Summary
Denne protokollen brukes til å isolere enkelt atrieflimmer cardiomyocytes fra den voksne musen hjertet ved hjelp av en blings fordøyelsen tilnærming. Denne tilnærmingen brukes til å isolere høyre eller venstre atrieflimmer myocytter som kan brukes til å karakterisere atrieflimmer myocyte elektrofysiologi i patch-Clamp studier.
Abstract
Den elektrofysiologisk egenskaper av atrieflimmer myocytter viktigere påvirke generelle hjertefunksjon. Endringer i de underliggende joniske strømmene som er ansvarlige for handlings potensialet kan forårsake arrhythmic underlag som ligger til grunn arytmi, slik som atrieflimmer, som er svært utbredt i mange tilstander og sykdomstilstander. Isolere voksen mus atrieflimmer cardiomyocytes for bruk i patch-Clamp eksperimenter har i stor grad avansert vår kunnskap og forståelse av mobilnettet elektrofysiologi i sunn atrieflimmer myokard og i innstillingen av atrieflimmer patofysiologi. I tillegg har studier med genetiske musemodeller belyst rollen som et stort utvalg av proteiner i regulering av atrieflimmer elektrofysiologi. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av cardiomyocytes fra atrieflimmer vedheng av voksne mus ved hjelp av en kombinasjon av enzymatisk fordøyelse og mekaniske dissosiasjon av disse vev. Denne tilnærmingen konsekvent og pålitelig gir isolerte atrieflimmer cardiomyocytes som deretter kan brukes til å karakterisere cellulære elektrofysiologi ved å måle handlings potensialer og ioniske strømninger i patch-klemme eksperimenter under en rekke eksperimentelle Forhold.
Introduction
Atria, som er de tynne vegger, lavt trykk kamre av hjertet som mottar blod fra den overlegne og underlegne vena cavae samt lunge årer, er integrert i normal hjerte fysiologi. Som andre regioner av hjertet, inneholder Atria en rekke celletyper, inkludert cardiomyocytes, fibroblaster, endothelial celler, vaskulære glatte muskelceller, og andre. Atrieflimmer myocytter er elektrisk nervøs celler som spiller en viktig rolle i ledning av elektriske signaler gjennom hjertet, og dermed sikre riktig atrieflimmer under hvert hjerteslag1. Elektrisk dysfunksjon i Atria kan føre til en rekke atrieflimmer, som atrieflimmer og atrieflimmer2,3. Disse er svært utbredt, men dårlig forstått, atrieflimmer som fører til betydelig sykelighet og dødelighet. Atrieflimmer kan forekomme i forbindelse med genetiske mutasjoner, i samarbeid med aldring eller i innstillingen av ervervet former for hjertesykdom, inkludert hypertensjon, hjertesvikt og diabetes2,4,5 ,6. Disse forholdene kan endre de elektriske egenskapene til atrieflimmer myocytter som kan skape et substrat som øker utbredelsen av arrhythmogenesis1,2.
Normal elektrisk funksjon i Atria, så vel som atrieflimmer, er viktigst påvirket av morfologi av handlingen potensial (AP) produsert i atrieflimmer myocytter. arrhythmogenesis Den atrieflimmer AP er generert fra aktiviteten til en rekke ioniske strømninger, inkludert natrium strøm (jegna, båret av NaV1,5 kanaler), l-type kalsium strøm (ica, L, båret av Cav1,2 og cav1,3 kanaler ), og flere kalium strømmer inkludert ultra-rask forsinket likeretter kalium strøm (jegkur, båret av KV1,5 kanaler), forbigående utover kalium strøm (jegtil, båret av kv4,2 og kv4,3 kanaler), en stabil tilstand kalium strøm (jegKSS, båret av KV2,1 kanaler), og innover likeretter kalium strøm (IK1, båret av KIR2,1 kanaler)1,7, 8i den. Selv om de ikke spiller en stor rolle i musen Atria, den raske og langsomme komponenter av den forsinkede likeretter K+ strøm (jegkr og jegKS) også bidra til Ap repolarisasjon i enkelte arter7. Endringer i en eller flere av disse ioniske strømmene kan i betydelig grad endre de elektriske egenskapene til atrieflimmer, noe som kan føre til myocytter arytmi. For eksempel, en reduksjon i ina kan langsom Lednings hastighet over Atria ved å redusere Ap oppstrekningen hastighet. På den annen side, en reduksjon i repolarizing kalium strømmer eller en økning i enten jegca, L eller sent jegna kan føre til utvikling av afterdepolarizations som kan utløse spontan aktivitet i Atria1, 2,9.
