Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/59598
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 1,4, 1
1Dept. of Stress Neurobiology and Neurogenetics, Max Planck Institute of Psychiatry, 2Graduate School of Systemic Neurosciences, Ludwig Maximilians University, 3Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 4Dept. of Neurobiology, Weizmann Institute of Science

Summary

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

Abstract

מיקרוסקופ שני פוטון הוא כלי בסיסי עבור מדעי המוח כפי שהוא מתיר את החקירה של המוח של בעלי חיים בקנה מידה מרחבית החל ברמות subcellular לרשת בקנה מידה זמני מאלפיות שנייה עד שבועות. בנוסף, הדמיה של שני פוטונים ניתן לשלב עם מגוון רחב של משימות התנהגותיות כדי לחקור את היחסים סיבתי בין תפקוד המוח לבין התנהגות. עם זאת, ביונקים, חדירה מוגבלת ופיזור של אור יש מוגבלים שני פוטון הדמיה הדמיית בעיקר אזורי המוח השטוליות, ובכך מקלה בחקירת האורך של אזורים במוח עמוק כגון ההיפוקמפוס. ההיפוקמפוס מעורב ניווט מרחבי הזיכרון האפיזודי והוא מודל ארוכת טווח המשמש לחקר הסלולר, כמו גם תהליכים קוגניטיביים חשובים ללמידה ולהיזכר, הן בבריאות ומחלות. כאן, הכנה המאפשרת גישה אופטית כרונית ההיפוקמפוס הגב בעכברים חיים מפורט. הכנה זו יכולה להיות משולבת עם שני פוטון הדמיה אופטית ברזולוציה הסלולר הדו הנייד בראש קבוע, מורדם עכברים חיים במשך מספר שבועות. טכניקות אלו מאפשרות הדמיה חוזרת של המבנה העצבי או של הפעילות-מעורר הפלסטיות בעשרות מאות נוירונים ב היפוקמאל CA1. יתרה מזו, ניתן להשתמש בתכשיר כרוני זה בשילוב עם טכניקות אחרות כגון מיקרו-אנדוסקופיה, מיקרוסקופ שדה רחב ושלושה פוטון, ובכך להרחיב באופן משמעותי את ארגז הכלים כדי ללמוד תהליכים סלולריים וברשת המעורבים בלמידה ובזיכרון.

Introduction

ב יונקים, ההיפוקמפוס הוא אזור המוח מפתח עבור קידוד והחזרה של זיכרונות האפיזודי, כמו גם עבור ניווט מרחבי1,2,3,4. מסיבה זו, ההיפוקמפוס כבר-ועדיין הוא-מודל חשוב מאוד ללמוד את המנגנונים הבסיסיים המאפשרים למוח לקודד ולהיזכר זיכרונות5,6,7 או לנווט בסביבה8 ,9 איסוף התגמולים והימנעות סכנות. בנוסף, היווצרות ההיפוקאמאל הוא אחד מאזורי המוח שבו נוירונים חדשים נוצרים במהלך החיים של מכרסמים10,11 , ואולי, של בני אדם12,13. בסופו של דבר, ניוון או פגיעה של היווצרות ההיפוקמפוס קשורים להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל מחלת אלצהיימר14.

בעכברים, ההיפוקמפוס ממוקם כ 1 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח15. מיקומו מונע גישה אופטית במוח שלם וכתוצאה מכך, מחקרים האורך של היפוקמאל דינמיקה הסתמך בעיקר על תהודה מגנטית (MR) דימות, אלקטרופיזיולוגיה, ו לשעבר ניתוח הדמיה vivo. שיטות הדמיה של MR מאפשרות מעקב אחר תהליכים ביולוגיים (g., ביטוי גנים שינויים16) באותה חיה על פני מספר ימים, אבל חוסר הרזולוציה המרחבית להפלות נוירונים בודדים. קלאסי בטכניקות vivo אלקטרופזיולוגים להציע רזולוציה גבוהה מאוד הזמני רגישות מעולה לשינויים פוטנציאל הממברנה. עם זאת, יש להם רזולוציה מרחבית מוגבלת ואין להם את היכולת לעקוב באופן אמין את אותם תאים במשך תקופות זמן ארוכות יותר. הדמיה אופטית מאפשרת תהליכים מגוונים יותר להיות לומדים על ידי הכוח של הזמן הגבוה שלה רזולוציות מרחבית. עם זאת, vivo לשעבר הדמיה מספקת רק תמונות של תהליכים שוטפים, ולכן הוא אינו מתאים למחקרים האורך שבמהלכו בעלי החיים לומדים ולהיזכר מידע.

