Summary
Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l'efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.
Abstract
Il topo è ampiamente usato come organismo modello per studiare le malattie biliari. Per valutare lo sviluppo e la funzione del sistema biliare, vengono utilizzate varie tecniche, tra cui la chimica del siero, l'analisi istologica e l'immunostaining per marcatori specifici. Anche se queste tecniche possono fornire importanti informazioni sul sistema biliare, spesso non presentano un quadro completo dei difetti dello sviluppo del dotto biliare (BD) in tutto il fegato. Ciò è in parte dovuto alla robusta capacità del fegato di topo di drenare la bile anche negli animali con compromissione significativa nello sviluppo biliare. Qui presentiamo un metodo semplice per calcolare il numero medio di BD associati a ogni vena del portale (PV) in sezioni che coprono tutti i lobi di topi mutanti/transgenici. In questo metodo, i fegati sono montati e sezionato in modo stereotipato per facilitare il confronto tra vari genotipi e condizioni sperimentali. I BD sono identificati tramite microscopia leggera dei cholangiociti macchiati di citokeratina, e quindi contati e divisi per il numero totale di FOTO presenti nella sezione epatica. Ad esempio, mostriamo come questo metodo possa distinguere chiaramente tra topi selvatici e un modello murino della sindrome di Alagille. Il metodo qui presentato non può sostituire le tecniche che visualizzano la struttura tridimensionale dell'albero biliare. Tuttavia, offre un modo semplice e diretto per valutare quantitativamente lo sviluppo della BD e il grado di formazione della reazione dudulare nei topi.
Introduction
L'albero biliare è una parte critica del fegato dei mammiferi, permettendo il passaggio della bile dagli epatociti nell'intestino. I dotti biliari intraepatici (BD) sono formati da cholangiociti, che si differenziano dagli epatoblasti bipotenziali attraverso la segnalazione di Notch e TGF Una corretta specificazione e impegno dei cholangiocyti e del loro assemblaggio in BD maturi sono fondamentali per lo sviluppo dell'albero biliare intraepatico. Come il fegato cresce durante lo sviluppo o sulla rigenerazione dell'organo, il sistema biliare ha bisogno di sviluppare lungo il fegato per garantire il corretto drenaggio della bile. Inoltre, un certo numero di malattie sindromiche e non sindromiche si traducono nella scarsità di BD intraepatici3 . Inoltre, una serie di malattie acute e croniche del fegato danno origine alle cosiddette reazioni dudulle nel fegato, che sono definite come la presenza di un numero significativo di cellule che esprimono marcatori biliari ma non derivano necessariamente da cellule biliari o forme brevetto BD4. Nel disturbo multisistema la sindrome di Alagille (ALGS), aploinsufficienza del ligando di Notch(JAG1) provoca scarsa formazione di BD e colestasi5,6. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che una lineadi mouse Jag1 eterozygous generata in precedenza è un modello animale di paucedia BD in ALGS8. In questo modello di topo di ALGS, i cholangiocytes sono ancora presenti. Tuttavia, non riescono a impegnarsi nell'incorporazione in maturi, brevetti BD8. Pertanto, l'analisi del fegato in un modello di paucity BD richiede più della presenza apparente o assenza di colgaliociti. È importante valutare con precisione il grado di presenza di BD maturi nel fegato.