Det er viktig å erkjenne at det er forskjeller i AP morfologi i ulike deler av atrieflimmer myokard som sannsynligvis skyldes forskjeller i uttrykk eller regulering av disse underliggende ion kanaler. For eksempel er forskjeller i Ap varighet mellom høyre og venstre Atria i forbindelse med forskjeller i nåværende tetthet er godt beskrevet10,11,12,13. Også har vi nylig demonstrert at det er forskjellige mønstre av elektrisk remodeling i høyre og venstre Atria av mus med kronisk hypertensjon6,14. Retten atrieflimmer bakre vegg inneholder også sinoatriell noden, som har sin egen distinkte mønstre av AP morfologi og avfyring mønstre15. De distinkte egenskapene til myocytter i hver av disse ulike delene av Atria kan undersøkes i detalj ved hjelp av isolerte myocytter fra hver av disse regionene.
Det finnes ulike tilnærminger som kan brukes til å isolere atrieflimmer myocytter for patch-klemme elektrofysiologi studier16. En mulighet er å bruke en retrograd-tilnærming hvor hjertet kanylert via aorta for levering av enzymer. Selv om dette er en levedyktig tilnærming, kan det produsere variasjon i atrieflimmer myocyte kvalitet på grunn av inkonsekvenser i produksjon av Atria. Vi har vedtatt en "blings" fordøyelse tilnærming for isolering av atrieflimmer myocytter som eliminerer behovet for retrograd av hjertet. Vår tilnærming bruker en kombinasjon av enzymatisk fordøyelse og mekanisk dissosiasjon av atrieflimmer som konsekvent og pålitelig gir et stort antall isolerte atrieflimmer myocytter som er egnet for patch-klemme studier. Mens vi beskriver vår tilnærming her ved hjelp av atrieflimmer vedheng vev, kan tilnærmingen brukes på en hvilken som helst region av atrieflimmer myokard (dvs. høyre eller venstre atrieflimmer vedheng, gratis vegger, bakre vegger) som etterforsker velger. Denne tilnærmingen er ideell for studier av atrieflimmer myocyte elektrofysiologi i genmodifiserte mus, i musemodeller av hjerte-og karsykdommer, eller for å studere virkningene av farmakologiske forbindelser5,6,17 , 18 av år , 19i denne.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av The University of Calgary Animal Care og bruk komiteen og ble gjennomført i samsvar med retningslinjene for den kanadiske Council on Animal Care. Det atrieflimmer myocyte isolasjon, bilder og representative resultater beskrevet nedenfor ble innhentet fra en 15 ukers gammel mannlig wildtype C57Bl/6 mus. Vi bruker rutinemessig denne protokollen til å isolere atrieflimmer myocytter fra wildtypemus 17,18, mus bærer genetiskemutasjoner 19,20 og mus modeller av sykdom som kronisk hypertensjon6, 14i det. Protokollen kan brukes på samme måte for mannlige eller kvinnelige mus. Vi har også benyttet en lignende versjon av denne isolasjons prosedyren for å isolere sinoatriell node myocytter fra musen hjertet17,21,22,23. Et flytdiagram av denne eksperimentelle protokollen er plassert i figur 1.
1. utarbeidelse av Stock Solutions og utstyr
- Forbered 1 dissekere rett ved å legge til silikon elastomer i henhold til produsentens anvisninger. Legg nok silikon elastomer sammensatte å dekke bunnen av en 10 cm Petri parabolen til en dybde på 1 cm. Tillat å kurere og deretter sette inn 6 insekt pinner i fatet.
Merk: Denne silikon dissekere parabolen kan gjenbrukes i månedsvis og lagres ved romtemperatur. - Klargjør 3 brann-polert Pasteur-Pipetter med en åpning på 1 mm (liten bore), 3 mm (medium boring) eller 5 mm (stor diameter) i diameteren som vist i figur 2a. For å lage disse Pipetter, score en Pasteur-pipette og deretter knipse langs score merket for å produsere en åpning som er litt større enn ønsket bore størrelse. Bruk en metall fil for å glatte overflaten og deretter brann-polish denne åpningen ved hjelp av en åpen flamme.
