (पीवी) अनुपातकीमात्रा निर्धारित की जाती है। आकार और समग्र उपस्थिति या पेटेंट बीडी की अनुपस्थिति का विश्लेषण, सीरम रसायन के साथ संयुक्त, चूहों में बीडी विकास के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं11,12,13. हालांकि, चूहों सीरम बिलीरूबिन स्तर8में केवल एक मामूली वृद्धि के साथ बीडीएस की एक महत्वपूर्ण संख्या खो सकते हैं। तदनुसार, एक मात्रात्मक विधि है कि पीवी प्रति मौजूद बीडी की संख्या का मूल्यांकन चूहों में बीडी कमी की डिग्री का एक अधिक प्रत्यक्ष उपाय प्रदान कर सकते हैं. हाल ही की एक रिपोर्ट में हमने सभी यकृत पालिमें प्रति बी डी की संख्या का आकलन किया और जग1+/- पशुओं8में बीडी से पीवी अनुपात में उल्लेखनीय कमी की सूचना दी। हमारे विश्लेषण के दौरान, हमने देखा कि भड़काऊ प्रतिक्रिया और नलिकाप्रतिक्रियाओं की डिग्री में महत्वपूर्ण भिन्नता के बावजूद, बीडी से पीवी अनुपात में अधिक परिवर्तनशीलता8नहीं दिखाई देती है। इसके अलावा, बीडी से पीवी अनुपात के परिमाणीकरण ने हमें यह प्रदर्शित करने की अनुमति दी कि जग1 में ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज जीन पोग्लू1 की एक प्रति को हटाने से उनकी बीडी कमी8में काफी सुधार हो सकता है। एक Jag1 + / + पृष्ठभूमि में, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में Poglut1 की सशर्त हानि बीडी संख्या में एक प्रगतिशील वृद्धि में परिणाम है, जो मामूली है (20-30%) P7 पर लेकिन वयस्कों में प्रमुख हो जाताहै 8. फिर, इस तकनीक हमें दिखाने के लिए कि P7 में भी, इन जानवरों में बीडी घनत्व में वृद्धि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है की अनुमति दी. ध्यान दें, उम्र के चार महीने में इस जीनोटाइप में वृद्धि हुई बीडी घनत्व राल डाली विश्लेषण के माध्यम से भी मान्य किया गया था. 8 इन टिप्पणियों और अन्य रिपोर्टों जो विभिन्न ALGS माउस मॉडल14में बीडी घनत्व मापा,15 हमें हमारे समग्र रणनीति में इस विधि को शामिल करने के लिए विभिन्न उत्परिवर्ती में पित्त दोष का विश्लेषण करने के लिए प्रेरित किया और ट्रांसजेनिक चूहों.

यहाँ, हम एक सरल तकनीक का विस्तार करते हैं जिसका उपयोग यकृत रोग के माउस मॉडलमें बीडी कमी की डिग्री की जांच करने के लिए किया जा सकता है (चित्र1)। इस विधि में, cholangiocyte मार्कर cytokeratin (सीके) 8 और CK19 (बाद में व्यापक स्पेक्ट्रम सीके, wsCK) के साथ सह-स्टेनिंग माउस जिगर में बीडी और unincorporated cholangiocytes कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अल्फा चिकनी मांसपेशी actin के खिलाफ एक एंटीबॉडी ($SMA) लेबल वाहिकाओं के लिए धुंधला करने के लिए जोड़ा जाता है. सभी जिगर lobes को कवर एक खंड में बीडी से पीवी अनुपात के व्यवस्थित विश्लेषण सुनिश्चित करता है कि PVs की एक बड़ी संख्या में प्रत्येक जीनोटाइप के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. चूंकि हमारी विधि 2 डी छवियों में बीडी और पीवी की मात्रा निर्धारित करने पर निर्भर करती है, यह पित्त ी के पेड़ की 3 डी संरचना या छोटे पित्त नाली की अखंडता पर दिए गए उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है। फिर भी, यह जांचकर्ताओं के लिए माउस में पित्त विकास का आकलन करने के लिए एक सरल और उद्देश्य रणनीति प्रदान करता है.