In vivo הדמיה אופטית משלבת כמה יתרונות של MR הדמיה ו אלקטרופיזיולוגיה עם אלה של דימות אופטי. לכן, הוא מתאים מאוד לניתוח האורך והקורמתי של הדינמיקה של מוח העכבר והתנהגות. זה רלוונטי במחקרים של תהליכים ביולוגיים עם מהיר מאוד (אלפיות שנייה לשניות) או איטי מאוד (ימים עד שבועות) קשקשים זמן. דוגמאות לתהליכים מסוג זה הרלוונטיים למדעי המוח הם דינמיקה של מתח ממברנה, Ca2 + ארעיות, פלסטיות סלולרית ושינויים מבניים, אשר כולם מאמינים להיות מאוד חשובים עבור היווצרות זיכרון ולהיזכר. שיטות שונות האריכו הדמיה vivo להיפוקמפוס החדש18,19,20,21,22. ההכנות החריפה אפשרו את המעקב אחר הפעילות של תא השדרה (PN) כמו גם הדנדריטים שלהם ואת הקוצים הדנדריטי במשך מספר שעות20,22. לעומת זאת, מסגרת זמן זו אינה מאפשרת שינויים מבניים לטווח ארוך, שעלולים להיות בלתי מצטברים ללמידה, ללמוד. ההכנות כרוניות-בשילוב עם מיקרו אנדוסקופים23,24 או עם מרחק עבודה ארוך (WD) יעדי מיקרוסקופ רגיל21 -יש להפעיל הדמיה חוזרת של ההיפוקמפוס החדש על פני מספר שבועות.

כאן, אנו מתארים הכנה כרונית המספקת גישה אופטית חוזרות לשדה המשנה CA1 של ההיפוקמפוס החוזר של עכברים חיים באמצעות צינורית הדמיה שנוספה לצמיתות. הכנה זו מאפשרת גישה חוזרת אל CA1 ללא הפרעה תפקודית והיא מתאימה ל-intravital שני פוטון (2P) או הדמיה של שדה רחב. שתי דוגמאות של 2P מוחי עמוק הדמיה כרונית ב CA1 של עכברים חיים מפורטים: האורך הדמיה של המבנה הדנדריטי הדינמיקה השדרה הדנדריטי האורך הדמיה של פעילות-מעורר פלסטיות. היתרונות והמגבלות הבולטים של הטכניקה נדונים.

Protocol

כל השיטות המתוארות אושרו על ידי ממשלת בוואריה העליונה (רישיון 2016_ ROB-55.2 וטרינר-2532. Vet_02-16-48) ועל ידי סטנפורד ו מקס פלאנק פלורידה המכון ללוחות מדעי המוח על טיפול בבעלי חיים במעבדה.

1. הכנת צינורית ההדמיה

  1. החזיקו מקדחה מדויקת על דוכן מקדחה שסופק עם שולחן הסרגל הניתן להזזה.
  2. קלאמפ 3.0 מ"מ קוטר מפלדת אל-חלד אל השולחן בסרגל ההזזה.
  3. חותכים את הצינור לטבעת מתכת באורך 1.6 מ"מ. אם הקצוות של הטבעת לא בוטה אחרי גזירה, לתייק את אי סדרים.
  4. לשטוף את הטבעת מתכת 4 מילימטר קוטר שמיכות זכוכית ב 100% אצטון ולהשאיר יבש עבור ≈ 5 דקות.
  5. הניחו את טבעת המתכת ואת שמיכות הזכוכית על מקום חלק, אפילו ונקי בעבודה, תחת סטריאוסקופ.
  6. מניחים טיפה של דבק אופטי UV-ריפוי על משטח חלק, כגון צלחת פטרי. השתמשו במחט או במרית כדי לפזר את הדבק כדי ליצור שכבה דקה (< 0.5 מ"מ).
  7. השתמש מלקחיים לטבול צד אחד של טבעת מתכת לתוך דבק. שים לב במיוחד לא לאטום את החלק הפנימי של הטבעת. אם זה קורה, השתמש במחט כדי לשבור את הדבק האופטי בטבעת.
  8. באמצעות סטריאוסקופ, מקמו את טבעת המתכת במרכז שמיכות הזכוכית עם הצד של הטבעת מכוסה על ידי דביק לגעת שמיכות. טבעת דקה של דבק צריך להיווצר בממשק בין טבעת מתכת לבין שמיכות. הימנע כל דבק מתפשט למרכז הcoverslip.
  9. הפעל את יחידת UV-ריפוי LED ואור לזרוח (365 nm) עבור 1 דקות.
    התראה: אור UV מעורר כוויות עור והוא סוכן מוטאנניק. להרכיב משקפיים הגנה UV ולכסות ידיים וזרועות עם כפפות ומעיל מעבדה כדי למנוע חשיפה לעור.
  10. כדי לרפא את הדבק באופן שווה, לוודא שכל הצדדים של הטבעת מוארים באותה מידה על ידי שינוי הכיוון של מקור האור.
  11. תנו לדבק להיות מרדן לפחות 2 שעות, עדיף, בן לילה.
  12. החזק את הצינורית בחוזקה מהקצה הפתוח של טבעת המתכת באמצעות דימום. באמצעות מקדחה שיניים מצויד בקובץ מסתובב ועובד תחת סטריאוסקופ, הקובץ את שמיכות זכוכית עודפת עד סומק עם הצדדים של הטבעת (איור 1A).

