Summary
Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.
Abstract
Mouse, safra hastalıklarının incelenmesi için geniş bir model organizma olarak kullanılır. Safra sisteminin gelişimini ve fonksiyonunu değerlendirmek için, serum kimya, histolojik analiz ve spesifik belirteçleri için immünostik dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılır. Bu teknikler safra sistemi hakkında önemli bilgiler sağlayabilse de, genellikle tüm karaciğer genelinde safra kanalı (BD) gelişimsel kusurları tam bir resim sunmaz. Bu kısmen safra gelişiminde önemli düşüklüğü olan hayvanlarda bile su drenajı için fare karaciğerinin sağlam yeteneği nedeniyle. Burada, mutant/transjenik farelerin tüm lobları kapsayan bölümlerde her portal ven (PV) ile ilişkili ortalama BDs sayısını hesaplamak için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemle, ciğeri çeşitli genotürleri ve deneysel koşullar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için stereotifik bir şekilde monte ve kesitli. BDs, sitolatin-lekelenmiş kolanjiositlerin ışık mikroskobu ile tanımlanır ve daha sonra sayılan ve karaciğer bölümünde mevcut PVs toplam sayısına bölünmüştür. Örnek olarak, bu yöntemin vahşi tip fareler ile Alagille sendromunun fare modelini açıkça nasıl ayırt edebilmesi gerektiğini gösteriyoruz. Burada sunulan yöntem, biliyer ağacının üç boyutlu yapısını görselleştiren tekniklerin yerini alamaz. Ancak, BD gelişimini ve farelerde Ductular reaksiyon oluşumunun derecesini niceciksel olarak değerlendirmek için kolay ve doğrudan bir yol sunar.
Introduction
Safra ağacı, memeliler karaciğerinin önemli bir parçasıdır ve safra, hepatositlerden bağırsak içine geçişine izin verir. İntrahepatik safra kanalları (BDS), bipotel hepatoblastlardan çentik ve tgfβ sinyal1,2ile ayırt edilen kolanjiositlerden oluşur. Uygun belirtimi ve cholangiocytes taahhüdü ve olgun BDs içine onların montaj intrahepatik safra ağacının gelişimi için önemlidir. Karaciğer gelişimi sırasında ya da organ rejenerasyonu üzerine büyüdükçe, safra sistemi uygun karaciğer drenaj sağlamak için karaciğerde geliştirilmesi gerekir. Dahası, bir dizi sendromli ve sendromic olmayan hastalıklar intrahepatik BDs3' ün salılarına neden olur. Buna ek olarak, akut ve kronik karaciğer hastalıklarının bir dizi karaciğerde sözde Ductular reaksiyonlara yol açtı, bu biliyer işaretçileri ifade ama mutlaka biliyer hücrelerinden veya formu ortaya çıkmaz hücrelerin önemli sayıda varlığı olarak tanımlanır Patent BDs4. Multisistem bozukluğu olan Alagille Sendromu (algs), çentik ligand jagged1 (JAG1) kötü BD oluşumu ve kolestaz5,6' da oluşan haployetmezlik. Laboratuvarımız, daha önce oluşturulan Jag1 heterozigot fare hattı7 ' nin algs8' de BD yetersizlik 'nin hayvan modeli olduğunu göstermiştir. ALGS bu fare modelinde, kolanjiositler hala mevcut. Ancak, Olgun, patent BDs8içine birleşme taahhüt başarısız. Bu nedenle, BD yetersizlik bir model içinde karaciğer Analizi belirgin varlığı veya kololgiocytes yokluğunda daha fazla gerektirir. Hangi olgun BDs karaciğer mevcut derecesi doğru değerlendirmek önemlidir.
