Summary
Vi presenterer en ganske enkel og følsom metode for nøyaktig kvantifisering av galle duct tetthet i musen leveren. Denne metoden kan hjelpe til med å bestemme effekten av genetiske og miljømessige bestemmelsesord og effektiviteten av potensielle terapier i musemodeller av galle sykdommer.
Abstract
Mus er bredt brukt som en modell organisme for å studere galle sykdommer. For å evaluere utviklingen og funksjonen til galle systemet, brukes forskjellige teknikker, inkludert serum kjemi, histologiske analyse og immunostaining for spesifikke markører. Selv om disse teknikkene kan gi viktig informasjon om galle systemet, de ofte ikke presentere et fullstendig bilde av galle duct (BD) utviklingsmessige defekter over hele leveren. Dette er delvis på grunn av den robuste evne til musen leveren å drenere galle selv i dyr med betydelig svekkelse i galle utvikling. Her presenterer vi en enkel metode for å beregne gjennomsnittlig antall BDs knyttet til hver Portal vene (PV) i seksjoner som dekker alle fliker av mutant/transgene mus. I denne metoden er lever montert og delt på en stereotypic måte for å lette sammenligningen mellom ulike genotyper og eksperimentelle forhold. BDs er identifisert via lys mikroskopi av cytokeratin-beiset cholangiocytes, og deretter telles og delt av det totale antall PVs til stede i leveren delen. Som et eksempel, viser vi hvordan denne metoden kan tydelig skille mellom vill-type mus og en mus modell av Alagille syndrom. Metoden som presenteres her kan ikke erstatte teknikker som visualiserer den tredimensjonale strukturen i galle treet. Imidlertid, den tilbyder en lett og direkte vei å kvantitativt vurdere BD utviklingen og graden av ductular reaksjonen formasjon inne mus.
Introduction
Galle treet er en kritisk del av pattedyr leveren, slik at passering av galle fra hepatocytter inn i tarmen. Intrahepatic galle kanaler (BDS) er dannet av cholangiocytes, som skiller fra bipotential hepatoblasts gjennom hakk og TGFβ signal1,2. Riktig spesifikasjon og engasjement for cholangiocytes og deres montering i modne BDs er avgjørende for utviklingen av intrahepatic galle tre. Som leveren vokser under utvikling eller på orgel regenerering, galle systemet må utvikle seg langs leveren for å sikre riktig galle drenering. Videre, en rekke syndromisk og ikke-syndromisk sykdommer resulterer i mangelen av intrahepatic BDs3. I tillegg, en rekke akutte og kroniske leversykdommer gir opphav til såkalte ductular reaksjoner i leveren, som er definert som tilstedeværelsen av et betydelig antall celler som uttrykker galle markører, men ikke nødvendigvis oppstår fra galle celler eller form patent BDs4. I multisystem Disorder Alagille syndrom (ALGS), haploinsufficiency av hakk ligand jagged1 (JAG1) resulterer i dårlig BD formasjon og kolestase5,6. Laboratoriet vårt har nylig vist at en tidligere generert Jag1 heterozygot muse linje7 er en dyremodell av BD-mangelen i ALGS8. I denne muse modellen av ALGS, cholangiocytes er fortsatt til stede. Men de unnlater å forplikte seg til innlemmelse i modne, patent BDs8. Derfor krever analyse av leveren i en modell av BD mangelen mer enn den tilsynelatende tilstedeværelsen eller fravær av cholangiocytes. Det er viktig å nøyaktig vurdere i hvilken grad eldre BDs er til stede i leveren.
