Summary
マウス肝臓における胆管密度を正確に定量するための、かなりシンプルで敏感な方法を提示する。この方法は、遺伝的および環境修飾子の効果と胆汁病のマウスモデルにおける潜在的な治療法の有効性の決定に役立ちます。
Abstract
マウスは、胆汁病を研究するためのモデル生物として広く使用されています。胆道系の発達と機能を評価するために、血清化学、組織学的分析、特定マーカーの免疫染色など、様々な技術が用いられる。これらの技術は胆道系に関する重要な情報を提供することができますが、多くの場合、肝臓全体にわたって胆管(BD)発達欠陥の全体像を提示しません。これは、胆汁の発達に著しい障害を持つ動物においても胆汁を排出するマウス肝臓の堅牢な能力に起因する。ここでは、変異型/トランスジェニックマウスのすべてのローブをカバーするセクションで、各ポータル静脈(PV)に関連する平均BD数を計算する簡単な方法を示す。この方法では、肝臓は、様々なゲノムと実験条件間の比較を容易にするために、ステレオタイプ的な方法で取り付けられ、切除される。BDは、シトケラチン染色胆管細胞の光顕微鏡検査によって同定され、その後、肝臓部に存在するPVの総数でカウントされ、除算される。一例として,この方法が野生型マウスとアラギル症候群のマウスモデルを明確に区別する方法を示す.ここで提示する方法は、胆樹の三次元構造を可視化する技術に代わるものとはならない。しかし、それは定量的にBDの発達およびマウスの管反応形成の程度を定量的に評価する容易で直接的な方法を提供する。
Introduction
胆汁の木は哺乳類の肝臓の重要な部分であり、肝細胞から腸への胆汁の通過を可能にする。肝内胆管(BD)は、ノッチおよびTGFβシグナル伝達1、2を介して二電位肝芽細胞と区別する胆管状細胞によって形成される。成熟したCDへの胆管細胞とその組み立ての適切な仕様とコミットメントは、肝内胆樹の開発のために重要です。肝臓が発達中または臓器再生時に成長するにつれて、胆汁器系は適切な胆汁の排液を確保するために肝臓に沿って発達する必要がある。さらに、多くのシンドロミックおよび非シンドロミック疾患は、肝内BDs3の貧弱をもたらす。さらに、多くの急性および慢性肝疾患は、胆汁マーカーを発現するが、必ずしも胆汁細胞または形態から生じるとは限らないかなりの数の細胞の存在として定義される、肝臓のいわゆる管反応を引き起こす。特許BDs4.多系統障害アラギル症候群(ALGS)では、ノッチリガンドギザギザギザ(JAG1)のハプロインの充足は、BD形成およびコレスタ症5、6の不十分なBD形成をもたらす。我々の研究室は最近、以前に生成されたJag1ヘテロジゴウスマウスライン7がALGS8におけるBDポーシティの動物モデルであることを実証した。ALGSのこのマウスモデルでは、胆管細胞はまだ存在する。しかし、彼らは成熟した特許BDs8に組み込むことを約束することができません。したがって、BDの貧弱のモデルにおける肝臓の分析は、胆管細胞の明らかな存在または不在以上のものを必要とする。成熟したCDが肝臓に存在する程度を正確に評価することが重要です。
解剖病理学では、BDのポーシティが存在するかどうかを評価するための受け入れられた定量的方法が9である。例えば、ヒト患者におけるALGSに関する研究は、肝生検9、10当たり少なくとも10のポータル血管を分析することによって、BDからポータル静脈(PV)比を定量することが多い。特許BDの形状および全体的な有無の分析は、血清化学と組み合わせることで、マウス11、12、13におけるBD発達に関する貴重な情報を提供することができる。しかし、マウスは、血清ビリルビンレベル8のわずかな増加でかなりの数のBDを失う可能性があります。したがって、PV当たりの存在するBDの数を評価する定量的方法は、マウスにおけるBDのポーシティの程度をより直接的に測定することができる。最近の報告では、我々はすべての肝葉全体のPVあたりのBDの数を定量化し、Jag1+/–動物8のBD対PV比の有意な減少を報告した。 我々の分析の過程で、炎症反応および管反応の程度に有意な変動があるにもかかわらず、BD対PV比は大きな変動性8を示さない。さらに、BDとPV比の定量化により、Jag1+/でグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子Poglut1のコピーを1部除去することで、動物のBDの貧弱性を有意に改善できることを実証することができました。 Jag1+/+の背景では、血管平滑筋細胞におけるPoglut1の条件付き損失は、BD数の漸進的な増加をもたらす(20-30%)P7で、大人8で顕著になります.繰り返しますが、この技術は、P7でも、これらの動物のBD密度の増加が統計的に有意であることを示すことを可能にした。なお、生後4ヶ月のこの遺伝子型におけるBD密度の増加は、樹脂鋳造解析を通じて検証された。8これらの観測値および異なるALGSマウスモデル14、15におけるBD密度を測定した他の報告は、様々な変異体の胆汁欠損を分析するための全体的な戦略にこの方法を組み込むことを促したトランスジェニックマウス。