Merk: Dette vil gi en jevn, brann-polert kant med en åpning av ønsket diameter. Det er viktig at åpningen er fri for sprekker og grove overflater. Disse brann-polerte Pipetter kan oppbevares ved romtemperatur og gjenbrukes i månedsvis. - Forbered lager løsninger for Tyrode pH 6,9-løsning og Tyrode pH 7,4-løsning som listet opp i tabell 1. Forbered også 10 mL hver av 1 M MgCl2, 1 m CaCl2og 100 mm CaCl2. Bruk ultrarent vann til alle løsninger og oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 måneder.
- Forbered 1 L av modifisert kraft-Brühe (KB)-løsning som angitt i tabell 2. Bruk ultrarent vann. Del oppløsningen i 20 mL alikvoter og oppbevar ved-20 ° c i opptil 2 måneder.
2. utarbeidelse av løsninger og isolasjons oppsett for atrieflimmer Myocyte Isolation
- Forbered 50 mL av en modifisert Tyrode pH 7,4-løsning som beskrevet i tabell 3 i en 125 ml Erlenmeyer kolbe, med 1 m CaCl2 og 1 m MgCl2 lager løsninger. Plasser Erlenmeyer kolbe i et vannbad på 35 ° c til bruk, som vist i figur 2b.
- Klargjør den modifiserte Tyrode pH 6,9-oppløsning som beskrevet i Tabell 4 i et 50 ml rør, ved hjelp av 100 mm CaCl2 -løsningen. Alikvot 2,5 mL av denne oppløsningen i hver av tre 5 mL runde bunn rør. Plasser disse rørene i en wire rack plassert i et 35 ° c vannbad til bruk, som vist i figur 2b.
- Klargjør enzym løsningen som beskrevet i tabell 5 i en 14 ml rund bunn slange. For å gjøre den protease løsningen, tilsett 1 mg protease per 100 μL av ultrarent vann. Plasser røret som inneholder denne enzymet løsningen i wire rack og ruge i et 35 ° c vannbad til bruk.
- Tin en alikvot med modifisert KB-løsning i et vannbad på 35 ° c. Alikvot 2,5 mL KB-løsning i hver av de tre 5 mL runde bunn rørene og 2,5 mL i en 14 mL rund bunn tube. Plasser disse rørene i tråd stativet og ruge i et vannbad på 35 ° c til bruk, som vist i figur 2b.
- Legg ut den dissekere platen, dissekere verktøy, en pipette fra Pasteur og de fire polerte Pipetter som vist i figur 2b.
3. Disseksjon av mus atrieflimmer vedheng (er)
- Injiser musen med 0,2 mL heparin (10 000 USP U/10 mL) via intraperitoneal injeksjon og vent 5 min for absorpsjon.
- Plasser musen i en induksjon kammer og bedøve ved isoflurane innånding (3-4%). Isoflurane og oksygen er levert ved hjelp av en anestesi maskin og avfalls anestesi gass er scavenged. Når musen er anesthetized, og ikke viser en tå klype refleks, euthanize musen ved rask cervical forvridning. Plasser musen på et papir håndkle eller en kork bord og tape på poter ned for å holde musen på plass.
- Fukt brystet av musen med 70% etanol. Fjern pelsen og huden som dekker brystet ved hjelp av buet saks. Deretter bruker rotte tann tang å løfte brystbenet og deretter kutte membranen langs kanten av ribbeina. Fjern hele ribbeinet buret med buet saks for å avdekke hjertet.
- For å fjerne atrieflimmer vedheng (høyre eller venstre), forsiktig løfte vedheng med fin dissekere tang og skjær den ut med våren saks. Umiddelbart overføre atrieflimmer vedheng til en silikon belagt dissekere parabolen inneholder 20 mL av varmet endret Tyrode ' s pH 7,4 løsning beskrevet i trinn 2,1.