Anatomik patolojide, BD 'nin%9' unda var olup olmadığını değerlendirmek için nicel Yöntemler kabul edilmektedir. Örneğin, insan hastalarında algs üzerinde çalışmalar genellikle karaciğer biyopsisi başına en az 10 Portal gemileri analiz ederek BD portalı ven (PV) oranı ölçmek9,10. Şekil ve patent BDS genel varlığı veya yokluğu analizi, serum kimya ile birlikte, fareler içinde BD gelişimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir11,12,13. Ancak, fareler, serum bilirubin seviye8' de sadece mütevazı bir artış Ile BDS önemli sayıda kaybedebilir. Buna göre, PV başına mevcut olan BD 'lerin sayısını değerlendiren bir nicel Yöntem, farelerde BD yetersizlik derecesini daha doğrudan ölçmek sağlayabilir. Son zamanlarda yapılan bir raporda, PV başına tüm karaciğer lobları boyunca BD 'lerin sayısını ölçülebilir ve Jag1 +/– Animals8' de BD-PV oranındaki önemli bir azalma bildirdi. Analizimiz sırasında, inflamatuar reaksiyon ve Ductular reaksiyonları derecesine rağmen önemli bir varyasyona karşın, BD 'ye PV oranı çok değişkenlik göstermez8. Dahası, BD 'nin PV oranlarının ölçülmesi, Jag1 +/– hayvanların glikosyltransferaz geni Poglut1 bir kopyasını kaldırmanın BD yetersizlik8' i önemli ölçüde iyileştirebilmemizi sağladı. Bir Jag1 +/+ arka planda, vasküler pürüzsüz kas hücrelerinde Poglut1 koşullu kaybı, BD numaralarının ilerici bir artışla sonuçlanır, bu da mütevazı (% 20-30) P7 ama yetişkinler8önemli olur. Yine bu teknik, P7 'de bile bu hayvanlarda BD yoğunluğundaki artışın istatistiksel olarak önemli olduğunu göstermemize izin verdi. Not: Bu genotipteki artan BD yoğunluğu dört aydır, reçine döküm analizi ile de doğrulandı. 8 bu gözlemler ve farklı algs fare modellerinde BD yoğunluğu ölçülen diğer raporlar14,15 çeşitli mutant biliyer kusurları analiz etmek için genel stratejisine bu yöntemi birleştirmek için bize istenir ve transjenik fareler.
Burada, karaciğer hastalığının fare modellerinde BD yetersizlik derecesini incelemek için kullanılabilecek basit bir teknik ayrıntılarıyla (Şekil 1). Bu yöntemle, cholangiocyte işaretçiler Sito (CK) 8 ve CK19 (bundan sonra geniş spektrumlu CK, wsCK) ile birlikte boyama, fare karaciğerinde BDs ve uncorporated cholangiocytes görselleştirilmesi için kullanılır. Alfa-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) karşı bir antikor etiket gemiler için boyama eklenir. Tüm karaciğer lob 'lar kapsayan bir bölümde BD PV oranı sistematik Analizi her genotip için çok sayıda PV analiz edilmesini sağlar. Yöntemimiz 2D görüntülerde BDs ve PV 'lerin ölçülmesi üzerine bağlı olduğundan, belirli bir mutasyonun safra ağacının 3D yapısında veya küçük safra kanallarının bütünlüğünü incelemek için uygun değildir. Yine de, müfettişlerin fareyle biliyer gelişimini değerlendirmek için basit ve objektif bir strateji sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi kurallarına göre ve onaylanmış hayvan protokolleri altında Baylor Tıp Koleji 'nde bir bariyer hayvan tesisinde yer aldı.
1. fare karaciğer dokusu koleksiyonu
-
Karaciğer hasat için fare hazırlanması
- Isoflurane kullanarak fareyi ötenize.
- Ölüm sağlamak için fare servikal çıkığı gerçekleştirin.
- Kaburga kafesinin yaklaşık bir santim altında bir enine kesi yapın.
- Karaciğerin tüm ventral yüzeyini açığa çıkarın.
-
Fare karaciğer koleksiyonu
- Dikkatle, küçük makas ile, karın diğer organlara karaciğer bağlayan ligamentler üzerinden kesilmiş.
- Karaciğeri bağırsaktan ayırmak için ortak BD 'den kes.
- Dikkatle safra kesesi üzerine tutarak karaciğer kaldırmak ve hemen bir 50 ml tüp üç dörtte% 4 civarında formaldehite (PFA) ile doldurulur.
2. parafin içinde karaciğer sabitleme ve katıştırma
-
Fiksasyon
- 48 h için karaciğer dokusunu 4 °C ' de% 4 PFA olarak düzeltin.
- 4 °C ' de 1 saat için% 70 EtOH ile dokusu yıkayın.
- 4 °C ' de 1 saat için% 95 EtOH ile dokusu iki kez yıkayın.
- 4 °C ' de 1 saat için% 100 EtOH ile dokusu iki kez yıkayın.
