Summary
אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.
Abstract
העכבר משמש באופן נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מחלות המרה. כדי להעריך את התפתחות ותפקוד של מערכת המרה, טכניקות שונות משמשות, כולל סרום כימיה, ניתוח היסטולוגית, וכתמים חיסוני עבור סמנים ספציפיים. למרות טכניקות אלה יכול לספק מידע חשוב על מערכת המרה, הם לעתים קרובות לא מציגים תמונה מלאה של צינור המרה (BD) מומים התפתחותיים על פני הכבד כולו. זה חלק בשל היכולת האיתנה של כבד העכבר כדי לנקז את המרה אפילו בבעלי חיים עם ליקוי משמעותי בפיתוח המרה. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה כדי לחשב את המספר הממוצע של BDs המשויכים כל וריד הפורטל (PV) בסעיפים המכסים את כל האונות של עכברים מוטציה/טרנסגניים. בשיטה זו, כבדים מורכבים ומנות בצורה סטריאוטימית כדי להקל על השוואה בין גנוטיפים שונים ותנאים ניסיוניים. BDs מזוהים באמצעות מיקרוסקופ קל של מיקרוקרטין ויטראז ', ולאחר מכן נספר ומחולק על ידי המספר הכולל של PVs להציג באזור הכבד. לדוגמה, אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להבחין בבירור בין עכברים מסוג פראי לבין מודל עכבר של תסמונת אלאלאין. השיטה המוצגת כאן אינה יכולה להיות מחליפה לטכניקות המבראות את המבנה התלת-מימדי של עץ המרה. עם זאת, הוא מציע דרך קלה וישירה כדי לאמוד את פיתוח BD להעריך את מידת היווצרות התגובה ductular בעכברים.
Introduction
עץ המרה הוא חלק מכריע בכבד היונקים, ומאפשר למעבר המרה מהפטציטים לבטן. תעלות המרה בתוך הכבד (BDs) נוצרות על ידי המרה, אשר מבדילים בין הפוטנציאל הפוטנציאלי באמצעות חריץ וTGFβ איתות1,2. המפרט הנכון והמחויבות של המרה וההרכבה שלהם לתוך BDs בוגרת הם קריטיים לפיתוח עץ המרה הפנימי של הדלקת הכבד. כמו הכבד גדל במהלך הפיתוח או על התחדשות איברים, מערכת המרה צריך להתפתח לאורך הכבד כדי להבטיח ניקוז המרה תקין. יתר על כן, מספר מחלות syndromic ושאינם סינכדרומית התוצאה בפאולסיטי של BDs3. בנוסף, מספר מחלות הכבד חריפה וכרוניות להצמיח תגובות ductular כביכול בכבד, אשר מוגדרים כנוכחות של מספר משמעותי של תאים המבטאים סמנים המרה אך לא בהכרח נובעים תאי המרה או טופס פטנט BDs4. בתסמונת הפרעת המערכת הולטיסיסטים (algs), הפלוייתת של החריץ ליגjagged1 (JAG1) התוצאות במערך BD עני וכולאוסטזיס5,6. המעבדה שלנו הוכיחה לאחרונה כי שנוצר בעבר Jag1 heterozygous קו7 הוא מודל חיה של BD דלות ב algs8. במודל העכבר הזה של ALGS, האלאנגיוציטים עדיין נוכחים. עם זאת, הם נכשלים להתחייב להתאגדות לתוך בוגרת, פטנט BDs8. לכן, ניתוח של הכבד במודל של BD דלות דורש יותר מאשר נוכחות לכאורה או העדר המרה. חשוב להעריך במדויק את המידה שבה BDs בוגרים נמצאים בכבד.