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Protocol

सभी जानवरों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार और अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के तहत Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन में एक बाधा पशु सुविधा में रखे गए थे.

1. माउस लिवर ऊतक का संग्रह

  1. जिगर की फसल के लिए माउस की तैयारी
    1. isoflurane का उपयोग कर माउस euthanize.
    2. मौत सुनिश्चित करने के लिए माउस की ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
    3. रिब पिंजरे के नीचे लगभग एक इंच एक अनुप्रस्थ चीरा बनाएं।
    4. जिगर के पूरे अधर सतह को उजागर.
  2. माउस जिगर का संग्रह
    1. ध्यान से, छोटे कैंची के साथ, पेट में अन्य अंगों के लिए जिगर को जोड़ने स्नायुबंधन के माध्यम से काट दिया।
    2. आंत से जिगर को अलग करने के लिए आम बीडी के माध्यम से कट।
    3. ध्यान से पित्ताशय की थैली पर पकड़ कर जिगर को दूर करने और तुरंत 4% paraformaldehyde (पीएफए) द्वारा तीन चौथाई से भरा एक 50 एमएल ट्यूब में जगह है।

2. पराफिन में लिवर को ठीक करना और एम्बेड करना

  1. निर्धारण
    1. 4% पीएफए में 48 एच के लिए जिगर के ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 70% EtOH के साथ ऊतक धो लो।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच प्रत्येक के लिए 95% EtOH के साथ दो बार ऊतक धो।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच प्रत्येक के लिए 100% EtOH के साथ दो बार ऊतक धो।
  2. समाशोधन
    1. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 30 मिनट के लिए तीन बार समाशोधन एजेंट (सामग्री की तालिका) के साथ जिगर के ऊतकों को धो लें।
      नोट: जिगर तीसरे धोने के बाद कठोर महसूस करना चाहिए.
  3. पैराफिन में एम्बेड करना
    1. 3 washes, 30 मिनट प्रत्येक के लिए पैराफिन मोम में एक ऊतक मोल्ड में ऊतक कैसेट प्लेस. वैक्स को 60 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम किया जाना चाहिए।
    2. तीन चौथाई ऊंचाई के लिए पैराफिन मोम के साथ ऊतक मोल्ड भरें और 60 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर रहते हैं।
    3. अधर पक्ष का सामना करना पड़ के साथ मोल्ड में जिगर प्लेस.
    4. ध्यान से हीटिंग ब्लॉक से मोल्ड हटा दें।
    5. मोल्ड पर कैसेट के शीर्ष प्लेस और गर्म तरल पैराफिन के साथ बंद शीर्ष.
    6. मोल्ड और ब्लॉक रात भर कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
      नोट: ऊतक ब्लॉक अब कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. अनुभागिंग जिगर ऊतक

  1. अनुभागीकरण के लिए ब्लॉक की तैयारी
    1. मोल्ड से ब्लॉक को हटाने से पहले 5 मिनट के लिए बर्फ पर मोल्ड रखें।
    2. ब्लॉक और बर्फ के बीच मौजूद एक प्रयोगशाला ऊतक कागज के साथ बर्फ पर ब्लॉक प्लेस.
    3. बर्फ पर ब्लॉक रखें जब सबसे अच्छा ऊतक टुकड़ा करने के परिणाम के लिए अनुभाग नहीं.
  2. जिगर ब्लॉक अनुभाग
    1. एक microtome का उपयोग करना, जिगर के सतही, पृष्ठीय पक्ष के माध्यम से sectioning द्वारा शुरू करते हैं. अनुभाग 5 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए।
    2. वर्गों काटना या तह नहीं कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सतही वर्गों की जाँच करें।
    3. जिगर का एक वर्ग है कि caudate पालि भी शामिल है ले लो.
      नोट: कुछ ब्लॉकों के लिए, आप एक ही ऊतक टुकड़ा पर छोड़ दिया, मध्यस्थ, सही और caudate lobes होगा.
    4. उन ब्लॉकों के लिए जहां सभी चार lobes एक ही स्लाइड पर मौजूद नहीं हैं, जब तक छोड़ दिया, मध्यस्थ और सही lobes एक ही स्लाइड पर मौजूद हैं टुकड़ा करने के लिए जारी है.