-
Temizleme
- Karaciğer dokusunu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca üç kez temizleme ajanı (malzeme tablosu) ile yıkayın.
Not: Karaciğer üçüncü yıkama aşağıdaki sert hissetmek gerekir.
- Karaciğer dokusunu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca üç kez temizleme ajanı (malzeme tablosu) ile yıkayın.
-
Parafin içinde gömme
- 3 yıkanıyor, 30 dk için Parafin balmumu bir doku kalıp doku kaseti yerleştirin. Balmumu 60 °C ' ye önceden ısıtılmalıdır.
- Doku kalıbını parafin mumu ile üçe çeyrek yükseklikte doldurun ve 60 °C ' de bir Isıtma bloğuna tutun.
- Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kalıp karaciğer yerleştirin.
- Dikkatli bir şekilde Isıtma bloğundan kalıp çıkarın.
- Kalıp üzerinde kasetin üst yerleştirin ve sıcak sıvı parafin ile üst kapalı.
- Kalıp ve blok gece oda sıcaklığında soğutmak için izin verin.
Not: Doku blokları artık oda sıcaklığında saklanabilir.
3. karaciğer dokusunun bölünme
-
Bölünme bloğunun hazırlanması
- Kalıp blok çıkarmadan önce 5 dakika boyunca buz üzerine kalıp yerleştirin.
- Blok ve buz arasında bir laboratuar dokusu kağıt mevcut ile buz üzerinde blok yerleştirin.
- En iyi doku Dilimleme sonuçları için bölüm değil zaman buz üzerinde blok tutun.
-
Karaciğer bloklarının bölünme
- Bir mikrotome kullanarak, karaciğer yüzeysel, dorsal tarafında keserek başlar. Bölümler 5 μm olmalıdır.
- Bölümler yamultulmuş veya katlanmış olmadığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskop altında yüzeysel bölümler kontrol edin.
- Karaciğer, kaudat lob içeren bir bölümünü alın.
Not: Bazı bloklar için, aynı doku dilimi üzerinde sol, medial, sağ ve kaudat lob olacaktır. - Dört lob aynı slayt üzerinde mevcut değildir bu bloklar için, sol kadar dilim devam, medial ve sağ loblar aynı slayt üzerinde mevcut.
4. wsCK ve αSMA için immünhistokimya
-
İmmünhistokimya için slaytların işlenmesi
- Analiz edilecek genotip başına bir slayt seçin.
- Ksilin içinde 15 dk için slayt yıkayın, 100% EtOH, 95% EtOH ve son olarak% 70 EtOH (her çözümde 3 x 5 dk).
- Slayt 5 dk deiyonize H2O için yıkayın.
- Kaydırağı antijen alma çözümüyle (Tris tabanlı, yüksek pH) batırın.
- 10 psi 'de 3 dakika boyunca bir basınç ocağında basınç altında ısı.
- Slaytın oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (yaklaşık 35 dk).
-
Doku bölümlerini engelleme
- PAP Pen kullanarak slayttaki bölümleri özetlemektedir.
- Uygulama fosfat-tamponlu tuz (PBS) + 0,1% iki kez, 5 dakika her bölümü kapsayacak şekilde ara.
- PBS + 0,3% Triton 'da 1:50 at normal keçi serumu (NGS) karıştırarak engelleme arabelleği yapın. Hem engelleme hem de primer antikor uygulaması için yeterli tampona sahip olmak için, bölüm başına 100 μL yeterlidir.
- Bölüm başına 100 μL engelleme çözümünü uygulayın.
- Engelleme çözeltisi ile kaplı slaytları 4 °C ' de 1 saat boyunca inküt.
-
WsCK ve αSMA için boyama
- Seyreltilen Anti-CK8 ve anti-CK19 antikorları16 (gelişimsel çalışmalar Hybridoma Bank, Troma-ı ve TROMA-III, sırasıyla) 1:20 wsCK için leke engelleyici tampon içinde. Anti-αSMA antikor17 (malzeme tablosu) ile aynı tamponda 1:200 için seyreltin.
- Her bölüme üç antikorları içeren seyreltilmiş antikor çözeltisi 100 μL uygulayın.
- Antikor çözeltisi ile kaplı slaytları gece 4 °C ' de ele geçirin.
- PBS + 0,1% Triton ile slaytları üç kez, her biri 5 dakika yıkayın.