בפתולוגיה אנאטומית, ישנן שיטות כמותיים מקובלות להערכת האם ה-BD דלות קיים9. לדוגמה, מחקרים על algs בחולים אנושיים לעתים קרובות לכמת את BD כדי וריד הפורטל (PV) יחס על ידי ניתוח לפחות 10 כלי הפורטל לכל כבד ביופסיה9,10. ניתוח של הצורה ואת הנוכחות הכללית או העדר פטנטים BDs, בשילוב עם כימיה סרום, יכול לספק מידע רב ערך על התפתחות BD בעכברים11,12,13. עם זאת, עכברים יכולים לאבד מספר משמעותי של BDs עם עלייה צנועה רק סרום בילירובין רמה8. לפיכך, שיטה כמותית המוערכת את מספר BDs הנוכחי לכל PV יכול לספק מידה ישירה יותר של המידה של BD דלות בעכברים. בדו ח האחרונות, אנו ככמת את מספר BDs לכל PV בכל האונות בכבד ודיווח ירידה משמעותית ביחס BD ל-PV ב Jag1 +/– בעלי חיים8. במהלך הניתוח שלנו, הבחנו כי למרות וריאציה משמעותית בדרגת תגובה דלקתית ותגובות ductular, BD ליחס PV לא להראות ההבדלים הרבה8. יתר על כן, הקוונפיקציה של BD ליחס PV מותר לנו להדגים כי הסרת עותק אחד של הגליסישיאז גן Poglut1 ב Jag1 +/– בעלי חיים יכולים לשפר באופן משמעותי את שלהם BD דלות8. ברקע Jag1 +/+ , אובדן מותנה של Poglut1 בתאי שריר וסקולריים החלקה תוצאות עלייה מתקדמת במספרי BD, אשר צנוע (20-30%) ב-P7 אבל הופך להיות בולט במבוגרים8. שוב, טכניקה זו אפשרה לנו להראות כי אפילו ב P7, הגידול בצפיפות BD בבעלי חיים אלה הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. של הערה, את צפיפות ה-BD מוגברת ב-גנוטיפ זה בגיל ארבעה חודשים היה מאומת באמצעות ניתוח שחקנים שרף גם. 8 תצפיות אלה ודוחות אחרים שנמדדו צפיפות BD במודלים algs עכבר שונים14,15 בקשה לנו לשלב את השיטה הזו לתוך האסטרטגיה הכוללת שלנו לנתח פגמים במרה במוטציות שונות ועכברים טרנסגניים.
כאן, אנו פירוט טכניקה פשוטה אשר ניתן להשתמש בה כדי לבחון את מידת ה-BD דלות בדגמי העכבר של מחלת הכבד (איור 1). בשיטה זו, שיתוף בשילוב עם סמנים הכולאנציט (CK) 8 ו CK19 (להלן הספקטרום הרחב CK, wsCK) משמש כדי להמחיש BDs ו המרה משולבת בכבד העכבר. נוגדן נגד אקטין שריר החלקה אלפא (αSMA) מתווסף לצביעת כלי התוויות. ניתוח שיטתי של BD ל-PV יחס בסעיף המכסה את כל האונות בכבד מבטיח כי מספר גדול של PVs מנותח עבור כל גנוטיפ. מאז השיטה שלנו מסתמך על ככמת BDs ו PVs ב-2D תמונות, זה לא מתאים ללמוד את ההשפעות של מוטציה נתונה על המבנה התלת-ממדי של עץ המרה או שלמות של תעלות המרה הקטן. עם זאת, הוא מספק אסטרטגיה פשוטה ואובייקטיבית עבור חוקרים להעריך את פיתוח המרה בעכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים שוכנו במתקן לבעלי חיים של המכשול בביילור קולג ' לרפואה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והנחיות וועדות שימוש בפרוטוקולים בעלי חיים מאושרים.
1. אוסף של רקמת הכבד של העכבר
-
הכנת העכבר לקציר הכבד
- המתת החסד של העכבר באמצעות isofלוריאן.
- לבצע נקע בצוואר הרחם של העכבר כדי להבטיח מוות.
- לעשות חתך רוחבי בערך סנטימטר אחד מתחת לכלוב הצלעות.
- לחשוף את כל המשטח. הגחוני של הכבד
-
אוסף של כבד העכבר
- בזהירות, עם מספריים קטנים, חותכים את הרצועות חיבור הכבד לאיברים אחרים בבטן.
- חותכים דרך BD המשותף כדי לנתק את הכבד מן המעי.
- בזהירות להסיר את הכבד על ידי החזקת על כיס המרה ומקום מיד בצינור 50 mL ממולא שלושה רבעים על-ידי 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית).
2. קיבוע והטבעה של הכבד בפרפין
-
קיבעון
- תקן את רקמת הכבד עבור 48 h ב 4% בכיוון הכלפי מע ב -4 ° c.
- שטוף את הרקמה עם 70% אטוח בשעה 4 ° c.
- רוחצים את הרקמה פעמיים עם 95% אטוח עבור 1 כל אחד ב -4 ° c.