4. wsCK और $SMA के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए स्लाइड्स का प्रसंस्करण
    1. विश्लेषण किया जा करने के लिए जीनोटाइप प्रति एक स्लाइड का चयन करें।
    2. Xylene में 15 मिनट के लिए स्लाइड धो, 100% EtOH, 95% EtOH और अंत में 70% EtOH (3 x 5 प्रत्येक समाधान में मिनट).
    3. deionized एच2हे में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें।
    4. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान (ट्रिस-आधारित, उच्च पीएच) में स्लाइड विसर्जित करें।
    5. 10 साई पर 3 मिनट के लिए एक दबाव कुकर में दबाव के तहत गर्मी.
    6. कमरे के तापमान (लगभग 35 मिनट) को ठंडा करने के लिए स्लाइड की अनुमति दें।
  2. ऊतक वर्गों को अवरोधित करना
    1. पैप पेन का उपयोग करके, स्लाइड पर अनुभागों को बाह्यरेखांकित करें.
    2. दो बार, 5 मिनट प्रत्येक अनुभाग को कवर करने के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) + 0.1% ट्वीन लागू करें।
    3. पीबीएस + 0.3% Triton में 1:50 पर सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) मिश्रण द्वारा अवरुद्ध बफर बनाओ. ब्लॉकिंग और प्राथमिक एंटीबॉडी अनुप्रयोग दोनों के लिए पर्याप्त बफ़र करने के लिए, 100 $L प्रति अनुभाग पर्याप्त है।
    4. प्रति अनुभाग समाधान को अवरुद्ध करने के 100 $L लागू करें.
    5. 1 h के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान के साथ कवर स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  3. wsCK और $SMA के लिए दाग
    1. विरोधी CK8 और विरोधी CK19 एंटीबॉडी16 (विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, TROMA-I और TROMA-III, क्रमशः) 1:20 wsCK के लिए दाग के लिए बफर अवरुद्ध में. एक ही बफर में प्रति-स्मा एंटीबॉडी17 (सामग्रीका सारणी) को 1:200 तक निरूपित करें।
    2. पतला एंटीबॉडी समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस लागू करें जिसमें प्रत्येक अनुभाग के लिए सभी तीन एंटीबॉडी होते हैं।
    3. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी समाधान के साथ कवर स्लाइड इनक्यूबेट करें।
    4. पीबीएस + 0.1% Triton तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक के साथ स्लाइड धो लें.
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी (एंटी-रैट-एलेक्सा488 और एंटी-माउस-Cy5) पीबीएस में 1:200 + 0.3% ट्राइटन।
    6. स्लाइड करने के लिए दोनों माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस लागू करें।
    7. 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  4. DAPI परमाणु धुंधला और बढ़ते
    1. स्लाइड्स को तीन बार, 5 मिनट तक धोएं।
    2. 10 मिनट के लिए प्रत्येक अनुभाग के लिए DAPI (1:3000) के 100 $L लागू करें।
    3. एंटीफैड माउंटिंग मीडियम (सामग्री की तालिका) को स्लाइड्स पर लगाएं और ऊतक वर्गों के शीर्ष पर एक ग्लास कवरस्लिप रखें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स छोड़ दें। अगले दिन स्लाइड सील करें।
    4. बढ़ते के 1 सप्ताह के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस और छवि पर स्लाइड स्टोर.