- Dilüt ikincil antikorlar (Anti-Rat-Alexa488 ve anti-fare-Cy5) 1:200 PBS + 0,3% Triton.
- Slaytlar için hem ikincil antikorları içeren ikincil antikor çözeltisi 100 μL uygulayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın.
-
DAPı nükleer boyama ve montaj
- Slaytları üç kez, her biri 5 dakika yıkayın.
- 100 μL DAPı (1:3000) her bölüme 10 dakika için uygulanır.
- Antifade montaj Orta (malzeme tablosu) slaytlara uygulayın ve doku bölümlerinin üstüne bir cam lamel magazini yerleştirin. Bir gecede 4 °C ' de slaytlar bırakın. Ertesi gün slaytları mühürleyin.
- Slaytları 4 °C ' de saklayın ve 1 haftalık montaj içinde görüntü yapın.
5. BD 'lerin görüntüleme ve ölçümü
-
Görüntüleme karaciğer bölümleri
- Görüntüleme öncesinde, bir laboratuar üyesinin yardımı ile numunenin genotipi için kendinizi kör. Tüm görüntüleme dosyalarının bir hayvan/örnek numarasının yanı sıra genotip veya diğer özel tanımlama bilgilerinden yoksun olduğundan emin olun.
- Bir floresan mikroskop kullanarak, her bölümün 1x yakınlaştırma 20X görüntüleri almak ve karaciğer genelinde her PV görüntülenmiş emin olun. Sol, medial, sağ ve kaudat lob 'lar içerir.
Not: Genellikle karaciğer boyutuna bağlı olarak hayvan başına 60-90 Portal yolları bulabilirsiniz. - PV 'leri kimlik olarak görmek için Xsma artı wsCK boyama arayın. ΑSMA pozitif ancak wsCK boyama eksikliği yapıları Portal yapıları değildir.
-
BD 'lerin tanımlanması ve sayımı
- Aşağıdaki sütunlara sahip bir elektronik tablo oluşturun: hayvan/örnek numarası, görüntü numarası, PVs sayısı ve BDs sayısı.
- Her görüntüden geçerek, görüntü başına PVs sayısını belirleyin ve kaydedin.
- Her görüntüde, tanımlanabilen bir lümen çevreleyen (wsCK +) kolanjiositlerin varlığı ile patent BD 'Leri tanımlayın. Yapılar farklı olmalıdır ve diğer wsCK + hücrelerden mesenyme tarafından ayrılır.
- Her patent BD ve görüntü numarası ile aynı sütunda yer saymak.
- Bir PV alınan her görüntü için bunu.
- Karaciğer örneğinde tüm PV 'lerin ve tüm BDs 'nin toplamını hesaplayın.
- Karaciğer numunesi için BD-PV oranını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce Jag1 +/– ANIMALS, algs8' in fare modeli olarak biliyer kusurları belgeledik. BD-PV oranını belirlemek için, P30 fare ciğeri ve CK8 ve CK19 (wsCK) için onları ortak olarak lekelenmiş, vasküler Marker αSMA ile birlikte. Daha sonra her karaciğer lobları tüm PVs görüntülenmiş. Şekil 2a'da gösterildiği gibi, PV 'Leri bitişik wsCK boyama (ok uçları) olan αsma-vitray olarak tanımlamıştır. WsCK olmayan αSMA-lekeli yapılar merkezi damarları ve analiz (ok) dahil olmamalıdır.
PV 'ler tanımlandığında, patent BDs 'yi karakteristik şeklinden tespit ettik. Şekil 3' te gösterildiği gibi, patent kanalları wsck + kolanjiocytes ile çevrili bir açıkça tanımlanabilen Lumen vardır. Kanallar genellikle Mezenşim (Arrowhead) tarafından yakındaki kanallar veya kolanjiocytes ayrılır. wsCK + tanımlanabilen bir Lümene sahip olmayan hücreler, bitişik hücrelere iliştirilir veya izolasyonda görünür, toplam BDs (oklar) sayısına doğru sayılmaz. Şekil 3A , bir PV ile tam patent kanalı ile birlikte birkaç uncorporated hücreleri ile ilişkili bir vahşi tip karaciğer bölümü gösterir. Figure 3B , P30 Jag1 +/– Hayvansal bir karaciğer bölümlerisidir. Bu bölümdeki üç PV 'de hiçbir patent BDs mevcut değildir. Tüm wsCK + hücreleri uncorporated ve bu nedenle sayılmamalıdır. Bu görüntü, wsCK + hücrelerinin varlığı veya yokluğu Jag1 +/– ve vahşi tip ciğeri farklılaştırmaz, dikkatli BD sayma önemini vurgular.