ここでは、肝疾患のマウスモデルにおけるBD罹患率を調べるために使用できる簡単な手法を詳述する(図1)。この方法では、コランゴサイトマーカーサイトケラチン(CK)8およびCK19(以下、広スペクトルCK、wsCK)との共染色を用いて、マウス肝臓におけるBDsおよび非組み込み胆管細胞を可視化する。α平滑筋アクチン(αSMA)に対する抗体を標識容器に染色する。すべての肝葉をカバーするセクションにおけるBDとPV比の系統的分析は、各遺伝子型について多数のPVが分析されることを保証する。我々の方法は、2D画像におけるBDとPVの定量化に依存しているため、胆樹の3D構造や小さな胆管の完全性に対する特定の変異の影響を調べたりするのに適していません。それにもかかわらず、それはマウスの胆道の発達を評価するために研究者のための簡単で客観的な戦略を提供する。
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Protocol
すべての動物は、施設の動物ケアと使用委員会のガイドラインと承認された動物プロトコルの下でベイラー医科大学のバリア動物施設に収容されました。
1. マウス肝組織の採取
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肝臓収穫のためのマウスの調製
- イソファランを使用してマウスを安楽死させる。
- 死を確実にするために、マウスの頸部脱臼を行う。
- 肋骨ケージの約1インチ下に横切開を行います。
- 肝臓の腹部表面全体を露出させる。
-
マウス肝臓の採取
- 慎重に、小さなはさみで、肝臓を腹部の他の器官に接続する靭帯を切り取る。
- 一般的なBDを切り取り、腸から肝臓を切り離す。
- 慎重に胆嚢に保持することにより、肝臓を削除し、すぐに4%パラホルムアルデヒド(PFA)によって3分の1に充填された50 mLチューブに入れます。
2. パラフィンの肝臓の固定と埋め込み
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固定
- 肝臓組織を4°Cで4%PFAで48時間固定します。
- 4°Cで1時間70%EtOHでティッシュを洗います。
- 組織を95%EtOHで2回洗い、4°Cで1時間ずつ洗います。
- 4°Cで1時間100%EtOHでティッシュを2回洗います。
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クリア
- 肝臓組織を浄化剤(材料の表)で3回、室温で30分間洗う。
注:肝臓は、3回目の洗浄に続いて硬く感じる必要があります。
- 肝臓組織を浄化剤(材料の表)で3回、室温で30分間洗う。
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パラフィンへの埋め込み
- 組織カセットをパラフィンワックスのティッシュカビに入れ、それぞれ30分間洗います。ワックスは60°Cに予熱する必要があります。
- 組織金型をパラフィンワックスで3分の1の高さに充填し、60°Cで加熱ブロックに保管してください。
- 肝臓をカビの中に入れ、腹部側を上に向けて置きます。
- 加熱ブロックから金型を慎重に取り外します。
- カセットの上部を金型の上に置き、ホット液体パラフィンでトップオフします。
- 金型とブロックを一晩室温まで冷やします。
注:組織ブロックは室温で貯えることができる。
3. 肝臓組織の切除
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断面化のためのブロックの準備
- 金型からブロックを取り除く前に、5分間氷の上に金型を置きます。
- ブロックと氷の間に存在するラボティッシュペーパーで氷の上にブロックを置きます。
- 最高の組織スライス結果を求めて断面しない場合は、氷の上にブロックを置いてください。
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肝臓ブロックの断面
- マイクロトームを使用して、肝臓の表面的な、後部側を切り取ることから始める。断面は5 μmでなければなりません。
- 解剖顕微鏡の下の表面的なセクションをチェックして、セクションがせき取られたり折られたりしていないことを確認してください。
- カウデートローブを含む肝臓のセクションを取る.