- Plasser en dissekere PIN på toppen og en nål på bunnen av åpningen av atrieflimmer vedheng. Ved hjelp av en beite pipette, skyll Atria med varmet endret Tyrode ' s pH 7,4 løsning for å fjerne blod. Åpne atrieflimmer vedheng ved å skjære langs øvre og nedre kant av atrieflimmer vedheng. Deretter PIN hjørnene av atrieflimmer vedheng ned for å skape en flat, rektangulær stykke vev, som vist i figur 3a.
4. isolering av atrieflimmer myocytter
Merk: Trinnene i dette avsnittet er utført ved 35 ° c, med rør nedsenket i et vannbad på 35 ° c. Vær forsiktig når du overfører vev strimler mellom runde bunn rør for å sikre at bare vevet (og ikke løsningen) er overført mellom rørene.
- Skjær atrieflimmer vedheng i ca 8-10 like store striper (ca 0,7 mm i bredde) ved hjelp av våren saks og fin tang. Et eksempel på strimler av atrieflimmer er vist i figur 3b. Merk at strimler kontrakten når de er kuttet fri fra de viktigste stykke vev. Ved hjelp av små bar brann-polert pipette, overføre vevet strimler inn i det første røret inneholder varmet endret Tyrode ' s pH 6,9 løsning beskrevet i trinn 2,2. Vent 5 min.
- Vask vevet strimler ved å overføre dem til den andre og deretter den tredje runde bunnen rør som inneholder modifisert Tyrode ' s pH 6,9 løsning utarbeidet i trinn 2,2 ved hjelp av medium bar brann-polert pipette.
- For å vaske vevs strimler, cap 5 mL runde bunn røret og forsiktig invertere røret 3 ganger. La vevs strimler bosette til bunnen av røret før overføring av vev strimler til neste rør ved hjelp av medium bar brann-polert pipette.
- Overfør vevs strimler inn i enzymet løsningen beskrevet i trinn 2,3 ved hjelp av en medium bar brann-polert pipette og ruge i 30 min. virvel røret hver 3-5 min for å hindre at vevet strimler å følge sammen.
Merk: I begynnelsen av enzymatisk fordøyelsen, vev strimler bosette seg raskt etter virvlende. Ved ca 20 min av fordøyelsen, vevet strimler begynner å flyte i enzymatisk løsning etter virvlende. I løpet av denne tiden, atrieflimmer også endre utseende fra blek rosa til hvit som de er fordøyd. - Etter enzymatisk fordøyelsen, utføre tre vasker med 2,5 mL KB løsning i 5 mL runde bunn rør utarbeidet i trinn 2,4. For hver vask, inverter forsiktig røret 3 ganger før du flytter vevet til neste rør ved hjelp av medium bar brann-polert pipette. Etter siste vask, Overfør stripene inn i 14 mL rund bunn rør som inneholder 2,5 mL KB-løsning. Vent 5 min.
- Forsiktig triturate vevet for 7,5 min ved hjelp av bred bar brann-polert pipette. Dette vil mekanisk distansere vevet strimler og gi en skyet løsning fylt med individuelle atrieflimmer myocytter.
Merk: Under trituration blir vevet hvitt og oppløsningen blir uklar. Kraften av trituration, oppnås ved å endre både frekvens og hastighet av utviste vevs strimler fra den brede bar brann-polert pipette, bør skreddersys til den enkelte isolasjon. Hvis trituration er også mild, cellen utbytte ville være lav, stund trituration det er også Barsk ville gi mange død celler. Unngå bobler under triturating. - Fyll 14 mL rund bunn rør som inneholder triturated vev strimler med KB løsning til et endelig volum på 7-10 mL avhengig av ønsket tetthet av celler for eksperimentell bruk. Plasser dette røret i romtemperatur i 1 time. Etter denne inkubasjonsperioden, kan celler brukes til en rekke eksperimenter for opp til 7 h. celler kan også lagres ved 4 ° c i opptil 7 timer.
Representative Results
Den atrieflimmer myocytter isolert ved hjelp av denne protokollen kan brukes til å karakterisere de elektrofysiologisk egenskapene til disse cellene ved hjelp av patch-klemme teknikk. Alikvoter av atrieflimmer myocytter i KB løsning kan legges til innspillingen kammer av en standard patch-klemme apparater og superfused med løsninger som passer for den type opptak eksperimenta ønsker å utføre. Atrieflimmer myocytter isolert ved hjelp av denne protokollen er best brukt for elektrofysiologisk studier innen 6-7 h av isolasjon. Representative patch-Clamp data fra vårt laboratorium er presentert nedenfor.