- רוחצים את הרקמה פעמיים עם 100% אטוח עבור 1 כל אחד ב -4 ° c.
-
ניקוי
- לשטוף את רקמת הכבד עם ניקוי הסוכן (טבלת חומרים) שלוש פעמים עבור 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
הערה: הכבד צריך להרגיש נוקשה. לאחר השטיפה השלישית
- לשטוף את רקמת הכבד עם ניקוי הסוכן (טבלת חומרים) שלוש פעמים עבור 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
-
הטבעה של פרפין
- מניחים את הקלטת רקמה בתבנית רקמה בשעווה פרפין עבור 3 שוטף, 30 דקות כל אחד. יש לחמם את השעווה עד 60 ° c.
- ממלאים את עובש הרקמה עם פרפין שעווה לגובה שלושה רבעים ולשמור על בלוק חימום ב 60 ° c.
- הניחו את הכבד בעובש עם הצד הגחוני הפונה כלפי מעלה.
- הסר בזהירות את העובש מבלוק החימום.
- הניחו את החלק העליון של הקסטה על העובש והחלק העליון עם פרפין נוזלי חם.
- הניחו לעובש ולחסום להתקרר לטמפרטורת החדר בלילה.
הערה: בלוקי רקמות ניתן לאחסן כעת בטמפרטורת החדר.
3. רקמת כבד
-
הכנת בלוק למכירה
- מניחים את העובש על הקרח 5 דקות לפני הסרת בלוק מן העובש.
- מניחים את הבלוק על הקרח עם נייר רקמת המעבדה הנוכחי בין בלוק וקרח.
- לשמור על הבלוק על הקרח כאשר לא לשים את התוצאות לחתוך את הרקמה הטובה ביותר.
-
מחסומי את גושי הכבד
- באמצעות מיקרוטומה, התחילו בכך שאתם מתחילים לעבור דרך הצד השטחית והשטחי של הכבד. סעיפים אמורים להיות 5 μm.
- בדקו את החלקים השטוליות שמתחת למיקרוסקופ הניתוח כדי להבטיח שהמקטעים לא יקופאו מקופלים.
- קח חלק של הכבד הכולל את האונה מזונבת.
הערה: עבור בלוקים מסוימים, יהיה לך שמאל, המדיאלי, ימין ו מזונבת האונות על אותה פרוסה רקמה. - עבור אלה בלוקים שבו כל ארבע האונות אינם נמצאים באותה שקופית, להמשיך לחתוך עד האונות השמאלית, המדיאלי והזכות נמצאים באותה שקופית.
4. אימונוהיסטוכימיה עבור wsCK ו αSMA
-
עיבוד שקופיות עבור אימונוהיסטוכימיה
- בחר שקופית אחת לכל סוג גנוזה כדי לעבור ניתוח.
- לשטוף את השקופית עבור 15 דקות ב קסילין, 100% אטוח, 95% אטואה ולבסוף 70% אטוח (3 x 5 דקות בכל פתרון).
- שטוף את השקופית במשך 5 דקות בשעהשתיים.
- לטבול את השקופית בפתרון אחזור אנטיגן (מבוסס טריס, גבוהה pH).
- חום תחת לחץ בסיר לחץ עבור 3 דקות ב 10 psi.
- אפשר לשקופית להתקרר לטמפרטורת החדר (כ-35 דקות).
-
חסימת חתכי הרקמה
- באמצעות עט פאפ, יש לחלק את המקטעים בשקופית.
- החלת מלוחים מאגור פוספט (PBS) + 0.1% יצירת רצף כדי לכסות את המקטע פעמיים, 5 דקות כל אחד.
- הפוך את מאגר חסימת ידי ערבוב סרום עז רגיל (NGS) ב 1:50 ב-PBS + 0.3% טריטון. כדי להיות מספיק מאגר עבור חסימת ויישום הנוגדן העיקרי, 100 μL לסעיף מספיק.
- החל 100 μL של פתרון חסימה לכל מקטע.
- הגנה מפני השקופיות מכוסות בפתרון החסימה ב-4 ° c עבור 1 h.
-
צביעת עבור wsCK ו αSMA
- לדלל נגד CK8 ונגד CK19 נוגדנים16 (מחקרים התפתחותיים יפידים בנק, troma-I ו TROMA-III, בהתאמה) 1:20 במאגר חסימת לכתם עבור wsCK. לדלל את הנוגדן anti-αSMA17 (הטבלה של חומרים) כדי 1:200 באותו מאגר.