5. बीडी की इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन

  1. इमेजिंग जिगर वर्गों
    1. इमेजिंग से पहले, अपने आप को एक प्रयोगशाला सदस्य से मदद के साथ नमूने के जीनोटाइप के लिए अंधा. सुनिश्चित करें कि सभी इमेजिंग फ़ाइलें जीनोटाइप या अन्य विशिष्ट पहचान की जानकारी से रहित हैं एक पशु /
    2. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, प्रत्येक अनुभाग के 1x ज़ूम पर 20x छवियों को लेने के लिए और सुनिश्चित करें कि जिगर भर में हर पीवी छवि है. बाएँ, मध्यस्थ, दाएँ और पुच्छे वाले खण्डों को शामिल करें.
      नोट: हम आम तौर पर जिगर के आकार के आधार पर प्रति जानवर 60-90 पोर्टल ट्रैक्ट पाते हैं।
    3. PVs की पहचान करने के लिए, $SMA प्लस wsCK धुंधला के लिए देखें। संरचनाएं जो $SMA सकारात्मक हैं लेकिन wsCK धुंधला कमी हैं पोर्टल संरचनाएँ नहीं हैं।
  2. पहचान और बीडी की गिनती
    1. निम्न स्तंभों के साथ एक स्प्रेडशीट बनाएँ: Animal/Sample संख्या, छवि संख्या, PVs की संख्या, और BDs की संख्या.
    2. प्रत्येक छवि के माध्यम से जा रहे हैं, की पहचान करने और प्रति छवि PVs की संख्या रिकॉर्ड.
    3. एक definable लुमेन आसपास cholangiocytes (wsCK +) की उपस्थिति से प्रत्येक छवि में पेटेंट बीडी की पहचान. संरचनाएं अलग और अन्य wsCK + कोशिकाओं से mesenchyme द्वारा अलग किया जाना चाहिए.
    4. प्रत्येक पेटेंट बीडी और छवि संख्या के रूप में एक ही स्तंभ में जगह की गणना.
    5. एक पीवी के लिया प्रत्येक छवि के लिए यह मत करो.
    6. जिगर के नमूने में सभी PVs और सभी बीडी के योग की गणना.
    7. जिगर के नमूने के लिए बीडी से PV अनुपात की गणना करें।

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Representative Results

हम पहले Jag1 + / जानवरों, ALGS8के एक माउस मॉडल में पित्त दोष प्रलेखित. बीडी को पीवी अनुपात निर्धारित करने के लिए, हम P30 माउस जिगर अनुभाग और सह उन्हें CK8 और CK19 (wsCK) के लिए संवहनी मार्कर के साथ दाग $SMA. हम तो जिगर lobes में से प्रत्येक में सभी PVs छवि. जैसा कि चित्र 2कमें दिखाया गया है , हमने PVs को $SMA-stained जहाजों के रूप में परिभाषित किया है जिनमें सन्निकट wsCK धुंधला (एरोहेड्स) होता है। wsCK के बिना SMA दाग संरचनाओं केंद्रीय नसों थे और विश्लेषण (तीर) में शामिल नहीं किया जाना चाहिए.

एक बार PVs की पहचान की गई, हम उनके विशिष्ट आकार से पेटेंट बीडी की पहचान की. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है , पेटेंट नलिकाओं में स्पष्ट रूप से परिभाषित लुमेन है जो wsCK+ cholangiocytes से घिरा हुआ है। नलिकाएं आमतौर पर पास की नलिकाओं या cholangiocytes से mesenchyme (एरोहेड) द्वारा अलग कर रहे हैं. wsCK + कोशिकाओं है कि एक definable लुमेन नहीं है, आसन्न कोशिकाओं से जुड़े हुए हैं, या अलगाव में दिखाई देते हैं, बीडी (तीर) की कुल संख्या की ओर गिना नहीं कर रहे हैं. चित्रा 3A एक पीवी जो कई unincorporated कोशिकाओं के साथ एक पूरी तरह से पेटेंट नली के साथ जुड़ा हुआ है के साथ एक जंगली प्रकार जिगर अनुभाग से पता चलता है. चित्र 3B एक P30 Jag1 + /- जानवर से एक प्रतिनिधि जिगर अनुभाग है. कोई पेटेंट बीडी इस खंड में तीन PVs के आसपास मौजूद हैं. सभी wsCK + कोशिकाओं unincorporated रहे हैं और इसलिए नहीं गिना जाना चाहिए. इस छवि सावधान बीडी गिनती के महत्व पर प्रकाश डाला गया, के रूप में उपस्थिति या wsCK + कोशिकाओं की अनुपस्थिति Jag1 + /