Figur 4 illustrerer eksempler på isolerte atrieflimmer myocytter fra normale mus utarbeidet ved hjelp av protokollen ovenfor. Isolerte myocytter er vanligvis på rekkefølgen av 100 μm i lengde og 10 μm i bredde med klare striations. Kapasitans av isolert atrieflimmer myocytter er vanligvis 40-70 pF.
Figur 5a illustrerer et eksempel på en atrieflimmer myocyte Ap registrert ved hjelp av perforert patch-Clamp teknikk i nåværende klemme modus, som vi har beskrevet tidligere6,19,20. Sammendragsdata som illustrerer typiske atrieflimmer myocyte AP-parametre er gitt i tabell 6. Nærmere bestemt presenterer vi sammendragsdata for målinger av potensialet for hvile membran (RMP), maksimal oppstrekningen hastighet (VMax), OVERSHOOT (OS) og Ap-varighet på 50% (APD50), 70% (APD70) og 90% (APD90) repolarisasjon tid (tabell 6). APs kan også registreres i hele celle konfigurasjonen14. Superfusion-og pipette-løsningene for innspilling av APs er tilgjengelige i Tabell 7 og tabell 8.
Figur 5B illustrerer en representativ familie av na+ strømninger (ina) registrert i hele cellen konfigurasjonen av patch-klemme teknikk. Disse strømmene ble registrert ved hjelp 50 MS spennings klemme trinn mellom-100 og + 10 mV fra et Holding potensiale-120 mV. Vi har beskrevet tilnærminger og protokoller for innspilling ina tidligere6,14,20. En oppsummering jegna IV forholdet er også presentert i figur 5B. Løsninger som brukes til å registrere jegna er presentert i Tabell 7 og tabell 8.
Figur 5c illustrerer en representativ familie av ca2 + strømninger (Ica, L) registrert i hele cellen konfigurasjonen av patch-klemme teknikk. Disse strømmene ble registrert ved hjelp 250 MS spennings klemme trinn mellom-60 og + 80 mV fra et Holding potensiale-70 mV. De eksperimentelle forhold som kan brukes til å måle jegca, har jeg vært tidligere beskrevet17,18,20. Et sammendrag ica, L IV forholdet er også presentert i figur 5c. Løsningene som brukes til å ta opp ica, L er tilgjengelig i Tabell 7 og tabell 8.
Figur 5D illustrerer en representativ familie av k+ strømninger (ik) registrert i hele cellen konfigurasjonen av patch-klemme teknikk. Disse strømmene ble spilt inn fra et Holding potensiale-80 mv ved hjelp av 500 MS spennings klemme trinn mellom-120 mv og + 80 mv, som vi har beskrevet tidligere6,14. Sammendraget IV forholdet for totalt jegK er også presentert i figur 5D. Løsningene som brukes til å ta opp iK , er tilgjengelige i Tabell 7 og tabell 8.
Ved hjelp av disse tilnærmingene til posten APs og store familier av ioniske strømninger, inkludert na+, ca2 + og K+ strømninger (som illustrert ovenfor), tillater etterforsker til strengt avhøre atrieflimmer myocyte elektrofysiologi i en mengde eksperimentelle forhold. Vårt laboratorium har rutinemessig ansatt disse teknikkene for å studere atrieflimmer myocyte elektrofysiologi i normale mus, i musemodeller av hjertesykdommer, og i genmodifiserte mus6,14,17,18 ,19,20.