2. השרשה של צינורית ההדמיה על ההיפוקמפוס הגבי

  1. הכנת ציוד והקמה
    1. ודא שכל כלי הניתוח נקיים וסטרילי. בשעת שימוש בעיקור מזכוכית לעיקור, נקו את המכשירים והניחו אותם בעיקור (ש250 ° c) למשך 10 דקות, לפני השימוש. לחילופין, יש להפעיל את המכשירים לפני השימוש.
    2. הכינו את כל החומרים הדרושים לניתוח, כמו גם כלי ניתוח, כך שניתן יהיה להגיע אליהם בקלות.
    3. ודא שיש מספיק תרופות טריות כגון משככי כאבים או תרופות אנטי דלקתיות.
    4. יש לוודא שאין מספיק בסיס למשך כל הניתוח (כ-1 h לכל ניתוח).
    5. הפעל את שטיח החימום והגדר אותו ל-37 ° צ' כדי לשמור על טמפרטורת החיים יציבה בזמן שהוא תחת הרדמה.
    6. ודא שמערכת הניקוי של isofלאנה מתפקדת.
    7. . פתח את שסתום זרימת החמצן
  2. אינדוקציה להרדמה וקיבוע בעלי חיים
    1. הניחו את העכבר בתא ההרדמה ב-3% isofלאנה ב-1 L/min O2 והמתן עד שיאבד את הכרתו. הערכת הרדמה באמצעות. בדיקת רפלקס הבוהן
    2. . שוקלים את החיה
    3. החלת אנטי דלקתיות (מלוקסיעם, 1mg/Kg) ואת הרוצח כאב (Vetalgin 200 מ"ג/ק"ג) תרופות תת-עורי.
    4. מקמו את העכבר על שטיח החימום. ודא כי בעל החיים אינו במגע ישיר עם שטיח החימום כדי למנוע כוויות תרמיות.
    5. אבטחו את הראש למנגנון הסטרטקטיק. ומקמו את הקונוס כדי לכסות את האף , כדי לשמור על הרדמה. הנמך את הפחת ל-1.5-2% לאורך כל הניתוח, לפקח על מצב העכבר על ידי הניטור חזותית הנשימה ועל ידי בדיקה הבוהן צביטה רפלקס. במידת הצורך, ויסות אחוז.
    6. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע התייבשות ועיוורון פוטנציאלי.
      הערה: עבור תרופות הרדמה ובעלי חיים, שיטות אלטרנטיביות ותרופות אפשריות. בבקשה, התייחס לרשיון החיים שלך. ולספרות היחסית
  3. צינורית אופטית
    1. . תדליק את מקור האור של הסיב האופטי
    2. הסר את השיער וחטא את העור על ראש העכבר.
    3. באמצעות מספריים מלקחיים, להסיר את הקרקפת של העכבר. להתחיל על ידי עשיית חתך קטן בקרקפת בעמדה קרוב למדא. להמשיך על ידי פתיחת הקרקפת על שני הצדדים. הצעד הראשון לאחר מכן לכיוון של אוזניים, ואז rostrally, לכיוון מסלולים העין, כדי ליצור משולש על ציר משונן, כ 4 מ"מ rostral לברגמה. שים לב לא לחתוך קרוב מדי לאוזניים ולעיניים, אבל לחשוף את הברגמה ואת למדא, כמו גם עצמות הקודקוד ואת החצי האחורי של עצמות המצח.
    4. להחיל טיפה אחת (≈ 10 מ"ג) של לידוקאין (28.9% v/v באלכוהול) לגולגולת.
    5. נקה את הקרום וייבש את הגולגולת בעזרת משטח כותנה.
    6. מקם את פסי האוזן, כדי לתקן את ראש העכבר.
    7. בצע פתיחת גולגולת קטנה, באמצעות מיקרו מקדחה עם בר 0.5 מ"מ ברוחב. הצב את החור לתוך העצם הקדמית מול ההיפוקמפוס של התמונה, כ 1.5 מ"מ מ תפר משונן ו 2 מ"מ מרחוק תפר ילתית.
    8. בורג 0.86 mm-רוחב העצם נירוסטה בורג לתוך חור הגולגולת.
    9. אם יש צורך, נקו את ההריסות ויבשו את הגולגולת.
    10. הכנת תערובת של מלט דבק מהיר
      1. באמצעות כפית קטנה (≈ 4.5 מילימטר קוטר), מוותר 1-1.5 כפות ברמה של L-אבקת לתוך ערבוב היטב.
      2. מחלק 3-4 טיפות של בסיס מהיר לתוך הבאר.
      3. . משחרר את הזרז האוניברסלי לבאר
      4. מערבבים את התערובת עבור 5-10 s באמצעות המוליך דיוק.