जैसा कि चित्र 1Dमें प्रदर्शित किया गया है , बीडी से पीवी अनुपात के विश्लेषण में यकृत अनुभाग में प्रत्येक पीवी के आसपास मौजूद पेटेंट बीडी की कुल संख्या के साथ प्रत्येक पीवी की गणना शामिल है। जग1+/- यकृतों का विश्लेषण करते समय हमने देखा कि इन जंतुओं (अप्रकाशित आंकड़ों) में विभिन्न खण्डों पर एक ही सीमा तक प्रभाव नहीं पड़ता है। इसलिए, हम आम तौर पर पूर्ण जिगर कवरेज सुनिश्चित करने के लिए छोड़ दिया, मध्यस्थ, सही और caudate lobes भर में PVs गिनती. कुल PVs और BDs के सारणीयन के बाद, अनुपात पूरे अनुभाग के लिए गणना की जाती है।

चित्र 4 मेंहमने बीडी से पीवी अनुपात ों का विश्लेषण 3 जंगली प्रकार तथा 3 जग1+/- जंतुओं के लिए दिखाया। इस ग्राफ से पता चलता है कि कैसे दो genotypes आसानी से बीडी गिनती के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस विधि आनुवंशिक जोड़तोड़ द्वारा Jag1 + + / - phenotype के बचाव की डिग्री के विश्लेषण के लिए एक मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है, जैसा कि पहले की सूचना दी8.

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का Schematic. (ए) जिगर माउस से पूरी काटा जाता है. (बी) लिवर के नमूने 48 ज के लिए तय किए जाते हैं, निर्जलित और मंजूरी दे दी जाती है। (सी) यकृत ऊतक पैराफिन में एम्बेडेड है। धाराओं बना रहे हैं और आरोप लगाया स्लाइड पर रखा और wsCK और $SMA के लिए दाग. (डी) स्लाइड छवि रहे हैं, और PVs और बीडी की संख्या दर्ज कर रहे हैं. बीडी से पीवी अनुपात (BD:PV) पूरे जिगर अनुभाग के लिए गणना की है. हा ] यकृत धमनी; सीवी - केंद्रीय नस. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: से केंद्रीय नसों भेद पी.वी.एस. (ए) पीवी की पहचान एसएमए के दाग और आसपास के wsCK+ cholangiocytes (एरोहेड्स) की उपस्थिति से की जाती है। (ख) केंद्रीय शिराओं की पहचान संरचना (तीर) के चारों ओर मौजूद कोई wsCK+ cholangiocytes के साथ SMA धुंधला की उपस्थिति से की जाती है। (ए' और बी ') ग्रेस्केल छवियाँ क्रमशः A और B से $SMA चैनल दिखा रही हैं. स्केल बार - 100 डिग्री मी और सभी पैनलों पर लागू होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पेटेंट बीडी की पहचान. (ए-ए')  P30 जंगली प्रकार जिगर में, हम एक पेटेंट बीडी (एरोहेड) के रूप में wsCK + cholangiocytes से घिरा हुआ एक समझदार लुमेन के साथ दीर्घवृत्तसंरचनाओं के लिए दौर गिनती। Cholangiocytes जो एक लुमेन आसपास नहीं कर रहे हैं unincorporated माना जाता है और (तीर) गिना नहीं कर रहे हैं. (बी-बी') जग1+/- यकृत में, कोलैंगियोसाइट्स अभी भी (तीर) मौजूद हैं। हालांकि, अधिकांश को पेटेंट बीडी में शामिल नहीं किया जाता है। स्केल बार $ 100 $m और सभी पैनलों पर लागू होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: बीडी P30 माउस जिगर से पीवी ग्राफ के लिए. बीडी और पीवी की मात्रा निर्धारित की जाती है और बीडी से पीवी अनुपात उत्पन्न होता है। जैसा कि पहले बताया गया है8, Jag1+/- जानवरों जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना में बीडी से पीवी अनुपात में एक विशेषता और महत्वपूर्ण कमी है। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, दो तरह से टीपरीक्षण किया गया था. क्षैतिज रेखाएँ दिखाने का अर्थ है। पीएंड एल टी;0.001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