注:一部のブロックでは、同じティッシュスライス上に左、中間、右、およびコーデートローブがあります。 - 4 つのローブがすべて同じスライド上に存在しないブロックの場合は、左、中間ローブ、右ローブが同じスライド上に存在するまでスライスを続けます。
4. wsCKおよびαSMAのための免疫組織化学
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免疫組織化学用スライドの処理
- 分析する遺伝子型ごとに 1 つのスライドを選択します。
- シレンで15分間、100%EtOH、95%EtOH、最後に70%EtOH(各溶液で3 x 5分)を洗浄します。
- スライドを脱イオンH2 Oで5分間洗います。
- 抗原検索溶液(トリスベース、高pH)にスライドを浸します。
- 圧力鍋で圧力下で10psiで3分間熱します。
- スライドを室温(約35分)まで冷やします。
-
組織セクションを遮断する
- Pap ペンを使用して、スライド上のセクションの概要を説明します。
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)+0.1%の十二を塗布し、セクションを2回、それぞれ5分ずつ覆う。
- PBS + 0.3% トリトンで 1:50 で通常のヤギ血清 (NGS) を混合してブロッキング バッファーを作成します。ブロッキングと一次抗体の両方に十分なバッファーを持つためには、セクションあたり100 μLで十分です。
- セクションごとに100 μLのブロッキング溶液を適用します。
- ブロッキング溶液で覆われたスライドを4°Cで1時間インキュベートします。
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wsCKおよびαSMAの染色
- 希釈抗CK8および抗CK19抗体16(発達研究ハイブリドーマバンク、TROMA-IおよびTROMA-III)1:20をブロッキングバッファー中にwsCK用染色する。抗αSMA抗体17(材料表)を同じバッファー内で1:200に希釈する。
- 3つの抗体をすべて含む希釈抗体溶液を100μLの各セクションに塗布する。
- 抗体溶液で覆われたスライドを一晩4°Cでインキュベートする。
- PBS + 0.1% トリトンでスライドを3回、それぞれ5分ずつ洗います。
- 希釈二次抗体(抗ラット-Alexa488および抗マウス-Cy5)1:200 PBS+ 0.3%トリトン。
- 両方の二次抗体を含む二次抗体溶液の100 μLをスライドに適用します。
- 室温で1時間インキュベートします。
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DAPI核染色と取り付け
- スライドを3回、それぞれ5分ずつ洗います。
- 各セクションに 100 μL の DAPI (1:3000) を 10 分間適用します。
- スライドにアンチフェード取り付け媒体(材料のテーブル)を適用し、ティッシュセクションの上にガラスカバースリップを置きます。スライドは一晩4°Cのままにしておきます。次の日にスライドをシールします。
- スライドは4°Cで保管し、取り付けから1週間以内に画像を保存します。
5. BDのイメージングと定量
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イメージング肝臓セクション
- イメージングの前に、ラボメンバーの助けを借りてサンプルの遺伝子型に目がくらむ。すべてのイメージング ファイルに、動物/サンプル番号以外の遺伝子型やその他の特定の識別情報がないことを確認します。
- 蛍光顕微鏡を使用して、各セクションの1倍ズームで20倍の画像を撮り、肝臓全体のすべてのPVが画像化されていることを確認します。左、中間、右、カウデートローブを含めます。
注:我々は通常、肝臓の大きさに応じて、動物あたり60-90ポータルの管を見つける。 - PVを同一視するには、αSMAとwsCK染色を探します。αSMA陽性であるがwsCK染色に欠けている構造は、ポータル構造ではない。
-
BD の識別とカウント
- 動物/サンプル番号、画像番号、PV数、および BD の数の列を含むスプレッドシートを作成します。
- 各イメージを調、「イメージあたりの PV 数を特定して記録します。.