        הערה: המלון מציע שלט אלטרנטיבי. נא עיין בהוראות היצרן.
    11. השתמש המוליך דיוק להחיל מלט דבק מהיר על הגולגולת, בורג והעור המקיף. . תנו לו להתייבש ל -30 עד 1 דקות
    12. השתמש בתרגיל של 3.0 מ"מ בקוטר מילימטר כדי ליצור פתיחת גולגולת בעצם הקודקוד. מקמו את החור כ 1.5 מ"מ מרחוק תפר משונן ו 2 מ"מ מרחוק מהתפר של למדואיד.
    13. הסר בזהירות את כנף העצם.
    14. בדקו את גודל פתיחת הגולגולת בעזרת הצינורית כדי לוודא שהיא מתאימה. השתמש 0.5 מ"מ או 0.9 מ"מ רוחב מיקרו מקדחה כדי להגדיל את הפיום במקרה הצורך.
    15. הסירו את מניכי הקרום. בעזרת מלקחיים של דומונט
    16. . להגיע לקפסולה החיצונית השתמש בקוטר 0.9 מ"מ (19 מד) מחט קהה מחובר למשאבת ואקום. השטיפה עם תמיסת מלח כדי למנוע התייבשות של הרקמה החשופה לשטוף את דם שיורית לאחר הדימום נפתרה. למצוץ רקמות בקליפת המוח לאט, ≈ 50-100 יקרומטר בכל פעם, עד קליפת המוח מתנתק מן הקפסולה, חשיפת סיבי cingulum או callosum קורפוס. לשנות את המחט לעתים קרובות, כדי למנוע סתימת.
    17. סיבים מתרחבים בעיקר בשלושה כיוונים (איור 1B). לקלף בזהירות את הסיבים האלה עד הסיבים העמוקים ביותר (מכתשי של ההיפוקמפוס) חשופים.
    18. לשטוף את הרקמה עם תמיסת מלח. השתמש מלקחיים דקים לטבול צינורית התחתון לתוך תמיסת מלח ולמקם אותו מעל חור הגולגולת. מלוחים ורקמות יש לאטום על ידי תמיסת מלח כדי למנוע השמנה של בועות אוויר בין הצינורית והרקמה.
    19. דחף את הצינורית לתוך הגולגולת (איור 1C) עד שcoverslip זכוכית במגע עם הסיבים.
    20. לייבש את הגולגולת היטב באמצעות משולשים ספיגת, כותנה מטליות ו/או משאבת ואקום.
    21. הכנת תערובת של מלט דבק מהיר (עיין בשלב 2.3.10).
    22. השתמש המוליך דיוק להחיל מלט דבק מהיר על הגולגולת. החלת דבק גם על שפת הצינורית. היזהרו לא לתת לדבק להיתקל בצינורית. . תנו לו להתייבש ל -30 עד 1 דקות
    23. השתמש בזרוע סטריאוטקלית כדי למקם צלחת מחזיק ראש על הצינורית, במגע עם הגולגולת.
    24. הכנת תערובת של אקריליק שיניים
      1. באמצעות כפית (≈ 9 מ"מ קוטר), לתת 1 סקופ ברמה (1 חלק) של אבקה לתוך ערבוב היטב.
      2. לחלק 2-3 חלקים של נוזל באותו הבאר. . כסו את כל האבקה עם הנוזל
      3. מערבבים עבור ≈ 1 דקות באמצעות מרית.
        הערה: אקרילטים חלופיים זמינים. נא עיין בהוראות היצרן.
    25. השתמשו במרית או במוליך מדויק כדי למרוח אקריליק על הגולגולת. מכסים את הגולגולת החשופה כולה, את הבורג ואת העור הפתוח עם אקריליק שיניים. . זה הופך את ההכנה ליציבה אל תתנו אקריליק לרוץ במורד הצוואר, האוזניים והעיניים.
    26. תנו לאקריליק להתייבש ולהקשיח במשך כ -15 דקות.
    27. החל סרט דבק נשלף על צלחת המחזיק בראש, כדי למנוע את ההריסות להיכנס צינורית. מומלץ שגודל הסרט יתאים לזו של הלוחית.
    28. לכבות את זרימת isof, להסיר את החיה ממנגנון סטריאוטקטיקה ולמקם אותו על צלחת חימום לשמור על טמפרטורת הגוף הפיסיולוגיים בזמן שהוא מתעורר מן ההרדמה.
    29. עקוב אחר בעל החיים עד שהיא מגיעה לתודעה מספקת כדי לשמור על שכיבה.
    30. החזר את החיה שעברה ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים רק כאשר התאושש לחלוטין.