Nella patologia anatomica, ci sono metodi quantitativi accettati per valutare se la paucity BD esiste9. Ad esempio, gli studi su ALGS su pazienti umani spesso quantificano il rapporto BD-vina porta (PV) analizzando almeno 10 vasi portali per biopsia epatica9,10. L'analisi della forma e la presenza complessiva o l'assenza di BD brevettati, combinati con la chimica del siero, possono fornire preziose informazioni sullo sviluppo di BD nei topi11,12,13. Tuttavia, i topi possono perdere un numero significativo di BD con solo un modesto aumento del livello biliarina del siero8. Di conseguenza, un metodo quantitativo che valuta il numero di BD presenti per fotovoltaico può fornire una misura più diretta del grado di scarsità di BD nei topi. In un recente rapporto, abbiamo quantificato il numero di BD per FOTO in tutti i lobi epatici e segnalato una significativa diminuzione del rapporto BD-PV in Jag1/– animali8. Nel corso della nostra analisi, abbiamo notato che, nonostante la variazione significativa nel grado di risposta infiammatoria e reazioni dudulare, il rapporto BD-PV non mostra molta variabilità8. Inoltre, la quantificazione del rapporto BD-PV ci ha permesso di dimostrare che la rimozione di una copia del gene glicosiltransferasi Poglut1 in Jag1- / gli animali possono migliorare significativamente la loro scarsità di BD8. In uno sfondo di Jag1/ , la perdita condizionale di Poglut1 nelle cellule muscolari limpiche vascolari si traduce in un aumento progressivo del numero di BD, che è modesto (20-30%) a P7 ma diventa prominente negli adulti8. Anche in questo caso, questa tecnica ci ha permesso di dimostrare che anche a P7, l'aumento della densità di BD in questi animali è statisticamente significativo. Da notare che l'aumento della densità di BD in questo genotipo a quattro mesi di età è stato convalidato anche attraverso l'analisi del getto di resina. 8 Queste osservazioni e altre relazioni che misuravano la densità di BD in diversi modelli murini ALGS14,15 ci hanno spinto a incorporare questo metodo nella nostra strategia complessiva per analizzare i difetti biliari in vari modelli mutanti e topi transgenici.
In questo caso, viene descritta in dettaglio una tecnica semplice che può essere utilizzata per esaminare il grado di scarsità di BD nei modelli murini di malattia epatica (Figura 1). In questo metodo, la co-colorazione con marcatori di colosso ciclica (CK) 8 e CK19 (in seguito ad ampio spettro CK, wsCK) viene utilizzata per visualizzare BD e cholangiocyte non incorporati nel fegato del topo. Un anticorpo contro l'actina muscolare alfa-liscio (SMA) viene aggiunto alla colorazione per etichettare i vasi. L'analisi sistematica del rapporto BD-PV in una sezione che copre tutti i lobi epatici assicura che un gran numero di fotocamere venga analizzato per ogni genotipo. Poiché il nostro metodo si basa sulla quantificazione di BD e PV in immagini 2D, non è adatto per studiare gli effetti di una determinata mutazione sulla struttura 3D dell'albero biliare o sull'integrità dei piccoli condotti biliari. Tuttavia, fornisce una strategia semplice e oggettiva per gli investigatori per valutare lo sviluppo biliare nel mouse.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati alloggiati in una struttura per animali barriera presso il Baylor College of Medicine per le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e con protocolli animali approvati.
1. Collezione di tessuto epatico del topo
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Preparazione del topo per la raccolta del fegato
- Eutanasia il topo usando l'isoflurane.
- Eseguire lussazione cervicale del topo per garantire la morte.
- Fare un'incisione trasversale circa un pollice sotto la gabbia toracica.
- Esporre l'intera superficie ventrale del fegato.
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Raccolta del fegato di topo
- Con attenzione, con piccole forbici, tagliare i legamenti che collegano il fegato ad altri organi nell'addome.
- Tagliare il BD comune per staccare il fegato dall'intestino.
- Rimuovere con attenzione il fegato tenendo la cistifellea e immediatamente mettere in un tubo da 50 mL riempito a tre quarti dal 4% di paraformaldeide (PFA).
2. Fissare e incorporare il fegato in Paraffina
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fissazione f
- Fissare il tessuto epatico per 48 h in 4% PFA a 4 gradi centigradi.
- Lavare il tessuto con il 70% di EtOH per 1 h a 4 gradi centigradi.
- Lavare il tessuto due volte con il 95% EtOH per 1 h ciascuno a 4 gradi centigradi.