I anatomiske patologi er det akseptert kvantitative metoder for å vurdere om BD mangelen finnes9. For eksempel, studier på ALGS i Human pasienter ofte kvantifisere BD til Portal vene (PV) ratio ved å analysere minst 10 Portal fartøy per lever biopsi9,10. Analyse av formen og generell tilstedeværelse eller fravær av patent BDS, kombinert med serum kjemi, kan gi verdifull informasjon om BD utvikling i mus11,12,13. Mus kan imidlertid miste et betydelig antall BDs med bare en beskjeden økning i serum bilirubin nivå8. Følgelig kan en kvantitativ metode som evaluerer antall BD-er til stede per PV, gi et mer direkte mål på graden av BD-mangelen hos mus. I en fersk rapport, kvantifisert vi antall BDs per PV over alle lever fliker og rapporterte en betydelig nedgang i BD til PV ratio i Jag1 +/- dyr8. I løpet av vår analyse, la vi merke til at til tross for betydelig variasjon i graden av inflammatorisk respons og ductular reaksjoner, ikke BD til PV ratio viser ikke mye variasjon8. Dessuten, kvantifisering av det BD å PV forhold innrømmet oss å demonstrere det fjerner ettall avskrift av det glycosyltransferase gen Poglut1 inne Jag1 +/– dyrene kanne viktig gjøre bedre deres BD mangelen8. I en Jag1 +/+ bakgrunn, betinget tap av Poglut1 i vaskulære glatte muskelceller resulterer i en progressiv økning i BD tall, som er beskjeden (20-30%) på P7, men blir fremtredende i voksne8. Igjen, denne teknikken tillot oss å vise at selv på P7, økningen i BD-tettheten i disse dyrene er statistisk signifikant. Av note, det forhøyet BD tettheten i denne genotype for fire måneder av alderen var godkjent igjennom harpiks kast analyse likeledes. 8 disse observasjonene og andre rapporter som målte BD tetthet i forskjellige ALGS mus modeller14,15 bedt oss om å innlemme denne metoden i vår overordnede strategi for å analysere galle defekter i ulike mutant og transgene mus.
Her detalj vi en grei teknikk som kan brukes til å undersøke graden av BD mangelen i musemodeller av leversykdom (figur 1). I denne metoden, co-farging med cholangiocyte markører cytokeratin (CK) 8 og CK19 (heretter bredspektret CK, wsCK) brukes til å visualisere BDs og kommunefritt cholangiocytes i musen leveren. Et antistoff mot Alpha-glatt muskel utgangen (αSMA) legges til farging for å merke fartøy. Systematisk analyse av BD til PV ratio i en seksjon som dekker alle lever fliker sikrer at et stort antall PVs er analysert for hver genotype. Siden vår metode er avhengig av kvantifisere BDs og PVs i 2D-bilder, er det ikke egnet for å studere virkningene av en gitt mutasjon på 3D-strukturen i galle treet eller integriteten til de små gallekanalene. Likevel, det gir en enkel og objektiv strategi for undersøkere å vurdere galle utvikling i musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene var huset inne en barriere dyr letter for Baylor universitet av medisin per institusjonell dyr bekymre og bruk komité retningslinjene og under anerkjent dyr protokoller.
1. samling av mus Liver vev
-
Utarbeidelse av mus for lever innhøsting
- Euthanize musa ved hjelp av isoflurane.
- Utfør cervical forvridning av musen for å sikre døden.
- Lag en tverrgående snitt omtrent en tomme under rib bur.
- Utsett hele ventrale overflaten av leveren.
-
Innsamling av musen leveren
- Forsiktig, med liten saks, skjære gjennom leddbånd forbinder leveren til andre organer i magen.
- Skjær gjennom felles BD å løsne leveren fra tarmen.
- Forsiktig fjerne leveren ved å holde på galleblæren og umiddelbart plassere i en 50 mL rør fylt til tre fjerdedeler med 4% paraformaldehyde (PFA).
2. fiksering og innebygging av leveren i parafin
-
Fiksering
- Fest leveren vev for 48 h i 4% PFA ved 4 ° c.
- Vask vevet med 70% EtOH for 1 t ved 4 ° c.
- Vask vevet to ganger med 95% EtOH for 1 time hver ved 4 ° c.
- Vask vevet to ganger med 100% EtOH for 1 time hver ved 4 ° c.
-
Fjerne
- Vask leveren vev med clearing agent (tabell av materialer) tre ganger i 30 min hver ved romtemperatur.
Merk: Leveren skal føle seg stiv etter den tredje vask.
- Vask leveren vev med clearing agent (tabell av materialer) tre ganger i 30 min hver ved romtemperatur.
-
Innebygging i parafin
- Plasser vevet kassetten i et vev mold i parafin voks for 3 vasker, 30 min hver. Voks bør forvarmet til 60 ° c.
- Fyll vevet mold med parafin voks til tre fjerdedeler høyde og holde på en varme blokk ved 60 ° c.
- Plasser leveren i mold med ventrale siden vendt opp.
- Forsiktig fjerne mold fra varme blokken.
- Plasser toppen av kassetten på mold og topp av med varm flytende parafin.
- La mold og blokk avkjøles til romtemperatur over natten.