3. טיפול פוסט-פעיל

  1. בדוק את מצב העכבר עבור 2 ימים לאחר הניתוח, על ידי ניטור משקל והתנהגות כללית.
  2. החלת אנטי דלקתיות (מלוקסיעם, 1mg/Kg) ואת הרוצח כאב (Vetalgin 200mg/ק"ג) תרופות תת-עורי עבור יומיים לאחר הניתוח
    הערה: הליכי ניטור חלופיים, תרופות ומינונים אפשריים עבור טיפול פוסט-פעיל. בבקשה, התייחס לרשיון החיים שלך. ולספרות היחסית

4. הכנת מושב ההדמיה

  1. הפעל את הגדרת ההדמיה מראש ותן ללייזר להתחמם ולייצב, במידת הצורך.
  2. השלך את העכבר (עיין בצעד 2.2.1).
  3. השתמש מלקחיים כדי להסיר בזהירות את הסרט דבק מלוחית המחזיק בראש. החזק את העכבר ביד ואת צלחת בעל הראש עם האצבעות. הסר את הסרט בעדינות, כדי למנוע פגיעה בהכנה.
  4. למקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ, על השטיח החימום ולאבטח את הצלחת הראש למחזיק (איור 1D).
  5. הצב את חרוט האף כדי לכסות את החוטם ולהקטין את הפחת של 1.5-2%.
  6. החלת משחה אופטלמולוגית על עיני העכבר.
  7. נקו את צינורית ההדמיה על ידי שטיפה במים מפוהים. השתמש במזרק ובמחט דקה כדי לשחרר מים לתוך הצינורית ומשאבת ואקום כדי להסירו.

5. הפעלת הדמיה

  1. השתמש בהגדלה נמוכה, מטרות מרחק עבודה ארוכות כדי לבדוק באופן חזותי את הצינורית של מים שיורית, לכלוך, יושר ונוכחות של קרינה פלואורסצנטית.
  2. יישר את הצינורית לציר האופטי על-ידי התאמת זוויות הזרועות של בעל הראש.
  3. מעבר ל 25X 1.0 NA, 4 מ"מ WD או 40X 0.8 NA, 3 מ"מ WD, מטרות טבילה מים. מוסיפים מספיק מים מפוהים כדי למלא את הצינורית ולשמור על המים העודפים מעל הצינורית. הימנע היווצרות בועות אוויר.
  4. השתמש עירור 2P ואותות פלורסנט תמונה.
    הערה: פרוטוקול הדימות תלוי מאוד בזמן ובסולמות המרחביים לדימות. לפרטים על הגדרות הדימות ששימשו להפקת התמונות המוצגות במאמר זה, עיין בסעיפים המופיעים בתוצאות ובדיון.

Representative Results

כיוון שהצינורית ממוקמת בדיוק בCA1, ההיבט הגבי של הCA1 הוא העומד בפני המיקרוסקופ אם בהשוואה לאחד הגחוני. המיאלאוס הוא המבנה הגבוה ביותר העומד בעקבותיו על-ידי שכבה אורינס (SO), שכבה "מידאליון" (SP), שכבה רדיואטום ושכבה lacunosum מלקולס (סים), הרובד המרוחק ביותר ( דמויות 1b , ג). הדמיה האורך 2P של המבנה העצבי עם הרזולוציה subcellular ואת הפעילות-מעורר הפלסטיות עם רזולוציה הסלולר מוצגים כתוצאות מייצגות. כדי להלהיב את החלבון fluorophores ירוק פלורסנט (GFP), d2Venus ו TurboFP635, השנייה פעמו מאוד: לייזר ספיר מכוון 920 ננומטר משמש ואת כוח הלייזר הממוצע מותאם ל 5-25 mW במדגם. אורכי הגל הפליטה השונים מופרדים באמצעות מסנני פליטה ושאר צינורות פוטוליטיפייר.