- Lavare il tessuto due volte con 100% EtOH per 1 h ciascuno a 4 gradi centigradi.
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libero
- Lavare il tessuto epatico con l'agente di compensazione (Tabella dei materiali) tre volte per 30 min ciascuno a temperatura ambiente.
NOT: Il fegato dovrebbe sentirsi rigido dopo il terzo lavaggio.
- Lavare il tessuto epatico con l'agente di compensazione (Tabella dei materiali) tre volte per 30 min ciascuno a temperatura ambiente.
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Incorporamento in paraffina
- Mettere la cassetta dei tessuti in uno stampo di tessuto in cera di paraffina per 3 lavamenti, 30 min ciascuno. La cera deve essere preriscaldata a 60 gradi centigradi.
- Riempire lo stampo di tessuto con cera di paraffina fino a tre quarti di altezza e tenere su un blocco di riscaldamento a 60 gradi centigradi.
- Posizionare il fegato nello stampo con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
- Rimuovere con attenzione lo stampo dal blocco di riscaldamento.
- Posizionare la parte superiore della cassetta sullo stampo e ricaricare con paraffina liquida calda.
- Lasciare raffreddare lo stampo e il blocco a temperatura ambiente durante la notte.
NOT: I blocchi di tessuto possono ora essere conservati a temperatura ambiente.
3. Sezionamento del tessuto epatico
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Preparazione del blocco per il sezionamento
- Posizionare lo stampo sul ghiaccio per 5 min prima di rimuovere il blocco dallo stampo.
- Posizionare il blocco sul ghiaccio con una carta velina di laboratorio presente tra blocco e ghiaccio.
- Mantenere il blocco sul ghiaccio quando non sezionare per i migliori risultati di affettatura dei tessuti.
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Sezionamento dei blocchi di fegato
- Utilizzando un microtoma, iniziare sezionando attraverso il lato superficiale, dorsale del fegato. Le sezioni devono essere di 5 m.
- Controllare le sezioni superficiali al microscopio di dissezione per assicurarsi che le sezioni non siano tostate o piegate.
- Prendete una sezione del fegato che include il lobo caudato.
NOT: Per alcuni blocchi, avrai i lobi sinistro, mediale, destro e caudato sulla stessa fetta di tessuto. - Per quei blocchi in cui tutti e quattro i lobi non sono presenti sulla stessa diapositiva, continuare a tagliare fino a quando il sinistro, i lobi mediali e destro sono presenti sulla stessa diapositiva.
4. Immunoistochimica per wsCK e SMA
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Elaborazione di vetrini per immunoistochimica
- Selezionare una diapositiva per genotipo da analizzare.
- Lavare il vetrino per 15 min a Xylene, 100% EtOH, 95% EtOH e infine 70% EtOH (3 x 5 min in ogni soluzione).
- Lavare il vetrino per 5 min in deionizzato H2O.
- Immergere il vetrino nella soluzione di recupero dell'antigene (tris-based, high pH).
- Calore sotto pressione in una pentola a pressione per 3 minuti a 10 psi.
- Lasciare raffreddare il vetrino a temperatura ambiente (circa 35 min).
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Blocco delle sezioni tissutali
- Utilizzando una Pap Pen, delineare le sezioni sulla diapositiva.
- Applicare la salina tamponata da fosfati (PBS) - 0,1% Tween per coprire la sezione due volte, 5 min ciascuno.
- Fare il buffer di blocco mescolando normal Goat Serum (NGS) a 1:50 in PBS - 0.3% Triton. Per avere un buffer sufficiente sia per il blocco che per l'applicazione anticorpale primaria, è sufficiente 100 l per sezione.
- Applicare 100 l di soluzione di blocco per sezione.
- Incubare i vetrini coperti con la soluzione di blocco a 4 gradi centigradi per 1 ora.