- 定義可能な内膜を囲む胆管細胞(wsCK+)の存在によって、各画像の特許BDを識別する。構造体は、他のwsCK+細胞から間葉で分離する必要があります。
- 各特許BDをカウントし、画像番号と同じ列に配置します。
- PVで撮影した画像ごとにこれを行います。
- 肝臓サンプル内のすべての PV とすべての BD の合計を計算します。
- 肝臓サンプルのBD対PV比を計算します。
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Representative Results
我々は以前にJag1+/–動物、ALGS8のマウスモデルで胆汁欠損を文書化した。BDとPV比を決定するために、P30マウスの肝臓を切り離し、血管マーカーαSMAと共にCK8およびCK19(wsCK)のためにそれらを共染色した。その後、各肝葉のすべてのPVを画像化しました。図2Aに示すように、PVを隣接するwsCK染色(矢印)を持つαSMA染色容器として定義した。wsCKを含まないαSMA染色構造は中央静脈であり、分析(矢印)に含めるべきではありません。
PVが同定されると、その特徴的な形状で特許BDを同定した。図3に示すように、特許ダクトはwsCK+胆管に囲まれた明らかに定義可能な内包を有する。ダクトは通常、近くのダクトまたはコランゴサイトから間葉(矢印)によって分離されます。定義可能なルーメンを持たないwsCK+細胞は、隣接する細胞にアタッチされている、または単独で現れるが、BD(矢印)の総数に対してカウントされない。図3Aは、いくつかの未組み込み細胞と共に完全特許ダクトに関連するPVを有する野生型肝臓部を示す。図3Bは、P30 Jag1+/–動物由来の代表的な肝臓セクションである。このセクションの 3 つの PV の周囲に特許 BD は存在しません。すべての wsCK+ セルは組み込まれないため、カウントしないでください。この画像は、wsCK+細胞の有無がJag1+/-および野生型肝臓を区別しないため、慎重なBDカウントの重要性を強調しています。
図1Dで示されるように、BDとPV比の分析は、各PVの周りに存在する特許BDの総数と共に肝臓部のすべてのPVをカウントすることを含む。Jag1+/–肝臓を分析している間、我々は異なる葉がこれらの動物で必ずしも同じ程度に影響を受けないことに気づいた(未発表のデータ)。したがって、我々は通常、完全な肝臓のカバレッジを確保するために、左、中間、右およびカウデートの葉を横切ってPVをカウントします。PVとBDの合計の集計に続いて、セクション全体の比率が計算されます。
図4では、野生型3種とJag1+/動物3種のBD対PV比の分析を示した。このグラフは、2つのゲノム型がBDカウントに基づいて容易に区別される方法を示しています。さらに、この方法は、以前に報告された8として、遺伝子操作によるJag1+/–表現型の救助の程度を分析するための定量的尺度を提供する。
図1:実験過程の概略図。(A) 肝臓はマウスから全体を採取する。(B)肝臓サンプルは48時間固定され、脱水およびクリアされる。(C) 肝臓組織はパラフィンに埋め込まれている。セクションは作られ、荷を受けたスライドに置かれ、wsCKおよびαSMAのために染色される。(D) スライドをイメージし、PVとBDの数を記録します。BD対PV比(BD:PV)は、肝臓部全体について計算される。HA = 肝動脈;CV = 中央静脈。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:中央静脈と区別するPVs.(A) PVは、αSMA染色および周囲のwsCK+胆管(矢印)の存在によって同定される。(B)中枢静脈は、構造(矢印)の周囲に存在しないwsCK+胆管状を有するαSMA染色の存在によって同定される。(A 'とB' )それぞれAとBからのαSMAチャネルを示すグレースケール画像。スケールバー = 100 μm で、すべてのパネルに適用されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:特許証付き身分証明書の同定(A -A' P30野生型肝臓では、wsCK+胆管に囲まれた識別可能な内包体を持つ楕円体構造にラウンドを特許BD(矢印)としてカウントします。