- החל 100 μL של פתרון הנוגדן מדולל המכיל את כל שלושת הנוגדנים לכל מקטע.
- מודיית את השקופיות מכוסה פתרון נוגדן ב 4 ° c לילה.
- שטוף את השקופיות עם PBS + 0.1% טריטון שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד.
- לדלל נוגדנים משניים (אנטי עכברוש-Alexa488 ונגד עכבר-Cy5) 1:200 ב-PBS + 0.3% טריטון.
- החל 100 μL של פתרון הנוגדן המשני המכיל את שני הנוגדנים המשניים לשקופיות.
- . בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות
-
כתמים והרכבה גרעיניים של DAPI
- שטוף את השקופיות 3 פעמים, 5 דקות לכל אחד.
- החל 100 μL של DAPI (1:3000) לכל מקטע עבור 10 דקות.
- החל מדיום הרכבה Antifade (טבלה של חומרים) לשקופיות ומניחים שמיכות זכוכית על גבי סעיפים הרקמה. השאירו את השקופיות ב -4 ° c בלילה. . תסגור את השקופיות למחרת
- אחסן את השקופיות ב-4 ° צ' ותמונה בתוך שבוע אחד של הרכבה.
5. דימות וקוונפיקציה של BDs
-
מקטעי בכבד הדמיה
- לפני הדמיה, לעוור את עצמך את גנוטיפ של המדגם עם עזרה של חבר במעבדה. ודא שכל קבצי ההדמיה אינם מסוג גנוטיפ או מידע מזהה ספציפי אחר, מלבד מספר בעל חיים/דוגמה.
- באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט, לקחת תמונות 20x בזום 1x של כל מקטע ולהבטיח כי כל PV על פני הכבד הוא התמונה. כלול את האונות השמאלית, המדיאלי, ימין, מזונבת.
הערה: אנחנו בדרך כלל מוצאים 60-90 הפורטל משתנה לכל חיה בהתאם לגודל של הכבד. - כדי לזהות את PVs, לחפש αSMA ועוד wsCK כתמים. מבנים שהם αSMA חיוביים אך חוסר כתמים wsCK אינם מבני הפורטל.
-
זיהוי וספירה של BDs
- צור גיליון אלקטרוני עם העמודות הבאות: בעלי חיים/מספר לדוגמה, מספר תמונה, מספר PVs ומספר BDs.
- מעבר לכל תמונה, מזהה ומקליט את מספר ה-PVs לכל תמונה.
- זיהוי BDs פטנטים בכל תמונה על ידי נוכחות של המרה (wsCK +) סביב לומן מהגדרה. מבנים צריכים להיות ברורים ומופרדים על ידי מזנכימה מתאים אחרים wsck +.
- הרוזן כל BD מפטנטים ומקום באותה עמודה כמו מספר התמונה.
- בצע פעולה זו עבור כל תמונה שצולמה ב-PV.
- לחשב את הסכום של כל PVs כל BDs בדגימת הכבד.
- חשב את היחס BD ל-PV עבור דגימת הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבר תועדו פגמים המרה ב Jag1 +/– בעלי חיים, מודל העכבר של algs8. כדי לקבוע את היחס BD ל-PV, שP30 מנות כבדי העכבר ומוכתמות במשותף עבור CK8 ו CK19 (wsCK) יחד עם סמן כלי הדם αSMA. לאחר מכן אנו מ, לאחר מכן את כל PVs כל האונות בכבד. כפי שמוצג באיור 2A, הגדרתי pvs כמו כלי αSMA-ויטראז ' בעלי כתמים wsCK סמוכים (ראשי חץ). המבנים הαSMA והמוכתמת ללא wsCK היו ורידים מרכזיים ואין לכלול אותם בניתוח (חץ).