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Colorazione per wsCK e SMA
- Diluire gli anticorpi anti-CK8 e anti-CK1916 (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I e TROMA-III, rispettivamente) 1:20 nel buffer di blocco per macchiare per wsCK. Diluire l'anticorpo anti-SMA17 (Tabella dei materiali) a 1:200 nello stesso buffer.
- Applicare 100 l della soluzione anticorpale diluita contenente tutti e tre gli anticorpi per ogni sezione.
- Incubare i vetrini coperti con la soluzione anticorpale a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Lavare i vetrini con PBS - 0.1% Triton tre volte, 5 min ciascuno.
- Anticorpi secondari diluiti (anti-ratto-Alexa488 e anti-topo-Cy5) 1:200 in PBS - 0.3% Triton.
- Applicare 100 l della soluzione anticorpale secondaria contenente entrambi gli anticorpi secondari ai vetrini.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
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Colorazione e montaggio nucleare DAPI
- Lavare i vetrini tre volte, 5 min ciascuno.
- Applicare 100 l di DAPI (1:3000) a ciascuna sezione per 10 min.
- Applicare Antifade Mounting Medium (Tabella dei materiali) ai vetrini e posizionare una vetrina di vetro sopra le sezioni di tessuto. Lasciare i vetrini a 4 gradi durante la notte. Sigillare le diapositive il giorno successivo.
- Conservare le diapositive a 4 gradi centigradi e l'immagine entro 1 settimana dal montaggio.
5. Imaging e quantificazione dei BD
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Imaging sezioni epatiche
- Prima dell'imaging, accechi al genotipo del campione con l'aiuto di un membro del laboratorio. Assicurarsi che tutti i file di imaging siano privi di genotipo o altre informazioni di identificazione specifiche oltre a un numero animale/campione.
- Utilizzando un microscopio fluorescente, scatta 20x immagini a 1 volte lo zoom di ogni sezione e assicurati che ogni fotovoltaico attraverso il fegato sia immagine. Includere i lobi sinistro, mediale, destro e caudato.
NOT: Di solito troviamo 60-90 tratti portale per animale a seconda delle dimensioni del fegato. - Per identificare i PV, cercare la colorazione sMA più wsCK. Le strutture che sono positive per la SMA, ma che non dispongono di colorazione wsCK, non sono strutture del portale.
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Identificazione e conteggio dei BD
- Creare un foglio di calcolo con le seguenti colonne: Animale/Numero di esempio, Numero immagine, Numero di PV e Numero di BD.
- Passando attraverso ogni immagine, identificare e registrare il numero di PV per immagine.
- Identificare i BD brevettati in ogni immagine in base alla presenza di cholangiocytes (wsCK) che circondano un lume definibile. Le strutture devono essere distinte e separate da mesenchyme da altre celle wsCK.
- Contare ogni brevetto BD e posizionare nella stessa colonna del numero di immagine.
- Eseguire questa operazione per ogni immagine scattata da un PV.
- Calcolare la somma di tutti i PV e di tutti i BD nel campione del fegato.
- Calcolare il rapporto BD-PV per il campione di fegato.
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Representative Results
In precedenza abbiamo documentato i difetti biliari negli animali Jag1/– un modello murino di ALGS8. Per determinare il rapporto BD-PV, abbiamo sezionato i fegati di topo P30 e li abbiamo co-macchiati per CK8 e CK19 (wsCK) insieme al marcatore vascolare sMA. Abbiamo poi immaginato tutti i PV in ciascuno dei lobi epatici. Come illustrato nella Figura 2A, abbiamo definito i PV come vasi con colorazione sMA con colorazione wsCK adiacente (frecce). Le strutture macchiate di SMA senza wsCK erano vene centrali e non dovevano essere incluse nell'analisi (freccia).