ルーメンを囲んでいない胆管細胞は組み込まれず、カウントされません(矢印)。(B-B')Jag1+/–肝臓では、胆管状細胞はまだ存在する(矢印)。しかし、ほとんどは特許BDに組み込まれなくて、スケールバー=100μmで、すべてのパネルに適用されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:P30マウス肝臓からPVグラフまでのBD。BD と PV が定量化され、BD と PV の比率が生成されます。以前に報告したように、Jag1+/–動物は、野生動物と比較してBD対PV比の特徴的かつ有意な減少を有する。 統計分析では、双方向t-testを実行した。 水平線は意味を示す。P<0.001.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスにおけるBDの発達と修復の解析は、胆嚢障害の病因およびメカニズムを研究する上で重要なツールである。さらに、新しい治療法の開発は、再生可能で好ましくは定量化可能な表現型の確立に部分的に依存する。マウスモデルにおける現在の表現型は、通常、血清化学、肝臓組織学および細胞型特異的マーカーの免疫染色を伴う。これらの技術は胆道系の構造と機能に関する貴重な情報を生成するが、それらは、特定の遺伝子操作がBDの数に及ぼす影響の直接的な尺度を提供しない。解剖病理学において、ヒト患者におけるBDの貧弱性は、生検セクション9におけるBD対PV比の分析を通じて決定される。臨床医は、ALGSおよび他の胆嚢疾患における胆嚢炎および肝疾患の重症度を決定するために血清化学分析を採用しているが、マウスモデルにおける組織学的評価は、両方の理解にとって重要であるBD開発に対する疾患修飾子の影響と、正常なダクト開発の回復に対する治療法の有効性これは、マウスが特許BDの数を大幅に減少させることができるが、依然として血清ビリルビンレベル8のわずかな増加しか示すものではなく、マウス肝臓の非常に効率的な胆汁排水に起因する可能性が高いためである。我々の前の研究は、Jag1ヘテロジゴシティがBD成熟を損なうが、チョランシオイテス8の不在ではないことを示している。 したがって、マウスモデルにおけるBD発症を分析し、疾患の重症度を評価するには、単に胆管炎の有無または存在を調べるだけでは十分ではない。この問題に対処するために、ここではマウス肝臓における特許BD番号を客観的に測定する簡単な方法を提示した。
我々の分析は、適切な固定とマウス肝臓の埋め込みに依存しています。肝臓は、あるサンプルから別のサンプルへの同様の断開を確実にするために、腹部側に埋め込まれています。これは最も安定した位置です。染色に使用されるセクションは、肝臓のヒラムに対して、周囲のBDの数とPVの大きさに違いがあるので、肝葉に十分に深くなければなりません。時折、縦方向に切り取られたPVを見かかります。これらの場合、通常、縦方向に切断され、長い開いているチューブのように見える隣接するBDがあります。再現性を確保するために、これらの長いチューブを単一のBDとしてカウントします。しかしながら、一部の胆道構造は内向きに見えるが、通常のBDs14に典型的に見られる楕円体形態へのラウンドを示さない。私たちの手の中では、これは時々1つの構造が調査員によってBDと呼ばれるが、別の同僚によって呼び出される可能性があります。したがって、データ分析とプレゼンテーションの一貫性と再現性を確保するために、特定のプロジェクトに関連するすべてのサンプルを2人の調査者が個別に分析することをお勧めします。
抗CK8は未熟で成熟した胆汁細胞をマークすることが示されているが、抗CK19は成熟した胆汁細胞12、20のみをマークする。従って、PVが成熟BDに関連していない場合でも、CK8+細胞の存在のために中枢静脈から容易に分化することができる。抗αSMAと組み合わせてこれら2つの抗体を使用すると、当社の定量におけるポータル管の完全なカバレッジを保証します。さらに、我々の手の中で、胆汁細胞の個々のCK19またはCK8染色は比較的弱いシグナルを生成し、いくつかのバックグラウンド染色に関連している。2つのCK抗体を混合すると、胆細胞において一貫して強いシグナルが生じ、定量が容易となる。