האורך הדמיה של המבנה הדנדריטי הדינמיקה הדנדריטי.

להיקפית התווית בדלילות ולהמחיש את המבנה שלהם, קו העכבר הטרנסגניים Thy1-GFP (M line) משמש. Thy1-GFP עכברים לבטא cytoplasmic משופרת GFP תחת שליטה של היזם Thy1 באוכלוסייה דלילה, אקראית של היקפית25. באופן כללי, הציר העיקרי של CA1 היקפית הוא בניצב למישור הדמיה XY (איורים 1B, איור 2A וסרט משלים 1). הדנדריטים הבזליים מתרחבים ב-SO, מהסומה לכיוון הצינורית, ואילו הדנדריטים האפיפיורי והאפינל מרחיבים את הצינורית, בכיוון ההפוך (סרט משלים 1). כיוון שההכנות מותיר את הסיבים העמוקים ביותר של המואלאוס ללא פגע, מספר סיבי פלורסנט חוצים את שדה הראייה, ממש מתחת לצינורית, צריך להיות גלוי (איור 2A וסרט 1). ההכנה מאפשרת דימות של הדנדטים PN עם רזולוציית עמוד השדרה (איור 2 א-ג). כדי התמונה דנדריטים ו הדנדטים הדנדריטים, 25 x 1.0 NA, 4 מ"מ WD, המים טבילה המטרה מסחרי העדשה משמש.

עבור מעקב אורכי, מספר אזורי מוח בתוך שדה התצוגה של הצינורית מוגדרים במהלך הפעלת ההדמיה הראשונה. כל אזור מקביל לשטח של כ-240 x 240 יקרומטר ומכיל בין 1 ל -7 מקטעים דנדריטים (איור 2b). אזורים אלה ממופים באופן ידני למחסנית תלת-ממדית בעלת הגדלה נמוכה המציגה את תבנית הביטוי GFP באמצעי האחסון שמתחת לצינורית ההדמיה (איור 2A). לאחר מכן, 1 יקרומטר z-שלב התמונה ערימות של CA1 PN דנדריטים בסיס מנרכשים במרווחי זמן שונים (מ 24 שעות עד 3 ימים) עד כ 14 ימים (איור 2c). משך הדמיה ארוך יותר ומרווחי זמן אפשריים26. כל מפגש דימות נמשך כ-60 עד 90 דקות. למרות שרוב התמונות הן של השדרה הדנדריטי ב SO, זה גם אפשרי התמונה הדנדריטים הדנדטים האלכסוני הדנדריטים של SR (דמויות 2D-F). בנוסף לצפיפות עמוד השדרה, שיטה זו מאפשרת את המחקר של הדינמיקה של עמוד השדרה על ידי כימות ההישרדות שלהם, להרוויח ולאבד שיעורי26,27,28,29,30, מיכל בן 31 , 32. כדי להבקיע ולעקוב אחר השדרה הדנדריטי לאורך זמן (איור 2c), ממשק MATLAB מותאם אישית משמש. זה מאפשר את היישור של ערימות התמונה הנרכשים בנקודות זמן שונות תומך תיוג ידני של הדנדריטים ושדרה תוך מעקב אורך הדנדריטים ועמדות עמוד השדרה לאורך זמן26. חשוב לציין שיטה זו יכולה לשמש להבחנה (לכל נקודה בזמן, למעט הראשונה) בין שעון השדרה הדנדלי הקיים והנולד. זה חשוב כמו המחלקות השונות של השדרה הדנדריטי הם חשבו שיש תפקידים שונים ברכישת זיכרון ושמירה33.

האורך הדמיה של הפעילות-מעורר הפלסטיות.

לפעילות התמונה-מעורר הפלסטיות ב CA1 היקפית, האזור היפוקמאל הCA1 מוזרק עם וקטור נגיפי ביטוי הניאון הירוק מעורר יציבות d2Venus דרך צורה משופרת של הפעילות הסינפטית תגובה- האלמנט (E-הם) בתוך הקשת משפר/יזם ו פלורסנט אדום TurboFP635 דרך היזם Epgk 34. זה מאפשר רמות הדמיה של הפעילות-הCA1 הפלסטיות של מאות היקפית בכל חיה35. בהינתן תיוג צפוף מאוד של היקפית, בדרך כלל לא ניתן לפתור את הדנדריטים של CA1 היקפית (סרט משלים 2).