Şekil 1D'de gösterildiği gıbı, BD 'nin PV oranı analizi, karaciğer BÖLÜMÜNDEKI her PV 'nin, her PV 'nin etrafında mevcut olan toplam patent BD sayısı ile birlikte sayılmasını içerir. Jag1 +/– ciğeri analiz ederken, farklı lobların bu hayvanlarda (yayımlanmamış veriler) aynı ölçüde etkilenmediğini fark ettik. Bu nedenle, genellikle tam karaciğer kapsama sağlamak için sol, medial, sağ ve kaudat lob genelinde PV saymak. Toplam PV 'lerin ve BDs 'nin tablolanmasını takiben, oran tüm bölüm için hesaplanır.
Şekil 4' te 3 vahşi tip ve 3 Jag1 +/– hayvanlar için BD 'nin PV oranlarının analizini gösterdik. Bu grafik, iki genotipin BD sayılarını temel alarak nasıl kolaylıkla ayırt edilebilir olduğunu gösterir. Ayrıca, bu yöntem Jag1 +/– fenotip genetik manipülasyonlar tarafından kurtarma derecesi analiz için nicel bir ölçü sağlar, daha önce bildirilen gibi8.
Şekil 1: deneysel sürecin şematik. (A) karaciğer tüm fareyle hasat edilir. (B) karaciğer örnekleri 48 h, susuz ve temizlenmiş için sabittir. (C) karaciğer dokusu parafin içine gömülür. Bölümler yapılır ve tahsil slaytlar yerleştirilir ve wsCK ve αSMA için lekelenmiş. (D) slaytlar görüntülenmiş ve PVS ve BDS sayısı kaydedilir. BD-PV oranı (BD: PV) tüm karaciğer bölümü için hesaplanır. HA = hepatik arter; CV = merkezi ven. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Merkezi damarlardan ayırt edici (Sabancı ) (A) bir PV, αsma boyama ve çevreleyen wsCK + kolanjiocytes (ok uçları) varlığı ile tanımlanır. (B) Merkezi damarlar, yapı etrafında (ok) hiçbir wsCK + koolangiocytes mevcut olmayan αsma boyama varlığı ile tanımlanır. (A ' ve B ') Sırasıyla A ve B 'den αSMA kanallarını gösteren gri tonlamalı görüntüler. Ölçek çubuğu = 100 μm ve tüm paneller için geçerlidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: patent BDs tanımlaması. (a-a ') P30 vahşi tip ciğeri olarak, bir patent BD (Arrowhead) olarak wsck + cholangiocytes ile çevrili ayırt edilebilir bir lümen ile elipsoid yapılara yuvarlak saymak. Bir lümen çevreleyen olmayan kolanjiositler uncorporated olarak kabul edilir ve sayılmaz (oklar). (b-b ') İçinde Jag1 +/– karaciğeri, kolanjiositler hala mevcut (oklar). Ancak, çoğu patent BDs içine dahil edilmez. ölçek çubuğu = 100 μm ve tüm paneller için geçerlidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: P30 fare ciğeri gelen PV Graph BD. BDs ve PV 'ler nicelik ve BD-PV oranı üretilir. Daha önce bildirildiğine göre8, Jag1 +/– hayvanlar Wild-tıp hayvanlar ile karşılaştırıldığında BD PV oranı karakteristik ve önemli bir düşüş var. İstatistiksel analizler için iki yönlü t-testi yapılmıştır. Yatay çizgiler göstermek anlamına gelir. P< 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farelerde BD gelişimi ve onarımının incelenmesi, kolestatik bozuklukların patogenezi ve mekanizmasının incelenmesi konusunda önemli bir araçtır. Buna ek olarak, yeni tedavilerin geliştirilmesi kısmen tekrarlanabilir ve tercihen ölçülebilir fenotip kurulması üzerine bağlıdır. Fare modellerinde mevcut fenotipleme genellikle serum kimya, karaciğer histolojisi ve hücre tipi spesifik işaretçileri için immünostatik