Merk: Vev blokker kan nå oppbevares ved romtemperatur.
3. snitting av leveren vev
-
Utarbeidelse av blokken for snitting
- Plasser mold på isen i 5 min før du fjerner blokken fra mold.
- Plasser blokken på isen med et laboratorie papir til stede mellom blokk og is.
- Hold blokken på isen når du ikke snitting for beste vev kutting resultater.
-
Snitting av lever blokkene
- Bruk en mikrotomen til å begynne med å skjære gjennom den overfladiske, rygg-siden i leveren. Seksjoner skal være 5 μm.
- Kontroller de overfladiske delene under et disseksjon mikroskop for å sikre at delene ikke skåret eller brettes.
- Ta en del av leveren som inkluderer nucleus caudatus flik.
Merk: For noen blokker, vil du ha den venstre, midtre, høyre og nucleus caudatus fliker på samme vev skive. - For de blokkene der alle fire fliker ikke er til stede på samme lysbilde, fortsetter å skjære til venstre, midtre og høyre fliker er til stede på samme lysbilde.
4. immunhistokjemi for wsCK og αSMA
-
Behandling av lysbilder for immunhistokjemi
- Velg ett lysbilde per genotype som skal analyseres.
- Vask lysbildet i 15 minutter i xylen, 100% EtOH, 95% EtOH og til slutt 70% EtOH (3 x 5 min i hver løsning).
- Vask raset i 5 minutter i deionisert H2O.
- Dypp raset i antigen henting løsning (Tris-basert, høy pH).
- Heat under press i en trykkoker for 3 min ved 10 psi.
- La lysbildet avkjøles til romtemperatur (ca. 35 min.).
-
Blokkering av vevs deler
- Bruk en PAP-penn til å skissere inndelingene på lysbildet.
- Påfør fosfat-bufret saltvann (PBS) + 0,1% mellom for å dekke delen to ganger, 5 min hver.
- Gjør blokkerende buffer ved å blande normal Goat serum (NGS) på 1:50 i PBS + 0,3% Triton. For å få nok buffer til både blokkering og primær antistoff anvendelse, er 100 μL per seksjon tilstrekkelig.
- Påfør 100 μL av blokkerings løsning per seksjon.
- Ruge lysbildene dekket med blokkerings løsningen ved 4 ° c i 1 time.
-
Farging for wsCK og αSMA
- Fortynne anti-CK8 og anti-CK19 antistoffer16 (utviklingsstudier Hybridoma bank, TROMA-I og TROMA-III, henholdsvis) 1:20 i blokkering buffer for å flekken for wsCK. Fortynne anti-αSMA antistoff17 (tabell av materialer) til 1:200 i samme buffer.
- Påfør 100 μL av den fortynnede antistoff oppløsningen som inneholder alle tre antistoffer til hver seksjon.
- Ruge lysbildene dekket med antistoff oppløsningen ved 4 ° c over natten.
- Vask lysbildene med PBS + 0,1% Triton tre ganger, 5 min hver.
- Fortynne sekundære antistoffer (anti-Rat-Alexa488 og anti-Mouse-Cy5) 1:200 i PBS + 0,3% Triton.
- Påfør 100 μL av sekundær antistoff løsning som inneholder både sekundære antistoffer til lysbildene.
- Ruge ved romtemperatur i 1 time.
-
DAPI kjernefysisk farging og montering
- Vask lysbildene tre ganger, 5 min hver.
- Påfør 100 μL av DAPI (1:3000) til hver seksjon i 10 min.
- Påfør Antifade montering medium (tabell av materialer) til lysbildene og Plasser et glass dekkglass på toppen av vevet seksjoner. La lysbildene ved 4 ° c over natten. Forsegle lysbildene neste dag.
- Oppbevar lysbildene ved 4 ° c og bilde innen 1 uke etter monteringen.
5. bildebehandling og kvantifisering av BDs
-
Imaging lever seksjoner
- Før bildebehandling, blind deg til genotype av prøven med hjelp fra et laboratorium medlem. Sikre alle tenkelig fil-størrelse er blottet for genotype eller annet spesifikk identifisering beskjed for resten en dyr/eksemplar antallet.
- Ved hjelp av et fluorescerende mikroskop, ta 20x bilder ved 1x zoom av hver seksjon og sikre at hver PV over leveren er avbildet. Inkluder venstre, midtre, høyre og nucleus caudatus fliker.