Figur 1: flytskjema for myocyte isolasjons protokoll for atrieflimmer. Sammendrag av trinnene som brukes til å isolere atrieflimmer myocytter ved hjelp av denne protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksperimentell oppsett og disseksjon verktøy for atrieflimmer myocyte isolasjon. (A). en liten bar brann-polert pipette med en åpning 1 mm i diameter (venstre) brukes til vevs overføring etter disseksjon, en medium bar brann-polert pipette med en åpning 3 mm i diameter (midten) brukes til å overføre vev strimler under isolasjon, og en stor bar brann-polert pipette med en åpning 5 mm i diameter (høyre) brukes til trituration av fordøyd atrieflimmer. (B). eksperimentell oppsett for atrieflimmer myocyte isolasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilde av atrieflimmer vedheng disseksjon. (A). representative lyse feltet bilde av en excised atrieflimmer vedheng kuttet åpne og låste ut. (B). representative lyse feltet bilde av atrieflimmer vedheng skåret i vev strimler av ca 0,7 mm i bredde. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 4: bilder av isolert atrieflimmer myocytter. (A). Brightfield bilde av isolert atrieflimmer myocytter umiddelbart etter isolering. Scale bar = 50 μm. (B). Brightfield bilde av en enkelt isolert atrieflimmer myocyte. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative patch-Clamp data innhentet fra isolerte atrieflimmer myocytter. (A). representant stimulert Ap opptak fra en isolert atrieflimmer myocyte. Oppsummering av AP parametre er presentert i tabell 6. Amfotericin B (200 μg/mL) ble tilsatt til pipette løsningen for å permeabilize den cellulære membranen. (B). representative ina innspillinger (til venstre) og oppsummering ina IV Curve (høyre) fra en isolert atrieflimmer myocyte. Nifedipin (10 μM) ble lagt til den modifiserte Tyrode løsning for å blokkere jegca, L når innspillingen jegna. C. representative Ica, l -innspillinger (til venstre) og oppsummering ica, l IV-kurve (til høyre) fra en isolert atrieflimmer myocyte. (D). representant jegk innspillinger (til venstre) og oppsummering ik IV Curve (høyre) fra en isolert atrieflimmer myocyte. Løsningene som brukes til å registrere hver av disse strømmene er listet opp i Tabell 7 og tabell 8. Sammendrag IV kurver er gjennomsnitt målinger fra 10 atrieflimmer myocytter isolert fra en 15 ukers gammel mannlig wildtype C57Bl/6 mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stock Tyrode ' s pH 6,9 | Stock Tyrode ' s pH 7,4 | |
| Kjemiske | i mM | i mM |
| Nacl | 140 | 140 |
| KCl | 5,4 | 5,4 |
| KH2PO4 | 1,2 | 1,2 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Endelig volum | 500 mL | 1 den andre |
| Endelig pH med NaOH | 6,9 | 7,4 |
Tabell 1: Stock Tyrode ph 7,4 og lager Tyrode ph 6,9 løsninger. Sammensetning av lager Tyrode løsninger (pH 7,4 og pH 6,9) som kan gjøres på forhånd og oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 måneder.
| Kjemiske | i mM |
| K-glutamat | 100 |
| K-aspartate | 10 |
| KCl | 25 |
| KH2PO4 | 10 |
| MgSO4 | 2 |
| Taurine | 20 |
| Kreatin | 5 |
| EGTA | 0,5 |
| Glukose | 20 |
| HEPES | 5 |
| Bsa | 0,10 prosent |
| Endelig volum | 1 den andre |
| Endelig pH med KOH | 7,2 |
Tabell 2: endret KB-løsning. Oppskrift på modifisert KB løsning som kan gjøres på forhånd, aliquoted, og lagres ved-20 ° c i opptil 2 måneder.
| Kjemiske | Beløpet |
| Glukose | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM med |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| Stock Tyrode ' s pH 7,4 | 50 mL |
| Heparin | 250 μL |
Tabell 3: modifisert Tyrode pH 7,4-oppløsning med glukose, magnesium, kalsium og heparin. Sammensetningen av modifisert Tyrode ' s pH 7,4 løsning brukt for atrieflimmer disseksjon. Denne løsningen bør gjøres friskt og oppbevares i et vannbad på 35 ° c til den brukes.
| Kjemiske | Beløpet |
| Glukose | 18,5 mM |
| Taurine | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg |
| CaCl2 | 0,066 mM |
| Stock Tyrode ' s pH 6,9 | 15 mL |
Tabell 4: modifisert Tyrode pH 6,9-løsning som inneholder glukose, taurin, BSA og lite kalsium. Sammensetning av modifisert Tyrode ' s pH 6,9 løsning som brukes for atrieflimmer myocyte isolasjon. Denne løsningen bør gjøres friskt og oppbevares i et vannbad på 35 ° c til den brukes.