içerir. Bu teknikler biliyer sisteminin yapısı ve işlevi hakkında değerli bilgiler oluştursa da, belirli bir genetik manipülasyonun BDs sayısına etkilerini doğrudan ölçmek sağlamıyorlar. Anatomik patolojide, insan hastalarında BD yetersizlik biyopsi bölüm9' da BD 'ye PV oranı analizi yoluyla belirlenir. Klinisyenler algs ve diğer kolestatik hastalıklarda kolestaz ve karaciğer hastalığının şiddetini belirlemek için serum Kimya analizi istihdam ederken18,19, fare modellerinde histolojik değerlendirme her iki anlayış için önemlidir hastalık değiştiricilerin BD gelişimi üzerine etkileri ve normal kanal gelişimini geri yükleme üzerine tedavilerin etkinliği. Fareler patent BDs sayısında ciddi bir azalma olabilir ama hala serum bilirubin düzeyinde sadece mütevazı bir artış göstermek çünkü bu kısmen8, muhtemelen fare karaciğerinde son derece verimli safra drenajı nedeniyle. Önceki çalışmalarımız, Jag1 heterozigot 'in, BD olgunlaşma bozukluğu olduğunu ancak cholangcioytes8' in yokluğunda olmadığını göstermiştir. Böylece, BD gelişimini analiz etmek ve fare modellerinde hastalık şiddetini değerlendirmek için, sadece eksikleri veya kolanjiositlerin varlığını incelemek için yeterli değildir. Bu sorunu gidermek için, burada fare karaciğerinde patent BD numaralarının objektif ölçümü için basit bir yöntem sundu.
Bizim analiz doğru sabitleme ve fare karaciğerinin katıştırma bağlıdır. Karaciğeri, bir örnekten diğerine benzer sekleme sağlamak için ventral tarafı gömülür. Bu en kararlı pozisyon. Boya için kullanılan bölümler karaciğer loblarında yeterince derin olmalıdır, BDS sayısında farklılıklar ve karaciğerin hilusu karşı çevre PVS büyüklüğü gibi. Biz bazen uzunlamasına kesilmiş PV 'ler görmek. Bu durumlarda, genellikle aynı zamanda uzunlamasına kesilmiş ve uzun bir açık tüp gibi görünür bir komşu BD vardır. Yeniden üretilebilirliğini sağlamak için, bu uzun tüpleri tek bir BD olarak sayıyoruz. Patent BD 'lerin tanımlanması çoğunlukla belirsiz. Ancak, bazı safra yapıları lumenized görünür ama genellikle normal BDs14görülen elipsoid morfolojiye yuvarlak göstermez. Bizim elimizde, bu bazen bir yapı bir araştırmacı tarafından ancak başka bir meslektaşım tarafından bir BD denir neden olabilir. Bu nedenle, veri analizi ve sunumunda tutarlılık ve yeniden Üretilebilirlik sağlamak için, belirli bir projeye ilişkin tüm örneklerin bağımsız olarak iki müfettiş tarafından analiz edilmesini öneririz.
Anti-CK8, olgunlaşmamış ve olgun biliyer hücrelerini işaretlemek için gösterilirken, Anti-CK19 sadece olgun biliyer hücreleri12,20işaretler. Bu nedenle, bir PV olgun bir BD ile ilişkili olmasa bile, CK8 + hücrelerin varlığı nedeniyle merkezi damarlardan kolayca ayırt edilebilir. Bu iki antikorları Anti-αSMA ile birlikte kullanmak, bizim miktardaki Portal yolları tam olarak kapsamasını sağlar. Dahası, bizim elimizde, biliyer hücrelerinin bireysel CK19 veya CK8 boyama nispeten zayıf bir sinyal üretir ve bazı arka plan boyama ile ilişkilidir. İki CK antikorlarının karıştırılması, biliyer hücrelerinde sürekli olarak güçlü bir sinyale neden olur ve bu nedenle ölçümleme kolaylaştırır.