Merk: Vi vanligvis finner 60-90 Portal traktater per dyr avhengig av størrelsen på leveren. - Å sammenfalle det PVs, kikke etter αSMA addisjonstegn wsCK flekk. Strukturer som er αSMA positive, men mangler wsCK farging er ikke Portal strukturer.
-
Identifisering og opptelling av BDs
- Opprett et regneark med følgende kolonner: dyr/eksempel nummer, bilde nummer, antall PVs og antall BD-er.
- Gå gjennom hvert bilde, identifisere og registrere antall PVs per bilde.
- Identifiser patent BDs i hvert bilde ved tilstedeværelsen av cholangiocytes (wsCK +) rundt en definerbare lumen. Strukturer burde være adskilt og adskilt av mesenchyme fra annet wsCK + celler.
- Telle hver patent BD og plasser i samme kolonne som bilde nummer.
- Gjør dette for hvert bilde tatt av en PV.
- Beregn summen av alle PVs og alle BDs i leveren prøven.
- Beregn BD til PV ratio for leveren prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere dokumentert galle defekter i Jag1 +/- dyr, en mus modell av ALGS8. Å avgjøre det BD å PV forhold, vi delt P30 musen lever og tilpasse-flekkete seg for CK8 og CK19 (wsCK) jevnsides med det vaskulær Farm land αSMA. Vi så avbildet alle PVs i hver av leveren fliker. Som vist i figur 2a, definerte vi PVS som αSMA-flekket fartøy som har tilstøtende wsCK farging (pilspisser). Den αSMA-farget strukturer uten wsCK var sentrale årer og bør ikke inkluderes i analysen (arrow).
Når PVs ble identifisert, identifiserte vi patent BDs av deres karakteristiske form. Som vist i Figur 3, har patent kanaler en klart definerbare lumen som er omgitt av wsCK + cholangiocytes. Kanalene er vanligvis adskilt fra nærliggende kanaler eller cholangiocytes av mesenchyme (pilspissen). wsCK + celler som ikke har en definerbare lumen, er festet til tilstøtende celler, eller vises i isolasjon, telles ikke mot det totale antall BDs (piler). Figur 3a viser en vill-type lever seksjon med en PV som er forbundet med en fullt patent kanal sammen med flere næringsdrivende celler. Figur 3b er en representativ lever seksjon fra en P30 Jag1 +/– Animal. Ingen patent BDs er tilstede rundt de tre PVs i denne delen. Alle wsCK + celler er kommunefritt og derfor bør ikke telles. Denne image høydepunkt betydningen av forsiktig BD opptellingen, idet tilstedeværelse eller fravær av wsCK + celler er ikke skille ut det Jag1 +/– og vill-type lever.
Som demonstrert i figur 1d, analyse av BD til PV ratio innebærer å TELLE hver PV i leveren delen sammen med det totale antall patenter BDS stede rundt hver PV. Mens analysere Jag1 +/- lever, la vi merke til at ulike fliker er ikke nødvendigvis berørt i samme grad i disse dyrene (upubliserte data). Derfor vi vanligvis teller PVs over venstre, midtre, høyre og nucleus caudatus fliker for å sikre fullstendig lever dekning. Etter tabulering av total PVs og BDs, er forholdet beregnet for hele seksjonen.
I Figur 4, viste vi ANALYSEN av BD til PV prosenter for 3 vill-type og 3 Jag1 +/- dyr. Denne grafen viser hvordan de to genotyper kan lett skilles basert på BD teller. I tillegg gir denne metoden en kvantitativ mål for analyse av graden av redning av Jag1 +/– fenotype av genetiske manipulasjoner, som rapportert tidligere8.