כדי לדמות את somata של CA1 היקפית, 40 x 0.8 NA, 3 מ"מ WD, המים המטרה טבילה העדשה משמש. עבור מעקב אורכי, 1 עד 9 אזורי מוח מוגדרים לכל עכבר במהלך הפעלת ההדמיה הראשונה. כל אזור מקביל לשטח של כ 300 x 300 יקרומטר ומכיל בין 50 ו 150 תאים (איור 3a). אזורים אלה ממופים באופן ידני לנקודות ציון של רקמות מקומיות הגלויות בהגדלה נמוכה יותר. לאחר מכן, 3 יקרומטר z-שלב התמונה ערימות נרכשים, אשר מקיף את SP של CA1 היקפית (איור 3a ו- סרט משלים 2) במרווחי זמן שונים (מ 24 h עד 6 ימים) עד כ 30 ימים. כל מפגש הדמיה נמשך כ 60 עד 90 min. E-הם הפעלה פסגות 6 כדי 8 h לאחר חשיפה לסביבה חדשה או מועשרת (EE, איור 3B) ו מדקגות במהלך כמה ימים. כך, אנו בדרך כלל תמונה 6 כדי 8 h לאחר החוויה ולאפשר 5 ימים בין הפעלות הדמיה35.

כדי לכמת d2Venus ו TurboFP635 הערכים הפלואורסצנטית, אזור עגול-of-הריבית 4.64 יקרומטר בקוטר מצויר, אשר קטן יותר גוף התא העצבי, ממורכז תא הסומה. לאחר מכן אנו מתקדמים לנקודת הזמן הבאה, ציון הסומה של אותו תא באותו אופן, ו חזר הליך זה עבור כל נקודות הזמן וכל התאים הגלויים בערכת הנתונים האורך. הערך הממוצע של כל תא העצב (תלוי פעילות) d2Venus פליטה מנורמל על-ידי ממוצע שלה (לא תלוי פעילות) פליטת TurboFP635. שיטה זו מאפשרת חקירה של הדינמיקה ארוכת טווח של הרכב הפלסטיות של CA1 היקפית35 (איור 3c).

Figure 1
איור 1: הכנה לדימות אופטי vivo מוח עמוק. (א). תצוגות מובילות (משמאל) ומימין לדוגמה של צינורית הדמיה. ליצירת צינורית הדמיה יש תחתית זכוכית שקופה כדי לאפשר גישה אופטית ההיפוקמפוס. (ב). תיאור סכמטי של ההכנה המדגיש את המיקום היחסי של צינורית ההדמיה, CA1 PN ושלוש השכבות של סיבים מהגעד הגייתי. (ג, ד). תיאור סכמטי של כיוונון ההדמיה (C) ושל קיבוע בעלי החיים (D) במהלך הפעלת הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה האורך של המבנה הדנדריטי הדינמיקה הדנדריטי. (A). 2p מחסנית תמונה (הקרנה בעוצמה מרבית (mip) של 59 מטוסי תמונה, 2 יקרומטר z-מרווח) של נוירונים ו דנדטים המסומנת על ידי gfp בעכבר Thy1-gfp חי. (ב). הגדלה גבוהה יותר (mip של 53 מטוסי תמונה, 1 יקרומטר מרווח z) המפרט הדנדריטים הבזטים הממוקם SO. (ג). הזמן, רצף תמונה של קטע דנדריטי התמונה מעל 14 ימים. ראשי חץ מציינים שבשדרה. הדנדריטית מסומנים מעל 14 יום (ד, ה). 2P מחסנית תמונה של נוירונים ו דנדטים המסומנת על ידי GFP ב-Thy1 לחיות-GFP בעכבר; (ד) הקרנה מרושלת (31 מטוסי תמונה, מרווח של 3 מטרים) ו-(ה) תרשימי XY (17 מטוסי תמונה, 3 יקרומטר-z). (ו). בהגדלה גבוהה יותר (מישור תמונה בודדת) המפרט את הדנדריטים והקוצים הדנדריטים הממוקמים ב-SR. ראשי החצים מציינים שבעמודי הדנדריטים. הריגוש: 920 ננומטר; שיא פליטה: 510 ננומטר. סרגלי קנה מידה: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D ו-E, 15 μm; F, 4 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: האורך הדמיה של הפעילות-מעורר הפלסטיות. (A). 2p תמונות (מטוסי תמונה בודדת) מתוך עכבר חי, המציגה את אותם תאים ביום בסיסי 0 ולאחר הנדסת חשמל ביום 1. (B). 2p ערימות התמונה (mips של 4-6 מטוסי תמונה, 3 יקרומטר z-מרווח) מציג דפוסי הפעלה E-הם ספציפיים לסביבה A (ימים 1, 19 ו-25) וסביבה B (ימים 7 ו -13). ירוק: d2Venus פלואורסצנטית. אדום: TurboFP635 פלואורסצנטית. הריגוש: 920 ננומטר; d2Venus פליטה שיא: 530 ננומטר; TurboFP635 פליטה שיא: 635nm. סרגלי קנה מידה: A, 20 μm; B, 10 μm. דמות זו השתנתה מ Attardo et al., 201835. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה של מבנה עצבי בהיפוקמפאל DG באמצעות שלושה פוטון (3P) מיקרוסקופ. (א-ח). 3P תמונות (מטוסי תמונה בודדת) של נוירונים ודנדריטים המסומנת על ידי GFP ב-Thy1 בשידור חי המפרט העכבר (A-E) היקפית ב CA1 ו (F-H) בתאי הגרניט ב-DG. הריגוש: 1400 ננומטר; שיא פליטה: 510 ננומטר. סרגל קנה מידה: 40 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1: שדה הדמיה של התצוגה בעכבר Thy1-GFP חי. 2p מחסנית תמונה (83 מטוסי תמונה, 7 יקרומטר z-מרווח) של נוירונים ודנדריטים המסומנת על ידי gfp (לבן) בעכבר Thy1-gfp חי המשתרעת מהחלק התחתון של הצינורית ל-הסים. כדי להסביר את הדעיכה של אות הזריחה עם עומק הולך וגובר, השתמשנו במעבר שאינו ליניארי של הרווח של צינורות פוטוטיפוטיפייר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים 2: הדמיה של פעילות-מעורר הפלסטיות. 2p מחסנית תמונה (28 מטוסי התמונה, 3 יקרומטר z-מרווח) של נוירונים ביטוי E-כתבת של רגל ביטוי בעכבר חי המקיף SP. ירוק: d2Venus פלואורסצנטית. אדום: TurboFP635 פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