Una volta identificati i PV, abbiamo identificato i BD brevettati dalla loro forma caratteristica. Come mostrato nella Figura 3, i condotti di brevetto hanno un lume chiaramente definibile che è circondato da cholangiocytes wsCK. I condotti sono di solito separati da condotti vicini o colgaliociti da mesenchyme (punta di freccia). Le celle wsCK che non hanno un lume definibile, sono attaccate a celle adiacenti o appaiono in isolamento, non vengono conteggiate per il numero totale di BD (frecce). La figura 3A mostra una sezione epatica di tipo selvaggio con un pv che è associato a un condotto completamente brevettato insieme a diverse cellule non incorporate. La figura 3B è una sezione epatica rappresentativa di un animale P30 Jag1/– . In questa sezione non sono presenti BD brevettati. Tutte le celle wsCK sono non incorporate e pertanto non devono essere conteggiate. Questa immagine evidenzia l'importanza di un attento conteggio del BD, poiché la presenza o l'assenza di cellule wsCK non differenzia i fegati di Jag1 e wild-type.
Come dimostrato nella Figura 1D, l'analisi del rapporto BD-PV comporta il conteggio di ogni fotovoltaico nella sezione epatica insieme al numero totale di BD brevettati presenti intorno a ogni fotovoltaico. Durante l'analisi dei fegati Jag1/–, abbiamo notato che diversi lobi non sono necessariamente interessati nella stessa misura in questi animali (dati inediti). Pertanto, di solito contiamo i PV attraverso la sinistra, i lobi mediali, a destra e caudate per garantire una copertura completa del fegato. Dopo la tabulazione dei PV e BD totali, il rapporto viene calcolato per l'intera sezione.
Nella Figura 4, abbiamo mostrato l'analisi dei rapporti BD-PV per 3 animali selvatici e 3 Jag1/– . Questo grafico mostra come i due genotipi possono essere facilmente distinti in base ai conteggi BD. Inoltre, questo metodo fornisce una misura quantitativa per l'analisi del grado di salvataggio del Fenotipo Jag1-– da manipolazioni genetiche, come riportato in precedenza8.
Figura 1: Schema del processo sperimentale. (A) Il fegato viene raccolto intero dal topo. (B) I campioni di fegato sono fissati per 48 h, disidratati e cancellati. (C) Il tessuto epatico è incorporato nella paraffina. Le sezioni sono fatte e posizionate su vetrini caricati e macchiate per wsCK e SMA. (D) Le diapositive sono immagini e viene registrato il numero di PV e BD. Il rapporto BD-PV (BD:PV) viene calcolato per l'intera sezione epatica. HA - arteria epatica; CV - vena centrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Distinguere le vene centrali da PVs. (A) A PV è identificato dalla presenza di colorazione SMA e che circondano i cholangiocyti wsCK (punte di freccia). (B) Le vene centrali sono identificate dalla presenza di colorazione SMA senza colonne di ghiaccioli presenti intorno alla struttura (freccia). (A' e B') Le immagini in scala di grigi che mostrano i canali SMA rispettivamente da A e B. Barra di scala: 100 m e si applica a tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione dei brevetti BD. (A-A') Nei fegati di tipo P30, contiamo con strutture ellissidi con un lume distinguibile circondato da chogaliocytes wsCK come un BD brevettato (punta di freccia). I cholangiociti che non circondano un lume sono considerati non incorporati e non vengono conteggiati (frecce). (B-B') Nei fegati di Jag1/– i cholangiocyti sono ancora presenti (frecce). Tuttavia, la maggior parte non sono incorporati in brevetti BDs. Barra di scala 100 m e si applica a tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il BD al grafico PV da fegati di topo P30. I BD e i PV vengono quantificati e viene generato il rapporto BD-PV. Come riportato in precedenza,glianimali Jag1// hanno una diminuzione caratteristica e significativa del rapporto BD-PV rispetto agli animali selvatici. Per l'analisi statistica, è stato eseguito il test tbidirezionale. Le linee orizzontali mostrano i mezzi. P<0.001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'analisi dello sviluppo