चूहों में बीडी विकास और मरम्मत का विश्लेषण रोगजनन और cholestatic विकारों के तंत्र का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इसके अलावा, नए उपचारों का विकास एक पुन: उत्पादनीय और अधिमानतः परिमाणात्मक फीनोटाइप की स्थापना पर निर्भर भाग में है। माउस मॉडल में वर्तमान phenotyping आमतौर पर सीरम रसायन विज्ञान, जिगर ऊतक विज्ञान और सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग शामिल है. हालांकि इन तकनीकों की संरचना और पित्त प्रणाली के समारोह के बारे में बहुमूल्य जानकारी उत्पन्न करते हैं, वे बीडी की संख्या पर एक दिया आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का एक सीधा उपाय प्रदान नहीं करते. परमाणु विकृति में, मानव रोगियों में बीडी कमी एक बायोप्सी खंड9में बीडी से पीवी अनुपात के विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। जबकि चिकित्सकों ALGS और अन्य cholestatic रोगों में cholestasis और जिगर की बीमारी की गंभीरता का निर्धारण करने के लिए सीरम रसायन विज्ञान विश्लेषण को रोजगार18,19, माउस मॉडल में हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन दोनों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है बीडी विकास और सामान्य डक्ट विकास बहाल करने पर चिकित्सा की प्रभावशीलता पर रोग संशोधक के प्रभाव. यह भाग में है क्योंकि चूहों पेटेंट बीडी की संख्या में एक गंभीर कमी हो सकती है, लेकिन अभी भी सीरम बिलीरूबिन स्तर8में केवल एक मामूली वृद्धि दिखाने के लिए , माउस जिगर में अत्यधिक कुशल पित्त जल निकासी के कारण होने की संभावना. हमारे पिछले काम से पता चला है कि जग1 विषमयुग्मजता के परिणामस्वरूप बीडी परिपक्वता बाधित होती है लेकिन कोलैंग्सियोयट8का अभाव नहीं होता है . इस प्रकार, बीडी विकास का विश्लेषण करने और माउस मॉडल में रोग की गंभीरता का आकलन करने के लिए, यह केवल अनुपस्थिति या cholangiocytes की उपस्थिति की जांच करने के लिए पर्याप्त नहीं है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, यहाँ हम माउस जिगर में पेटेंट बीडी संख्या के उद्देश्य माप के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत किया है.

हमारे विश्लेषण उचित निर्धारण और माउस जिगर के embedding पर निर्भर है. लिवर एक नमूना से दूसरे करने के लिए इसी तरह अनुभागिंग सुनिश्चित करने के लिए अधर पक्ष एम्बेडेड हैं। यह सबसे अधिक स्थिर स्थिति है। धुंधला के लिए इस्तेमाल किया वर्गों जिगर lobes में काफी गहरी होना चाहिए, के रूप में वहाँ बीडी की संख्या और जिगर की हिलम बनाम परिधि में PVs के आकार में मतभेद हैं. हम कभी-कभी पीवी देखते हैं जो लंबे समय तक काट दिए जाते हैं। उन मामलों में, वहाँ आम तौर पर एक पड़ोसी बीडी कि भी longitudinally कटौती की है और एक लंबी खुली ट्यूब की तरह प्रकट होता है. पुन: उत्पादन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, हम इन लंबी ट्यूबों को एकल बीडी के रूप में गिनते हैं। पेटेंट बीडी की पहचान अधिकांश भाग के लिए स्पष्ट है। तथापि, कुछ पित्ती संरचनाएं लुमेनीकृत दिखाई देती हैं लेकिन दीर्घवृत्ताभ आकारिकी के दौर को सामान्य बीडीएस14में नहीं दिखाती हैं। हमारे हाथों में, यह कभी कभी एक संरचना में परिणाम कर सकते हैं एक अन्वेषक द्वारा एक बीडी कहा जा रहा है, लेकिन नहीं एक और सहयोगी द्वारा. इसलिए, डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति में संगतता और पुन: उत्पादनीयता सुनिश्चित करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि किसी विशिष्ट प्रोजेक्ट से संबंधित सभी नमूनों का स्वतंत्र रूप से दो जांचकर्ताओं द्वारा विश्लेषण किया जाए.

