マウス肝臓における胆管密度の決定
Summary
マウス肝臓における胆管密度を正確に定量するための、かなりシンプルで敏感な方法を提示する。この方法は、遺伝的および環境修飾子の効果と胆汁病のマウスモデルにおける潜在的な治療法の有効性の決定に役立ちます。
Abstract
マウスは、胆汁病を研究するためのモデル生物として広く使用されています。胆道系の発達と機能を評価するために、血清化学、組織学的分析、特定マーカーの免疫染色など、様々な技術が用いられる。これらの技術は胆道系に関する重要な情報を提供することができますが、多くの場合、肝臓全体にわたって胆管(BD)発達欠陥の全体像を提示しません。これは、胆汁の発達に著しい障害を持つ動物においても胆汁を排出するマウス肝臓の堅牢な能力に起因する。ここでは、変異型/トランスジェニックマウスのすべてのローブをカバーするセクションで、各ポータル静脈(PV)に関連する平均BD数を計算する簡単な方法を示す。この方法では、肝臓は、様々なゲノムと実験条件間の比較を容易にするために、ステレオタイプ的な方法で取り付けられ、切除される。BDは、シトケラチン染色胆管細胞の光顕微鏡検査によって同定され、その後、肝臓部に存在するPVの総数でカウントされ、除算される。一例として,この方法が野生型マウスとアラギル症候群のマウスモデルを明確に区別する方法を示す.ここで提示する方法は、胆樹の三次元構造を可視化する技術に代わるものとはならない。しかし、それは定量的にBDの発達およびマウスの管反応形成の程度を定量的に評価する容易で直接的な方法を提供する。
Introduction
胆汁の木は哺乳類の肝臓の重要な部分であり、肝細胞から腸への胆汁の通過を可能にする。肝内胆管(BD)は、ノッチおよびTGFβシグナル伝達1、2を介して二電位肝芽細胞と区別する胆管状細胞によって形成される。成熟したCDへの胆管細胞とその組み立ての適切な仕様とコミットメントは、肝内胆樹の開発のために重要です。肝臓が発達中または臓器再生時に成長するにつれて、胆汁器系は適切な胆汁の排液を確保するために肝臓に沿って発達する必要がある。さらに、多くのシンドロミックおよび非シンドロミック疾患は、肝内BDs3の貧弱をもたらす。さらに、多くの急性および慢性肝疾患は、胆汁マーカーを発現するが、必ずしも胆汁細胞または形態から生じるとは限らないかなりの数の細胞の存在として定義される、肝臓のいわゆる管反応を引き起こす。特許BDs4.多系統障害アラギル症候群(ALGS)では、ノッチリガンドギザギザギザ(JAG1)のハプロインの充足は、BD形成およびコレスタ症5、6の不十分なBD形成をもたらす。我々の研究室は最近、以前に生成されたJag1ヘテロジゴウスマウスライン7がALGS8におけるBDポーシティの動物モデルであることを実証した。ALGSのこのマウスモデルでは、胆管細胞はまだ存在する。しかし、彼らは成熟した特許BDs8に組み込むことを約束することができません。したがって、BDの貧弱のモデルにおける肝臓の分析は、胆管細胞の明らかな存在または不在以上のものを必要とする。成熟したCDが肝臓に存在する程度を正確に評価することが重要です。
解剖病理学では、BDのポーシティが存在するかどうかを評価するための受け入れられた定量的方法が9である。例えば、ヒト患者におけるALGSに関する研究は、肝生検9、10当たり少なくとも10のポータル血管を分析することによって、BDからポータル静脈(PV)比を定量することが多い。特許BDの形状および全体的な有無の分析は、血清化学と組み合わせることで、マウス11、12、13におけるBD発達に関する貴重な情報を提供することができる。しかし、マウスは、血清ビリルビンレベル8のわずかな増加でかなりの数のBDを失う可能性があります。したがって、PV当たりの存在するBDの数を評価する定量的方法は、マウスにおけるBDのポーシティの程度をより直接的に測定することができる。最近の報告では、我々はすべての肝葉全体のPVあたりのBDの数を定量化し、Jag1+/–動物8のBD対PV比の有意な減少を報告した。 我々の分析の過程で、炎症反応および管反応の程度に有意な変動があるにもかかわらず、BD対PV比は大きな変動性8を示さない。さらに、BDとPV比の定量化により、Jag1+/でグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子Poglut1のコピーを1部除去することで、動物のBDの貧弱性を有意に改善できることを実証することができました。 Jag1+/+の背景では、血管平滑筋細胞におけるPoglut1の条件付き損失は、BD数の漸進的な増加をもたらす(20-30%)P7で、大人8で顕著になります.繰り返しますが、この技術は、P7でも、これらの動物のBD密度の増加が統計的に有意であることを示すことを可能にした。なお、生後4ヶ月のこの遺伝子型におけるBD密度の増加は、樹脂鋳造解析を通じて検証された。8これらの観測値および異なるALGSマウスモデル14、15におけるBD密度を測定した他の報告は、様々な変異体の胆汁欠損を分析するための全体的な戦略にこの方法を組み込むことを促したトランスジェニックマウス。
ここでは、肝疾患のマウスモデルにおけるBD罹患率を調べるために使用できる簡単な手法を詳述する(図1)。この方法では、コランゴサイトマーカーサイトケラチン(CK)8およびCK19(以下、広スペクトルCK、wsCK)との共染色を用いて、マウス肝臓におけるBDsおよび非組み込み胆管細胞を可視化する。α平滑筋アクチン(αSMA)に対する抗体を標識容器に染色する。すべての肝葉をカバーするセクションにおけるBDとPV比の系統的分析は、各遺伝子型について多数のPVが分析されることを保証する。我々の方法は、2D画像におけるBDとPVの定量化に依存しているため、胆樹の3D構造や小さな胆管の完全性に対する特定の変異の影響を調べたりするのに適していません。それにもかかわらず、それはマウスの胆道の発達を評価するために研究者のための簡単で客観的な戦略を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスにおけるBDの発達と修復の解析は、胆嚢障害の病因およびメカニズムを研究する上で重要なツールである。さらに、新しい治療法の開発は、再生可能で好ましくは定量化可能な表現型の確立に部分的に依存する。マウスモデルにおける現在の表現型は、通常、血清化学、肝臓組織学および細胞型特異的マーカーの免疫染色を伴う。これらの技術は胆道系の構造と機能に関する貴重な情?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、国立衛生研究所(NIH)(R01 GM084135およびR01 DK109982)、NIH P30 DK56338の下でテキサス医療センター消化器病センターからのパイロット/実現可能性賞、およびアラギル症候群アクセラレータ賞からの支援を認めます。医療財団
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
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