Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo
Summary
Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l’efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.
Abstract
Il topo è ampiamente usato come organismo modello per studiare le malattie biliari. Per valutare lo sviluppo e la funzione del sistema biliare, vengono utilizzate varie tecniche, tra cui la chimica del siero, l’analisi istologica e l’immunostaining per marcatori specifici. Anche se queste tecniche possono fornire importanti informazioni sul sistema biliare, spesso non presentano un quadro completo dei difetti dello sviluppo del dotto biliare (BD) in tutto il fegato. Ciò è in parte dovuto alla robusta capacità del fegato di topo di drenare la bile anche negli animali con compromissione significativa nello sviluppo biliare. Qui presentiamo un metodo semplice per calcolare il numero medio di BD associati a ogni vena del portale (PV) in sezioni che coprono tutti i lobi di topi mutanti/transgenici. In questo metodo, i fegati sono montati e sezionato in modo stereotipato per facilitare il confronto tra vari genotipi e condizioni sperimentali. I BD sono identificati tramite microscopia leggera dei cholangiociti macchiati di citokeratina, e quindi contati e divisi per il numero totale di FOTO presenti nella sezione epatica. Ad esempio, mostriamo come questo metodo possa distinguere chiaramente tra topi selvatici e un modello murino della sindrome di Alagille. Il metodo qui presentato non può sostituire le tecniche che visualizzano la struttura tridimensionale dell’albero biliare. Tuttavia, offre un modo semplice e diretto per valutare quantitativamente lo sviluppo della BD e il grado di formazione della reazione dudulare nei topi.
Introduction
L’albero biliare è una parte critica del fegato dei mammiferi, permettendo il passaggio della bile dagli epatociti nell’intestino. I dotti biliari intraepatici (BD) sono formati da cholangiociti, che si differenziano dagli epatoblasti bipotenziali attraverso la segnalazione di Notch e TGF Una corretta specificazione e impegno dei cholangiocyti e del loro assemblaggio in BD maturi sono fondamentali per lo sviluppo dell’albero biliare intraepatico. Come il fegato cresce durante lo sviluppo o sulla rigenerazione dell’organo, il sistema biliare ha bisogno di sviluppare lungo il fegato per garantire il corretto drenaggio della bile. Inoltre, un certo numero di malattie sindromiche e non sindromiche si traducono nella scarsità di BD intraepatici3 . Inoltre, una serie di malattie acute e croniche del fegato danno origine alle cosiddette reazioni dudulle nel fegato, che sono definite come la presenza di un numero significativo di cellule che esprimono marcatori biliari ma non derivano necessariamente da cellule biliari o forme brevetto BD4. Nel disturbo multisistema la sindrome di Alagille (ALGS), aploinsufficienza del ligando di Notch(JAG1) provoca scarsa formazione di BD e colestasi5,6. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che una lineadi mouse Jag1 eterozygous generata in precedenza è un modello animale di paucedia BD in ALGS8. In questo modello di topo di ALGS, i cholangiocytes sono ancora presenti. Tuttavia, non riescono a impegnarsi nell’incorporazione in maturi, brevetti BD8. Pertanto, l’analisi del fegato in un modello di paucity BD richiede più della presenza apparente o assenza di colgaliociti. È importante valutare con precisione il grado di presenza di BD maturi nel fegato.
Nella patologia anatomica, ci sono metodi quantitativi accettati per valutare se la paucity BD esiste9. Ad esempio, gli studi su ALGS su pazienti umani spesso quantificano il rapporto BD-vina porta (PV) analizzando almeno 10 vasi portali per biopsia epatica9,10. L’analisi della forma e la presenza complessiva o l’assenza di BD brevettati, combinati con la chimica del siero, possono fornire preziose informazioni sullo sviluppo di BD nei topi11,12,13. Tuttavia, i topi possono perdere un numero significativo di BD con solo un modesto aumento del livello biliarina del siero8. Di conseguenza, un metodo quantitativo che valuta il numero di BD presenti per fotovoltaico può fornire una misura più diretta del grado di scarsità di BD nei topi. In un recente rapporto, abbiamo quantificato il numero di BD per FOTO in tutti i lobi epatici e segnalato una significativa diminuzione del rapporto BD-PV in Jag1/– animali8. Nel corso della nostra analisi, abbiamo notato che, nonostante la variazione significativa nel grado di risposta infiammatoria e reazioni dudulare, il rapporto BD-PV non mostra molta variabilità8. Inoltre, la quantificazione del rapporto BD-PV ci ha permesso di dimostrare che la rimozione di una copia del gene glicosiltransferasi Poglut1 in Jag1- / gli animali possono migliorare significativamente la loro scarsità di BD8. In uno sfondo di Jag1/ , la perdita condizionale di Poglut1 nelle cellule muscolari limpiche vascolari si traduce in un aumento progressivo del numero di BD, che è modesto (20-30%) a P7 ma diventa prominente negli adulti8. Anche in questo caso, questa tecnica ci ha permesso di dimostrare che anche a P7, l’aumento della densità di BD in questi animali è statisticamente significativo. Da notare che l’aumento della densità di BD in questo genotipo a quattro mesi di età è stato convalidato anche attraverso l’analisi del getto di resina. 8 Queste osservazioni e altre relazioni che misuravano la densità di BD in diversi modelli murini ALGS14,15 ci hanno spinto a incorporare questo metodo nella nostra strategia complessiva per analizzare i difetti biliari in vari modelli mutanti e topi transgenici.
In questo caso, viene descritta in dettaglio una tecnica semplice che può essere utilizzata per esaminare il grado di scarsità di BD nei modelli murini di malattia epatica (Figura 1). In questo metodo, la co-colorazione con marcatori di colosso ciclica (CK) 8 e CK19 (in seguito ad ampio spettro CK, wsCK) viene utilizzata per visualizzare BD e cholangiocyte non incorporati nel fegato del topo. Un anticorpo contro l’actina muscolare alfa-liscio (SMA) viene aggiunto alla colorazione per etichettare i vasi. L’analisi sistematica del rapporto BD-PV in una sezione che copre tutti i lobi epatici assicura che un gran numero di fotocamere venga analizzato per ogni genotipo. Poiché il nostro metodo si basa sulla quantificazione di BD e PV in immagini 2D, non è adatto per studiare gli effetti di una determinata mutazione sulla struttura 3D dell’albero biliare o sull’integrità dei piccoli condotti biliari. Tuttavia, fornisce una strategia semplice e oggettiva per gli investigatori per valutare lo sviluppo biliare nel mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi dello sviluppo e della riparazione di BD nei topi è uno strumento importante per studiare la patogenesi e il meccanismo dei disturbi colestatici. Inoltre, lo sviluppo di nuove terapie dipende in parte dalla creazione di un fenotipo riproducibile e preferibilmente quantificabile. L’attuale fenotipizzazione nei modelli murini di solito coinvolge la chimica del siero, l’istologia del fegato e l’immunostaining per marcatori specifici di tipo cellulare. Sebbene queste tecniche generino informazioni preziose sulla s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno del National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), un Pilot/Feasibility Award del Texas Medical Center Digestive Disease Center sotto NIH P30 DK56338, e un Alagille Syndrome Accelerator Award da La Fondazione Medica.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
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