विरोधी CK8 अपरिपक्व और परिपक्व पित्त कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि विरोधी CK19 केवल परिपक्व पित्त कोशिकाओं के निशान12,20. इसलिए, भले ही एक पीवी एक परिपक्व बीडी के साथ संबद्ध नहीं है, यह आसानी से सीके 8 + कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से केंद्रीय नसों से अलग किया जा सकता है। एंटी-एसएमए के साथ संयोजन में इन दो एंटीबॉडी का उपयोग हमारे परिमाणीकरण में पोर्टल ट्रैक्ट की पूरी कवरेज सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, हमारे हाथों में, व्यक्तिगत CK19 या द्विज कोशिकाओं के CK8 धुंधला एक अपेक्षाकृत कमजोर संकेत उत्पन्न करता है और कुछ पृष्ठभूमि धुंधला के साथ जुड़ा हुआ है. दो सी के एंटीबॉडी को मिलाकर पित्त कोशिकाओं में लगातार मजबूत संकेत मिलता है और इसलिए परिमाणीकरण की सुविधा प्रदान करताहै .

अंत:प्रशांत पित्ती वृक्ष की परिपक्वता एक हिलर-टू-पेरिफेरल दिशा में होती है और प्रसव के बादभी जारीरहती है। वास्तव में, वहाँ जल्दी प्रसवोत्तर जिगर में कई और अधिक अपरिपक्व cholangiocytes हैं, विशेष रूप से परिधीय क्षेत्रों में, जो प्रसव के बाद जिगर के विस्तार के प्रमुख मोर्चे पर हैं. इसके अलावा, हम बीडी संख्या मेंपरिवर्तन देखा के रूप में जानवरों की उम्र 8, बड़े जानवरों में अधिक नलिकाओं के साथ. इसके अलावा, कुछ पोर्टल संरचनाओं में कई बीडी होते हैं, जबकि अन्य में एक या कोई नलिकाएं होती हैं, विशेष रूप से यकृत परिधि के साथ। हम प्रत्येक जानवर के लिए सभी यकृत पालि को कवर करने वाली माइक्रोस्कोपी स्लाइड का उपयोग करते हैं और पूरी स्लाइड में बीडी को पीवी अनुपात में व्यवस्थित रूप से मात्रा निर्धारित करते हैं। हालांकि यह आवश्यक नहीं है, यह सुनिश्चित करता है कि पर्याप्त पोर्टल ट्रैक्ट प्रत्येक जानवर के लिए विश्लेषण कर रहे हैं उम्र और जिगर के आकार की परवाह किए बिना (60-90 PVs जिगर प्रति जीनोटाइप और उम्र के आधार पर). इसके अलावा, स्लाइड पर सभी PVs का विश्लेषण करके, हम यह सुनिश्चित करते हैं कि यकृत विकास के सभी चरणों में अधिक परिपक्व हिलर और कम परिपक्व परिधीय क्षेत्रों की गणना की जाती है। प्रत्येक जानवर के लिए सभी जिगर lobes को कवर भी माप में परिवर्तनशीलता कम कर सकते हैं अगर एक दिया उत्परिवर्तन बीडी विकास समान रूप से जिगर भर में प्रभावित नहीं करता है.