肝内胆樹の成熟は、ヒラーから末梢方向に起こり、生後21.実際、出生後の早期肝臓、特に末梢領域には、出生後の肝臓拡張の主要な前線に多くの未熟な胆管細胞がある。また、8歳を超える動物のBD数の変化を観察し、高齢動物ではダクトが多い。さらに、ポータル構造の中には複数の BD が含まれているものもあれば、特に肝臓周辺に沿ってダクトが 1 つまたは全く含まれているものもあります。我々は、各動物のすべての肝葉を覆う顕微鏡スライドを使用し、スライド全体にわたってBDとPV比を系統的に定量化する。これは必須ではありませんが、年齢や肝臓の大きさに関係なく、各動物に対して十分なポータル管が分析されることを保証します(遺伝子型と年齢に応じて肝臓あたり60〜90PV)。さらに、スライド上のすべてのPVを分析することにより、より成熟したヒラーと少ない成熟した周辺領域の両方が肝臓の発達のすべての段階でカウントされることを保証する。各動物のすべての肝葉をカバーすることは、特定の突然変異が肝臓全体で均一にBDの発達に影響を与えない場合、測定の変動性を減少させることができる。
この方法は、非組み込み胆汁細胞の群から小さな胆管を区別することに限定される。胆管4は、通常、これらの染色を分析するために使用する倍率の内気化構造として認識するには小さすぎる。したがって、それらは我々の定量から除外される可能性が高いので、この方法は中~大ダクトの同定に向かって歪んでいる。この制限にもかかわらず、ここで説明する方法はJag1+/–およびJag1+/+肝臓を容易に区別する。 さらに、Polgut1+//の1コピーの同時損失時のJag1+/–BDの部分的な救助と、Poglut1の条件付き損失を伴うJag1+/+動物のBD密度のささやかな増加を検出するのに十分敏感です。血管平滑筋細胞8.これらの観察は、BD数の変化が控えめな場合でも、様々な遺伝的背景におけるBD密度の変化を決定する際に、この方法の有用性を示す。
近年、胆樹の3D構造の可視化は、BD開発22、23、24、25を分析するためにいくつかのグループによって使用されている。これらのエレガントな方法は、インクまたは樹脂によって共通のBDから胆汁樹を充填することに依存し、したがって、胆道系の有性を調べる。さらに、肝臓が成長するにつれて胆樹の3D構造と肝臓周辺の形成に関する情報を提供し、ここで提示されたようなプロトコルで使用される2D評価では評価できない。しかし、これらの3Dビジュアライゼーション技術の成功したパフォーマンスは、かなりの専門知識を必要とします26.対照的に、ここで提示される技術はかなり簡単であり、組織学的およびイメージ投射分析のための日常的な装置へのアクセスを持つあらゆるグループによって実行することができる。さらに、wsCKおよびαSMAに対して二重染色されたセクションの分析はまた、肝臓8、27、28に管反応または血管平滑筋細胞異常が存在するかどうかを示す。我々は、肝臓セクション全体でBDとPV比を定量化することは、マウスの胆汁の発達の敏感で再現可能な尺度を提供することができ、研究者がより多くを考慮すべきかどうかを決定するのに役立つ比較的簡単な技術として役立つことを示唆する胆樹の3Dビジュアライゼーションのような洗練された技術。
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Disclosures
著者は利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、国立衛生研究所(NIH)(R01 GM084135およびR01 DK109982)、NIH P30 DK56338の下でテキサス医療センター消化器病センターからのパイロット/実現可能性賞、およびアラギル症候群アクセラレータ賞からの支援を認めます。医療財団
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
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