Figur 1: skjematisk av den eksperimentelle prosessen. (A) leveren høstes hele fra musen. (B) leverprøver er løst for 48 h, dehydrert og ryddet. (C) lever vevet er innebygd i parafin. Seksjoner er laget og plassert på ladet lysbilder og beiset for wsCK og αSMA. (D) lysbildene er avbildet, og antall PVS og BDS er registrert. BD til PV-forhold (BD: PV) beregnes for hele lever delen. HA = lever arterie; CV = sentral vene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skille sentrale årer fra PVs. (A) en PV identifiseres av tilstedeværelsen av αSMA farging og omkringliggende wsCK + cholangiocytes (pilspisser). (B) sentrale årer er identifisert ved tilstedeværelsen av αSMA farging uten wsCK + cholangiocytes tilstede rundt strukturen (arrow). (A ' og B ') Gråtonebilder som viser αSMA-kanaler fra henholdsvis A og B. Scale bar = 100 μm og gjelder for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: identifisering av patent BDS. (a-a) I P30 Wild-type lever, teller vi rundt til ellipsoiden strukturer med en merkes lumen omgitt av wsCK + cholangiocytes som et patent BD (pil spiss). Cholangiocytes som ikke omgir en lumen er ansett som kommunefritt og telles ikke (piler). (b-b) I Jag1 +/– lever, cholangiocytes er fortsatt til stede (piler). De fleste er imidlertid ikke innlemmet i patent BDs. Scale bar = 100 μm og gjelder for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: BD til PV Graph fra P30 mus lever. BDs og PVs er kvantifisert, og BD til PV-forholdet genereres. Som rapportert tidligere8, Jag1 +/- dyr har en karakteristisk og betydelig NEDGANG i BD til PV ratio sammenlignet med vill-type dyr. For statistisk analyse ble toveis t-test utført. Horisontale linjer viser midler. P< 0.001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse av BD utvikling og reparasjon hos mus er et viktig redskap for å studere patogenesen og mekanismen av kolestatisk lidelser. I tillegg er utvikling av nye terapier delvis avhengig av å etablere en reproduserbar og fortrinnsvis målbare fenotype. Nåværende bestemmelse av fenotype i musemodeller innebærer vanligvis serum kjemi, leveren histologi og immunostaining for celle-type spesifikke markører. Selv om disse teknikkene genererer verdifull informasjon om strukturen og funksjonen til galle systemet, gir de ikke et direkte mål på virkningene av en gitt genetisk manipulering av antall BD-er. I anatomiske patologi bestemmes BD-mangelen hos mennesker gjennom analysen av BD-til-PV-forholdet i en biopsi seksjon9. Mens klinikere ansetter serum kjemi analyse for å fastslå alvorlighetsgraden av kolestase og leversykdom i ALGS og andre kolestatisk sykdommer18,19, histologiske vurdering i musemodeller er avgjørende for både å forstå virkningene av sykdommen bestemmelsesord på BD utvikling og effektiviteten av terapier på å gjenopprette normal kanal utvikling. Dette er delvis fordi mus kan ha en alvorlig nedgang i antall patent BDs men fortsatt viser bare en beskjeden økning i serum bilirubin nivå8, sannsynligvis på grunn av den svært effektive galle drenering i musen leveren. Vårt tidligere arbeid har vist at Jag1 heterozygosity resulterer i nedsatt BD modning, men ikke fraværet av cholangcioytes8. Derfor, for å analysere BD utvikling og vurdere alvorlighetsgraden av sykdom i musemodeller, er det ikke tilstrekkelig å bare undersøke fraværet eller tilstedeværelsen av cholangiocytes. For å løse dette problemet, her har vi presentert en enkel metode for objektiv måling av patent BD tall i musen leveren.
Vår analyse er avhengig av riktig fiksering og innebygging av musen leveren. Lever er innebygd ventrale side opp for å sikre lik snitting fra en prøve til en annen. Dette er den mest stabile posisjon. Avsnittene som brukes til farging må være dypt nok i leveren fliker, som det er forskjeller i antall BDs og størrelsen på PVs i periferien versus hilum av leveren. Vi ser av og til PVs som er kuttet lengderetningen. I slike tilfeller er det vanligvis en nærliggende BD som også er kuttet lengderetningen og fremstår som en lang åpen tube. For å sikre reproduserbarhet, teller vi disse lange rørene som en enkelt BD. identifisering av patent BDs er entydig for det meste. Men noen galle konstruksjoner synes lumenized, men viser ikke runden til ellipsoiden morfologi vanligvis sett i normale BDs14. I våre hender, kan dette noen ganger resultere i en struktur som kalles en BD av en etterforsker, men ikke av en annen kollega. For å sikre konsekvens og reproduserbarhet i dataanalyse og presentasjon, anbefaler vi derfor at alle prøver som er relatert til et bestemt prosjekt, analyseres av to etterforskere uavhengig av hverandre.