e della riparazione di BD nei topi è uno strumento importante per studiare la patogenesi e il meccanismo dei disturbi colestatici. Inoltre, lo sviluppo di nuove terapie dipende in parte dalla creazione di un fenotipo riproducibile e preferibilmente quantificabile. L'attuale fenotipizzazione nei modelli murini di solito coinvolge la chimica del siero, l'istologia del fegato e l'immunostaining per marcatori specifici di tipo cellulare. Sebbene queste tecniche generino informazioni preziose sulla struttura e la funzione del sistema biliare, non forniscono una misura diretta degli effetti di una data manipolazione genetica sul numero di BD. Nella patologia anatomica, la scarsità di BD nei pazienti umani è determinata attraverso l'analisi del rapporto BD-PV in una sezione di biopsia9. Mentre i medici impiegano l'analisi chimica del siero per determinare la gravità della colestasi e della malattia epatica in ALGS e altre malattie collestatiche18,19, la valutazione istologica nei modelli murini è fondamentale sia per la comprensione gli effetti dei modificatori della malattia sullo sviluppo di BD e l'efficacia delle terapie sul ripristino del normale sviluppo del condotto. Questo è in parte perché i topi possono avere una grave diminuzione del numero di BD brevettati, ma mostrano ancora solo un modesto aumento del livello di biliarina sierolivello 8, probabilmente a causa del drenaggio della bile altamente efficiente nel fegato del topo. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che Jag1 eterozygosity si traduce in compromissione della maturazione BD, ma non l'assenza di cholangcioytes8. Pertanto, per analizzare lo sviluppo di BD e valutare la gravità della malattia nei modelli murini, non è sufficiente esaminare semplicemente l'assenza o la presenza di cholangiocyti. Per affrontare questo problema, qui abbiamo presentato un metodo semplice per la misurazione oggettiva dei numeri BD brevettati nel fegato del topo.
La nostra analisi dipende dalla corretta fissazione e incorporamento del fegato del topo. I fegati sono lato ventrale incorporato per garantire sezionamento simile da un campione all'altro. Questa è la posizione più stabile. Le sezioni utilizzate per la colorazione devono essere abbastanza profonde nei lobi epatici, in quanto vi sono differenze nel numero di BD e nelle dimensioni dei CV nella periferia rispetto all'hilum del fegato. Occasionalmente vediamo prevegli che vengono tagliati longitudinalmente. In questi casi, di solito c'è un BD vicino che viene anche tagliato longitudinalmente e appare come un lungo tubo aperto. Per garantire la riproducibilità, contiamo questi tubi lunghi come un singolo BD. L'identificazione dei BD brevettati non è ambigua per la maggior parte. Tuttavia, alcune strutture biliari appaiono lumenizzate, ma non mostrano la morfologia dell'ellissoide da arrotondare tipicamente osservata nei normali BD14. Nelle nostre mani, questo può talvolta comportare che una struttura venga chiamata BD da un investigatore, ma non da un altro collega. Pertanto, per garantire la coerenza e la riproducibilità nell'analisi e nella presentazione dei dati, consigliamo che tutti i campioni relativi a un progetto specifico vengano analizzati da due ricercatori in modo indipendente.
L'anti-CK8 ha dimostrato di contrassegnare cellule biliari immature e mature, mentre l'anti-CK19 segna solo cellule biliarie mature12,20. Pertanto, anche se un fotovoltaico non è associato a un BD maturo, può essere facilmente differenziato dalle vene centrali a causa della presenza di cellule CK8. L'utilizzo di questi due anticorpi in combinazione con l'anti-SMA garantisce una copertura completa dei tratti del portale nella nostra quantificazione. Inoltre, nelle nostre mani, la colorazione individuale CK19 o CK8 delle cellule biliari genera un segnale relativamente debole ed è associata ad alcune macchie di fondo. Mescolando i due anticorpi CK si ottiene un segnale costantemente forte nelle cellule biliari e quindi facilita la quantificazione.