לאחר שזוהו PVs, זיהינו BDs פטנט על ידי צורתם האופיינית. כפי שמוצג באיור 3, לצינוריות פטנטים יש לומן מובהק המוקף wsCK + הקולאנגיוציטים. תעלות האוורור מופרדות בדרך כלל מתעלות או המרה באמצעות מסנכילי (ראש חץ). wsCK + תאים שאין להם לומן מהגדרה, מחוברים לתאים סמוכים, או מופיעים בבידוד, אינם נספרים לקראת המספר הכולל של BDs (חיצים). איור 3A מראה מקטע פראי סוג הכבד עם PV המשויך צינור פטנט מלא יחד עם מספר תאים לא משולבים. איור 3B הוא מקטע הכבד נציג מ P30 Jag1 +/– בעל חיים. BDs פטנטים לא נמצאים סביב שלוש PVs בסעיף זה. כל התאים wsCK + אינם משולבים ולכן אין לספור. תמונה זו מדגישה את החשיבות של ספירת BD זהיר, כמו נוכחות או היעדרות של wsCK + תאים לא להבדיל Jag1 +/– ומסוג פראי.
כפי שמתואר באיור 1D, ניתוח של BD ל-PV יחס כרוך בספירת כל pv במקטע הכבד יחד עם המספר הכולל של BDs פטנט הנוכחי סביב כל PV. במהלך ניתוח Jag1 +/– כבדים, שמנו לב כי האונות השונות אינן מושפעות בהכרח באותה מידה בבעלי חיים אלה (נתונים שלא פורסמו). לכן, אנחנו בדרך כלל לספור pvs על פני השמאל, המדיאלי, ימין, מזונבת האונות כדי להבטיח כיסוי הכבד להשלים. בעקבות הטאבים של סך PVs ו-BDs, היחס מחושב עבור המקטע כולו.
באיור 4, הראנו את הניתוח של BD ליחס PV עבור 3 פראי סוג ו 3 Jag1 +/– בעלי חיים. הגרף הזה מראה כיצד שני הגנוטיפים יכולים להיות מכובדים בקלות בהתבסס על ספירות BD. בנוסף, שיטה זו מספקת מדד כמותי לניתוח מידת ההצלה של Jag1 +/- פנוטיפ על ידי מניפולציות גנטיות, כפי שדווח קודם לכן8.
איור 1: סכימטי של התהליך הניסיוני. (א) הכבד נקצרו בשלמותו מהעכבר. (ב) דגימות כבד מתוקנות 48 h, יבשים ומנוקה. (ג) רקמת הכבד מוטבע פרפין. מקטעים נעשים וממוקמים על שקופיות טעונה ומוכתם עבור wsCK ו αSMA. (ד) שקופיות מוקלטות, ומספר ה-pvs ו-BDs נרשמות. יחס BD ל-PV (BD: PV) מחושב עבור כל מקטע הכבד. HA = עורק הכבד; קורות חיים = וריד מרכזי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הבחנה בין ורידים מרכזיים מ PVs. (א) PV מזוהה על ידי נוכחות של αSMA כתמים והסביבה של wsCK + האלאנגיוציטים (ראשי חץ). (ב) הורידים המרכזיים מזוהים על ידי נוכחות של αSMA כתמים ללא wsCK + האלאנגיוציטים הנוכחי סביב המבנה (חץ). (A ' and B ') תמונות בגווני אפור המציגות את ערוצי αSMA מ-A ו-B, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 100 יקרומטר ומוחל על כל החלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי של BDs פטנט. (א-א) ב P30 כבדים מסוג פראי, אנו סופרים סביב למבנים אליפסואיד עם לומן שאפשר להבחין מוקפת wsCK + האליאנגיוציטים כפטנט BD (ראש חץ). הקולאנגיוציטים אשר אינם מקיפים לומן נחשבים לבלתי משולבים ואינם נספרים (חיצים). (B-B ') בשנת Jag1 +/– כבדים, הקולאנגיוציטים עדיין נוכחים (חיצים). עם זאת, רובם אינם משולבים פטנט BDs. סרגל סרגל = 100 יקרומטר ומוחל על כל הלוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: BD כדי PV גרף מ P30 כבדי העכבר. BDs ו PVs הם כימות ו BD ליחס PV נוצרת. כפי שדווח בעבר8, Jag1 +/– בעלי חיים יש ירידה מאפיין ומשמעותי ב