| Kjemiske | Beløpet |
| Kollagenase | 1 064 for U |
| Elastase | 9 av U |
| Protease løsning | 65,2 μL |
| Modifisert Tyrode pH 6,9 | 5 mL |
Tabell 5: enzymatisk løsning. Sammensetningen av enzymatisk løsning som brukes til å enzymatisk fordøye atrieflimmer. Denne løsningen bør gjøres friskt og oppbevares i et vannbad på 35 ° c til den brukes.
| Parameteren | Gjennomsnittlig |
| RMP (mV) | -74,2 ± 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 ± 5,8 |
| OS (mV) | 71,9 ± 3,0 |
| APD50 (MS) | 11,1 ± 1,7 |
| APD70 (MS) | 23,0 ± 4,6 |
| APD90 (MS) | 54,7 ± 7,8 |
Tabell 6: oppsummering av AP-parametre fra isolerte myocytter. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM, n = 10 atrieflimmer myocytter isolert fra en 15 ukers mannlig wildtype C57Bl/6 mus.
| Kalium strømmer og APs | Natrium strømmer | Kalsium strømmer | |
| Kjemiske | i mM | i mM | i mM |
| Nacl | 140 | 5 | |
| KCl | 5,4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Glukose | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| CsCl | 130 | ||
| TE-CL | 5,4 | 145,5 | |
| Ph | 7,4 med NaOH | 7,4 med CsOH | 7,4 med CsOH |
Tabell 7: sammensetning av Tyrode løsninger brukt under patch-Clamp eksperimenter. Sammensetningen av Tyrode løsninger som brukes til å registrere APs, jegna, jegca, L, og jegK fra isolert atrieflimmer myocytter.
| Kalium strømmer og APs | Natrium strømmer | Kalsium strømmer | |
| Kjemiske | i mM | i mM | i mM |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| KCl | 140 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| MD-phosphocreatine | 6,6 | 6,6 | |
| CsCl | 130 | 135 | |
| BAPTA | 5 | ||
| Ph | 7,2 med KOH | 7,2 med CsOH | 7,2 med CsOH |
Tabell 8: sammensetning av intern pipette løsning som brukes under patch-Clamp eksperimenter. Sammensetning av pipette fyllings løsninger som brukes til å registrere APs, jegna, ica, L, og jegK fra isolert atrieflimmer myocytter.
Discussion
Vår Lab rutinemessig bruker denne protokollen til å isolere musen atrieflimmer myocytter for bruk i patch-Clamp eksperimenter for å undersøke virkningene av ulike former for hjerte-og karsykdommer, genetiske mutasjoner, eller farmakologiske forbindelser på atrieflimmer myocyte elektrofysiologi. Selv om det er svært reproduserbar, avhenger kvaliteten av dataene fra den isolerte atrieflimmer myocytter av kvaliteten på isolasjonen. I tillegg vil gjeninnføringen av kalsium etter atrieflimmer myocyte isolasjon føre til celle død for en befolkning på isolerte myocytter på grunn av kalsium paradokset16. Følgelig, isolere levedyktig, høy kvalitet atrieflimmer myocytter ved hjelp av denne tilnærmingen krever praksis og optimalisering på flere punkter i hele isolasjonen. Når optimalisert, er det anslått at mellom 70-90% av den totale atrieflimmer myocytter isolert ved hjelp av denne tilnærmingen vil være både kalsium tolerant og stang formet. Trinnene som krever mest praksis og optimalisering er diskutert nedenfor.
Hastigheten og effektiviteten av disseksjon vil ha nedstrøms effekter på kvaliteten på de isolerte cellene. Det er viktig å ta tid å sikre at alle blod er fjernet fra atrieflimmer og at vev strimler er kuttet til en tilsvarende størrelse. Det bør ta ca 5 min å fjerne atrieflimmer vedheng, kutt vevet i strimler, og overføre vevet strimler inn i det første røret av modifisert Tyrode ' s pH 6,9 løsning. Men hvis dette trinnet tar for lang, kan kvaliteten på vevet bli kompromittert.