Anti-CK8 har vist å markere umodne og modne galle celler, mens anti-CK19 bare merker modne galle celler12,20. Derfor, selv om en PV ikke er forbundet med en eldre BD, kan det være lett differensiert fra sentrale årer på grunn av tilstedeværelsen av CK8 + celler. Bruk av disse to Antistoffene i kombinasjon med anti-αSMA sikrer fullstendig dekning av Portal traktater i vår kvantifisering. Videre, i våre hender, genererer den enkelte CK19 eller CK8 farging av galle celler et relativt svakt signal og er forbundet med noen bakgrunns farging. Å blande de to CK-Antistoffene resulterer i et gjennomgående sterkt signal i galle celler og forenkler derfor kvantifisering.
Modning av intrahepatic galle tre oppstår i en lymfekjertler-til-perifer retning og fortsetter fødselen21. Faktisk er det mange flere umodne cholangiocytes i tidlig postnatal lever, spesielt i perifere områder, som er på den ledende fronten av postnatal leveren ekspansjon. Videre observerte vi en endring i BD-tall som dyrene alderen8, med flere kanaler i eldre dyr. I tillegg inneholder noen Portal strukturer flere BDs, mens andre har én eller ingen kanaler, spesielt langs leveren periferi. Vi bruker en mikroskopi lysbilde som dekker alle lever fliker for hvert dyr og systematisk kvantifisere BD til PV ratio over hele lysbildet. Selv om dette ikke er avgjørende, sikrer det at rikelig Portal traktater er analysert for hvert dyr uavhengig av alder og lever størrelse (60-90 PVs per lever avhengig av genotype og alder). Videre, ved å analysere alle PVs på lysbildet, sørger vi for at både mer modne lymfekjertler og mindre modne perifere områder telles på alle stadier av lever utvikling. Dekker alle lever fliker for hvert dyr kan også redusere variasjon i målinger hvis en gitt mutasjon ikke påvirker BD utvikling jevnt over leveren.
Metoden er begrenset i å skille mindre galle kanaler fra grupper av næringsdrivende galle celler. Galle ductules4 er vanligvis for små til å bli anerkjent som en lumenized struktur i forstørrelsen som vi bruker til å analysere disse farging. Derfor vil de trolig bli ekskludert fra vår quantifications, og dermed metoden er skjev mot å identifisere mellom store og store kanaler. Til tross for denne begrensningen, metoden beskrevet her lett skiller mellom Jag1 +/- og Jag1 +/+ lever. Dessuten, det er en følsom nok å merker det delvis hjelpe av det Jag1 +/– BD mangelen på samtidig forlis av ettall avskrift av Polgut1 +/– og det beskjeden forhøye inne BD tettheten inne Jag1 +/+ dyrene med betinget forlis av Poglut1 i vaskulære glatte muskelceller8. Disse observasjonene tyder på denne metoden er nytten i å bestemme endringer i BD-tettheten i ulike genetiske bakgrunner, selv når endringene i BD-nummeret er beskjedne.
I de senere årene har visualisering av 3D-strukturen i galle treet blitt brukt av flere grupper for å analysere BD utvikling22,23,24,25. Disse elegante metodene er avhengige av å fylle galle treet fra den vanlige BD-en med blekk eller harpiks, og derfor undersøke patency i galle systemet. Videre gir de informasjon om 3D strukturen i galle treet og dens dannelse i leveren periferien som leveren vokser, som ikke kan vurderes av 2D-vurdering som brukes i protokoller som den som presenteres her. Imidlertid krever vellykket ytelse av disse 3D visualisering teknikker betydelig ekspertise26. I kontrast, teknikken som presenteres her er ganske grei og kan utføres av en hvilken som helst gruppe med tilgang til rutinemessig utstyr for histologiske og Imaging analyse. Videre analyse av seksjonene dobbelt-farget for wsCK og αSMA vil også vise om ductular reaksjoner eller vaskulær glatte muskel celle unormalt finnes i leveren8,27,28. Vi foreslår at kvantifisere av BD til PV-forhold i hele lever seksjoner kan gi en følsom og reproduserbar måling av galle utvikling i mus og kan tjene som en relativt enkel teknikk for å hjelpe etterforskerne avgjøre om de bør vurdere mer sofistikerte teknikker som 3D-visualisering av galle treet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner støtte fra National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 og R01 DK109982), en pilot/gjennomførbarhet Award fra Texas Medical Center fordøyelsen Disease Center under NIH P30 DK56338, og en Alagille syndrom Accelerator Award fra Den medisinske stiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