BD ליחס PV לעומת חיות מסוג פראי. לניתוח סטטיסטי, בוצעה בחינה דו-סיטפית. . הקווים האופקיים מראים משמעות . פי< 0.001 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח של פיתוח BD ותיקון בעכברים הוא כלי חשוב בלימוד פתוגנזה ומנגנון של הפרעות כיס הולסטטי. בנוסף, התפתחות הטיפולים החדשים תלויה בקביעת הפנוטיפים ובהתאם לתהליך המדידה. פנוטיפ הנוכחי במודלים העכבר כרוך בדרך כלל סרום כימיה, היסטולוגיה בכבד וכתמים חיסוני עבור מסוג תא סמנים ספציפיים. למרות טכניקות אלה לייצר מידע חשוב על מבנה ותפקוד של מערכת המרה, הם לא מספקים מדד ישיר של ההשפעות של מניפולציה גנטית נתונה על מספר BDs. בפתולוגיה אנאטומית, BD דלות בחולים אנושיים נקבעת באמצעות ניתוח של BD כדי PV יחס בסעיף ביופסיה9. בעוד מטפלים להעסיק סרום כימיה ניתוח כדי לקבוע את חומרת מחלת כולאוסטזיס ומחלות כבד ב algs ומחלות כיס החולים אחרים18,19, הערכה היסטולוגית בדגמי העכבר הוא קריטי לשתי ההבנה ההשפעות של מכפילי מחלות על פיתוח BD ואת האפקטיביות של טיפולים על שחזור הפיתוח הרגיל צינור אוורור. זה חלק כי עכברים יכולים להיות ירידה חמורה במספר הפטנט BDs אבל עדיין להראות רק להגדיל צנוע ברמת סרום בילירובין רמה8, כנראה בשל ניקוז המרה יעיל מאוד בכבד העכבר. העבודה הקודמת שלנו הראו כי Jag1 הטרוגוזיטיות גורמת לפגיעה בהבשלה של BD, אבל לא העדר המרה של8. כך, כדי לנתח פיתוח BD ולהעריך את חומרת המחלה בדגמי העכבר, זה לא מספיק רק לבדוק את העדר או נוכחות של המרה. כדי לטפל בבעיה זו, כאן הצגנו שיטה פשוטה למדידה אובייקטיבית של מספרי BD של הפטנט בכבד העכבר.
הניתוח שלנו תלוי בקיבעון הנכון והטבעה של הכבד של העכבר. כבדים מוטבעים בצד השני עד כדי להבטיח הפחתה דומה ממדגם אחד למשנהו. . זו התנוחה היציבה ביותר הסעיפים המשמשים לצביעת חייב להיות עמוק מספיק באונות הכבד, כפי שיש הבדלים במספר BDs ובגודל PVs בפריפריה לעומת hilum של הכבד. לעתים אנו רואים PVs כי הם גזור longitudinally. במקרים אלה, יש בדרך כלל BD שכנים כי הוא גם גזור longitudinally ומופיע כמו צינור ארוך פתוח. כדי להבטיח הזדהות, אנו סופרים אלה שפופרות ארוכות כמו BD אחד. זיהוי של BDs פטנט הוא חד משמעי לרוב החלק. עם זאת, מבנים מסוימים המרה מופיעים אך לא להראות את הסיבוב לתוך מורפולוגיה אליפסואיד בדרך כלל לראות באופן נורמלי BDs14. בידינו, זה יכול לפעמים לגרום למבנה אחד נקרא BD על ידי חוקר, אבל לא על ידי עמית אחר. לכן, על מנת להבטיח עקביות והמחשה בניתוח נתונים ומצגת, אנו ממליצים כי כל הדגימות הקשורות לפרויקט מסוים להיות מנותח על ידי שני חוקרים באופן עצמאי.
Anti-CK8 הוכח לסמן תאים בוגרים בוגרת המרה, בעוד anti-CK19 רק לסמן תאים המרה12,20. לכן, גם אם PV אינו משויך ל-BD בוגר, ניתן להבדיל בקלות מתוך ורידים מרכזיים בשל נוכחותם של CK8 + תאים. שימוש בשני נוגדנים אלה בשילוב עם anti-αSMA מבטיח כיסוי מלא של שדות הפורטל בקוונפיקציה שלנו. יתר על כן, בידינו, CK19 הפרט או CK8 כתמים של התאים המרה יוצר אות חלשה יחסית והוא משויך כמה כתמים ברקע. ערבוב שני נוגדנים CK התוצאות באות חזק בעקביות בתאי המרה ולכן מקלה על כימות.