La maturazione dell'albero biliare intraepatico avviene in una direzione ilar-periferica e continua postnatale21. Infatti, ci sono molti più colgaliociti immaturi nei primi fegati postnatali, soprattutto nelle aree periferiche, che sono al fronte principale dell'espansione del fegato postnatale. Inoltre, abbiamo osservato un cambiamento nei numeri di BD come gli animali dietà 8, con più condotti negli animali più anziani. Inoltre, alcune strutture del portale contengono più BD, mentre altri hanno uno o nessun condotto, in particolare lungo la periferia del fegato. Usiamo una diapositiva di microscopia che copre tutti i lobi epatici per ogni animale e quantifica sistematicamente il rapporto BD-PV su tutta la diapositiva. Anche se questo non è essenziale, assicura che ampi tratti del portale vengono analizzati per ogni animale indipendentemente dall'età e dalle dimensioni del fegato (60-90 PV per fegato a seconda del genotipo e dell'età). Inoltre, analizzando tutti i fotovoltaici sullo scivolo, ci assicuriamo che sia le aree più mature più mature che le aree periferiche meno mature siano conteggiate in tutte le fasi dello sviluppo epatico. Coprendo tutti i lobi epatici per ogni animale può anche diminuire la variabilità nelle misurazioni se una determinata mutazione non influisce uniformemente sullo sviluppo di BD sul fegato.
Il metodo è limitato nel distinguere i condotti biliari più piccoli da gruppi di cellule biliari non incorporate. I dotuli biliari4 sono di solito troppo piccoli per essere riconosciuti come una struttura lumenizzata nell'ingrandimento che usiamo per analizzare queste macchie. Pertanto, è probabile che siano esclusi dalle nostre quantificazioni, e quindi il metodo è inclinato verso l'identificazione di condotti medio-grandi. Nonostante questa limitazione, il metodo qui descritto distingue facilmente tra i fegati Jag1 e Jag1. Inoltre, è abbastanza sensibile da rilevare il salvataggio parziale della paula di Jag1/– BD alla perdita simultanea di una copia di Polgut1/– e il modesto aumento della densità di BD negli animali Jag1 e z con perdita condizionale di Poglut1 nelle cellule muscolari lisce vascolari8. Queste osservazioni indicano l'utilità di questo metodo nel determinare alterazioni della densità di BD in vari contesti genetici, anche quando i cambiamenti nel numero di BD sono modesti.
Negli ultimi anni, la visualizzazione della struttura 3D dell'albero biliare è stata utilizzata da diversi gruppi per analizzare lo sviluppo BD22,23,24,25. Questi eleganti metodi si basano sul riempimento dell'albero biliare dal BD comune con inchiostro o resina, e quindi esaminare la patenza del sistema biliare. Inoltre, forniscono informazioni sulla struttura 3D dell'albero biliare e sulla sua formazione nella periferia epatica man mano che il fegato cresce, che non può essere valutato con una valutazione 2D utilizzata in protocolli come quello qui presentato. Tuttavia, il successo delle prestazioni di queste tecniche di visualizzazione 3D richiede una notevole esperienza26. Al contrario, la tecnica qui presentata è piuttosto semplice e può essere eseguita da qualsiasi gruppo con accesso a apparecchiature di routine per l'analisi istologica e di imaging. Inoltre, l'analisi delle sezioni a doppia macchia per wsCK e sMA mostrerà anche se esistono reazioni dudulare o anomalie vascolari delle cellule muscolari lustrai nel fegato8,27,28. Suggeriamo che la quantificazione del rapporto BD-PV in intere sezioni epatiche possa fornire una misura sensibile e riproducibile dello sviluppo biliare nei topi e possa servire come tecnica relativamente semplice per aiutare gli investigatori a decidere se prendere in considerazione più tecniche sofisticate come la visualizzazione 3D dell'albero biliare.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno del National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), un Pilot/Feasibility Award del Texas Medical Center Digestive Disease Center sotto NIH P30 DK56338, e un Alagille Syndrome Accelerator Award da La Fondazione Medica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
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