Det er også viktig at vev strimler er skåret til en enhetlig størrelse innenfor en isolasjon og mellom hjerter. Hvis vevs strimler er for store eller for små, eller hvis de ikke er ensartet innenfor en isolasjon, kan dette føre til problemer under både enzymatisk fordøyelse og trituration. Dette er fordi små strimler vil bli mer grundig fordøyd og store strimler vil være under fordøyd. Det er like viktig å vurdere genotype og sykdoms innstillingen blir studert som størrelsen på atrieflimmer vedheng kan variere mellom dyr. For eksempel, hypertrofisk hjerter har større atrieflimmer vedheng sammenlignet med sunne hjerter, og derfor eksperimentator kan kutte flere strimler i hypertrofisk hjerter i forhold til normal størrelse hjerter. Følgelig vil optimering av størrelsen på vevs strimlene og bruk av disse dimensjonene på hver enkelt atrieflimmer vedheng i stor grad forbedre reproduserbarheten av myocyte isolasjoner mellom eksperimentelle forhold.
Den delikate balansen mellom enzymatisk fordøyelse og mekanisk dissosiasjon er nøkkelen til en vellykket atrieflimmer myocyte isolering ved hjelp av denne protokollen. Hvis vevet ikke er tilstrekkelig virvlet under enzymatisk fordøyelsen de enkelte vev strimler vil tendens til å klump og holde sammen, noe som vil begrense effektiviteten av enzymatisk fordøyelsen. Hvis opprørt for ofte eller kraftig, kan dette skade atrieflimmer, noe som vil resultere i isolering av uholdbare celler. Mekanisk dissosiasjon av isolerte myocytter fra vevs strimler under trituration er det mest kritiske steget for å øve og optimalisere bruken av denne tilnærmingen for å isolere atrieflimmer myocytter. Hvis trituration er for skånsom, vil celle utbyttet være lav. På den annen side, hvis trituration er for harde, så en overflod av ikke-levedyktig myocytter vil bli isolert, og kvaliteten på data innhentet under patch-Clamp eksperimenter vil bli jeopardized. I tillegg kan sammensetningen av Atria påvirke isolasjonen. For eksempel, hvis vev er antifibrotiske, enzymatisk fordøyelsen og de trituration trinnene må kanskje endres. Det er derfor viktig å ta seg tid til å utvikle de ferdighetene som kreves for å oppnå høy kvalitet celler under trituration som kan brukes til patch-klemme eksperimenter.
Som med alle eksperimentelle teknikker er det begrensninger. Denne teknikken krever praksis for å reproduserbar isolere levedyktig, høy kvalitet myocytter, som igjen vil påvirke muligheten for eksperimenter som skal utføres ved hjelp av disse myocytter. Denne tilnærmingen er også terminal og atrieflimmer myocytter isolert ved hjelp av denne tilnærmingen kan brukes på dagen av isolasjonen bare. Vår Lab bruker cellene innen 6-7 h av isolasjon.
Denne tilnærmingen av å isolere atrieflimmer cardiomyocytes har flere programmer. For eksempel, denne tilnærmingen kan endres for å isolere atrieflimmer myocytter (så vel som CARDIAC fibroblaster) fra andre arter, inkludert humant atrieflimmer vev biopsier. I tillegg er en fordel å bruke denne blings metode for atrieflimmer myocyte isolasjon (i motsetning til retrograd av hjertet) er at det kan endres for å isolere cardiomyocytes fra andre områder av hjertet, for eksempel sinoatriell node eller andre bestemte regioner av atrieflimmer myokard, eller omfatte hele supraventrikulær regionen i hjertet. Vår Lab bruker atrieflimmer cardiomyocytes for patch-Clamp eksperimenter for å måle handlings potensialer og ioniske strømninger, selv om denne tilnærmingen ikke trenger være begrenset til denne teknikken. Isolerte myocytter kan for eksempel brukes til å undersøke endringer i kalsium-transienter og contractility i en rekke eksperimentelle innstillinger. Atrieflimmer cardiomyocytes kan også brukes i immunofluorescence studier for å studere plasseringen av proteiner eller strukturer av interesse. Følgelig er denne tilnærmingen svært allsidig med mange mulige bruksområder.
Disclosures
Forfatterne har til ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av operasjonelle tilskudd fra Canadian Institutes of Health Research (MOP 93718, 142486) og hjertet og Stroke Foundation of Canada til R.A. Rose. H.J. Jansen er mottaker av en Killam postdoktor Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M.
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J.
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S.
- Grant, A. O.
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