התבגרות של עץ המרה בתוך הכבד מתרחשת בכיוון hilar-אל-היקפי וממשיך postnatally21. ואכן, יש הרבה יותר בלתי מפותחים המרה בכבדים לידתיים מוקדם, במיוחד באזורים היקפיים, אשר נמצאים בחזית המובילה של הרחבת הכבד לאחר הלידה. כמו-כן, הבחנו בשינוי במספרי ה-BD כבעלי החיים גיל8, עם תעלות נוספות בבעלי חיים מבוגרים יותר. בנוסף, חלק ממבני הפורטל מכילים BDs מרובים בעוד שלאחרים יש צינור אחד או לא, במיוחד לאורך הפריפריה של הכבד. אנו משתמשים שקופית מיקרוסקופ המכסה את כל האונות הכבד עבור כל חיה באופן שיטתי מכמת את BD כדי PV יחס לאורך השקופית כולה. אמנם זה לא חיוני, זה מבטיח כי בשפע הפורטל מנותח עבור כל חיה ללא קשר לגיל וגודל הכבד (60-90 PVs לכבד בהתאם גנוטיפ וגיל). יתר על כן, על ידי ניתוח כל pvs על השקופית, אנו מבטיחים הרבה יותר וגדלות בוגרים ופחות אזורי היקפי בוגרים נספרים בכל שלבי התפתחות הכבד. כיסוי כל האונות הכבד עבור כל חיה יכול גם להקטין את השונות במדידות אם מוטציה נתונה אינו משפיע על התפתחות BD אחיד על פני הכבד.
השיטה מוגבלת בהבחנה התעלות המרה קטנות יותר מקבוצות של תאי המרה משולבים. המרה4 הם בדרך כלל קטנים מדי כדי להיות מזוהה כמבנה לומייזציה בהגדלה שאנו משתמשים כדי לנתח את הסטטינוגים האלה. לכן, סביר להניח שהם לא יוצאו מהקוונטים שלנו, ולכן השיטה מוטה לקראת זיהוי מדיום לצינורות גדולים. למרות מגבלה זו, השיטה המתוארת כאן מבדילה בקלות בין Jag1 +/- ו Jag1 +/+ כבדים. יתר על כן, הוא רגיש מספיק כדי לזהות את החילוץ החלקי של Jag1 +/- BD דלות על אובדן סימולטני של עותק אחד של Polgut1 +/– ואת העלייה צנוע בצפיפות BD ב Jag1 +/+ בעלי חיים עם אובדן מותנה של Poglut1 בתאי שריר וסקולריים חלק8. תצפיות אלה מציינות את התועלת של שיטה זו בקביעת שינויים בצפיפות BD ברקעים גנטיים שונים, גם כאשר השינויים במספר BD הם צנועים.
בשנים האחרונות, הדמיה של מבנה 3d של עץ המרה השתמשו על ידי כמה קבוצות לנתח את הפיתוח BD22,23,24,25. שיטות אלגנטיות אלה מסתמכות על מילוי עץ המרה מתוך ה-BD המשותף על-ידי דיו או שרף, ולכן בודקים את הפטנטיות של מערכת המרה. יתר על כן, הם מספקים מידע על המבנה התלת-ממדי של עץ המרה ואת היווצרות בפריפריה הכבד כמו הכבד גדל, אשר לא ניתן להעריך על ידי הערכה 2D המשמש פרוטוקולים כמו זה הציג כאן. עם זאת, ביצועים מוצלחים של טכניקות ההדמיה התלת-ממדית הללו דורשות מומחיות ניכרת26. לעומת זאת, הטכניקה המוצגת כאן היא פשוטה למדי והיא יכולה להתבצע על ידי כל קבוצה עם גישה לציוד שגרתי עבור ניתוח היסטולוגית ודימות. יתר על כן, ניתוח של סעיפים מוכתם כפול עבור wsck ו αSMA גם להראות אם התגובות ductular או וסקולרית חלקה שריר התא ליקויים קיימים בכבד8,27,28. אנו ממליצים כי כימות היחס BD כדי PV בסעיפים כל הכבד יכול לספק מידה רגיש ומחודש של פיתוח המרה בעכברים והוא יכול לשמש טכניקה קלה יחסית כדי לעזור החוקרים להחליט אם הם צריכים לשקול יותר טכניקות מתוחכמות כמו הדמיה 3D של עץ המרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01 GM084135 ו R01 DK109982), פרס פיילוט/היתכנות ממרכז הרפואי של טקסס מרכז מחלת העיכול תחת NIH P30 DK56338, ופרס מאיץ של תסמונת אלג'אין . הקרן הרפואית
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