İntrahepatik safra ağacının olgunlaşması bir hilar-periferik yönde ortaya çıkar ve postnatal21devam eder. Nitekim, erken postnatal karaciğerde, özellikle periferik alanlarda, postnatal karaciğer genişlemesinin önde gelen önünde olan çok daha fazla olgunlaşmamış cholangiocytes vardır. Dahası, biz büyük hayvanların daha kanalları ile8yaş hayvanlar olarak BD numaraları bir değişiklik gözlenen. Ayrıca, bazı Portal yapıları birden fazla BDs içerir, diğerleri bir veya hiçbir kanal, özellikle karaciğer çevre boyunca. Her hayvan için tüm karaciğer lobları kapsayan bir mikroskobik slayt kullanıyoruz ve tüm slayt boyunca BD 'nin PV oranını sistematik olarak ölçmeye çalışıyoruz. Bu gerekli değilken, bu geniş Portal yolları her hayvan için yaş ve karaciğer boyutu (60-90 genotip ve yaş bağlı olarak karaciğer başına PVs) ne olursa olsun analiz edilir sağlar. Ayrıca, slayt üzerinde tüm PVS analiz ederek, hem daha olgun hiler ve daha az olgun periferik alanların karaciğer gelişimi tüm aşamalarında sayılır emin olun. Her hayvan için tüm karaciğer lob 'lar kapsayan aynı zamanda belirli bir mutasyon karaciğer üzerinde eşit BD gelişimini etkilemez Eğer ölçümlerde değişkenlik azaltabilir.
Yöntem, küçük safra kanallarını, uncorporated biliyer hücrelerinin gruplarından ayırt etmek için sınırlıdır. Safra ductules4 genellikle bu boyama analiz etmek için kullanılan büyütme bir lumenized yapı olarak tanınacak kadar küçük. Bu nedenle, onlar bizim quantifications hariç olması muhtemeldir, ve böylece Yöntem orta büyük kanallar tanımlamak doğru eğilmiş. Bu sınırlamalara rağmen, burada açıklanan Yöntem Jag1 +/– ve Jag1 +/+ ciğeri arasında kolaylıkla ayırt edilir. Ayrıca, Polgut1 +/– bir kopyasının eşzamanlı kaybı üzerine Jag1 +/– BD yetersizlik 'nin kısmi kurtarmasını algılayacak kadar hassastır ve Poglut1 koşullu kaybı olan Jag1 +/+ hayvanlarda BD yoğunluğunda mütevazı artış vasküler pürüzsüz kas hücrelerinde8. Bu gözlemler, BD sayısında yapılan değişiklikler mütevazı olsa bile çeşitli genetik kökenlerde BD yoğunluğunda yapılan değişikliklerin belirlenmesinde bu yöntemin kullanışlılığını göstermektedir.
Son yıllarda, safra ağacının 3D yapısının görselleştirme BD geliştirme22,23,24,25analiz etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılmıştır. Bu zarif Yöntemler, safra ağacını ortak BD 'den mürekkep veya reçine ile doldurmaya güveniyor ve bu nedenle biliyer sisteminin patresini inceler. Ayrıca, safra ağacının 3D yapısı ve karaciğer büyüdüğü gibi karaciğer çevresinde oluşumu hakkında bilgi vermişler, bu da burada sunulan gibi protokollerde kullanılan 2D değerlendirmesi ile değerlendirilemez. Ancak, bu 3D görselleştirme teknikleri başarılı performans önemli uzmanlık gerektirir26. Bunun aksine, burada sunulan teknik oldukça basittir ve histolojik ve görüntüleme analizi için rutin donanıma erişimi olan herhangi bir grup tarafından çalıştırılabilir. Ayrıca, wsck ve αsma için çift lekeli bölümlerin analizi, karaciğerde Ductular reaksiyonlar veya vasküler pürüzsüz kas hücresi anomalilerinin var olup olmadığını da gösterecektir8,27,28. Tüm karaciğer bölümlerinde BD 'nin PV oranını ölçmek, farelerde biliyer gelişiminin hassas ve tekrarlanabilir bir ölçümünü sağlayabilir ve müfettişlerin daha fazla düşünmesi gerekip gerekmediğini karar vermeye yardımcı olmak için nispeten kolay bir teknik olarak hizmet verebilir biliyer ağacının 3D görselleştirme gibi sofistike teknikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ilgi çatışması yok.
Acknowledgments
Yazarlar Sağlık Ulusal Enstitüleri (NıH) (R01 GM084135 ve R01 DK109982), bir pilot/fizibilite Ödülü Teksas Tıp Merkezi sindirim hastalığı Merkezi NıH P30 DK56338 altında destek kabul ve bir Alagille Sendromu Hızlandırıcı Ödülü Tıp Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