विधि unincorporated पित्त कोशिकाओं के समूहों से छोटे पित्त नाली भेद करने में सीमित है. पित्त नलिका4 आमतौर पर आवर्धन है कि हम इन sstainings का विश्लेषण करने के लिए उपयोग में एक lumenized संरचना के रूप में मान्यता प्राप्त करने के लिए बहुत छोटे हैं. इसलिए, वे हमारे परिमाणीकरण से बाहर रखा जा करने की संभावना है, और इस प्रकार विधि बड़ी नलिकाओं के लिए मध्यम की पहचान करने की दिशा में विषम है. इस सीमा के बावजूद, यहाँ वर्णित विधि आसानी से Jag1 + /- और Jag1 + / इसके अलावा, यह काफी संवेदनशील है Polgut1 + / की एक प्रति के एक साथ नुकसान पर Jag1 + / बीडी कमी के आंशिक बचाव का पता लगाने के लिए और Jag1 में बीडी घनत्व में मामूली वृद्धि + / संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में8. इन टिप्पणियों विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में बीडी घनत्व में परिवर्तन का निर्धारण करने में इस विधि की उपयोगिता से संकेत मिलता है, यहां तक कि जब बीडी संख्या में परिवर्तन मामूली हैं.

हाल के वर्षों में , पित्ती वृक्ष की 3 डी संरचना के दृश्य का उपयोग कई समूहों द्वारा बीडी विकास22,23,24,25का विश्लेषण करने के लिए किया गया है . इन सुरुचिपूर्ण तरीकों स्याही या राल द्वारा आम बीडी से पित्त के पेड़ को भरने पर भरोसा करते हैं, और इसलिए पित्त प्रणाली की कमी की जांच। इसके अलावा, वे पित्त के पेड़ की 3 डी संरचना और जिगर की परिधि में इसके गठन के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं क्योंकि यकृत बढ़ता है, जिसे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए 2डी मूल्यांकन द्वारा मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है जैसे कि यहां प्रस्तुत किया गया। हालांकि, इन 3 डी दृश्य तकनीकों के सफल प्रदर्शन के लिए पर्याप्त विशेषज्ञता26की आवश्यकता है। इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तुत तकनीक बल्कि सीधा है और हिस्टोलॉजिकल और इमेजिंग विश्लेषण के लिए नियमित उपकरणों के उपयोग के साथ किसी भी समूह द्वारा निष्पादित किया जा सकता है. इसके अलावा, डब्ल्यूएसके और जेडएसएएमए के लिए डबल दाग वाले खंडों का विश्लेषण यह भी दिखाएगा कि यकृत8,27,28में नलिकाकार अभिक्रियाओं अथवा संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका असामान्यताएं मौजूद हैं या नहीं । हमारा सुझाव है कि पूरे जिगर वर्गों में पीवी अनुपात के लिए बीडी मात्रा बद्ध चूहों में पित्त विकास के एक संवेदनशील और reproduible उपाय प्रदान कर सकते हैं और जांचकर्ताओं कि वे और अधिक विचार करना चाहिए तय करने में मदद करने के लिए एक अपेक्षाकृत आसान तकनीक के रूप में सेवा कर सकते हैं पित्त ी के पेड़ के 3 डी दृश्य की तरह परिष्कृत तकनीक.

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखक ों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (R01 GM084135 और R01 DK109982), NIH P30 DK56338 के तहत टेक्सास मेडिकल सेंटर पाचन रोग केंद्र से एक पायलट / मेडिकल फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50 mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22 x 50 mm2 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 146 जिगर विकास पित्त नली साइटोकेराटिन पायदान संकेतन Alagille सिंड्रोम Jag1
माउस लिवर में पित्त Duct घनत्व का निर्धारण
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Adams, J. M., Jafar-Nejad, H.… More

Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

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