כאן, הליך עבור הדמיה 2P חוזרות של הCA1 בעכברים חיים מתוארת. לאחר הניתוח, העכבר מתאושש בדרך כלל בתוך 2 ימים. ההליך גורם מינימלי astrogliosis26,43. דימום ובצקת אשר עשוי לעקוב אחר הניתוח הם בדרך כלל מחדש adsorbed בתוך 10 עד 14 ימים. באופן כללי, החל מ -14 ימים לאחר ההשתלה ואילך, ההכנה ברורה מספיק לביצוע הדמיה מלאה. הצלחת הניתוח אינה תלויה בעבודה בסביבה סטרילית. עם זאת, חיוני לשמור על רמה גבוהה של היגיינה, כדי למנוע סיבוכים עקב זיהומים הקשורים לניתוח. הדבר מתקבל על ידי ניקוי מדוקדק של כלי הניתוח לפני ואחרי הניתוח ובאמצעות התזת חום לפני כל שימוש (שלב 2.1.1). הצינורית האופטית מחזיקה במיכל נקי ומעוקר ושטפה בתמיסת מלח סטרילית ממש לפני ההשתלה. ביצוע שיטות ניתוח נפוצות של הידיים חיטוי וניקוי של התחנה הכירורגית הוא גם חשוב מאוד. התכשיר נשאר יציב ומאפשר הדמיה תאית וברזולוציה תת-תאית למספר שבועות26,35.

שלבים קריטיים, שינויים ופתרון בעיות.

חשוב לקלף את הקפסולה החיצונית עד לחשיפת הסיבים העמוקים ביותר. אי חשיפה של מכתשי עלול לגרום לחוסר יכולת להתמקד הסומה של היקפית, או ברזולוציה מופחתת הדמיה הדנדריטים הדנדריטי, בעת שימוש במטרות מסחריות עם 3-או 4-mm WD. למטרה זו, הוא שימושי לאחר מאוד מאוד באמצעות המחט בקוטר 0.9 מ"מ ולאחר מכן לעבור לקוטר 0.3 0.5 מ"מ (24-29 מד) המחט עבור שליטה עדינה יותר של יניקה בעת הסרת הסיבים האלה ביותר. לחילופין, מלקחיים עדינים ניתן להשתמש כדי להסיר את קליפת המוח שנותרה לאחר חשיפה סיבים36.

דימום במהלך הניתוח יכול להיות בעייתי, כמו דם מונעת את הנוף. מחכה הקריש לטופס ולאחר מכן שטיפה עם תמיסת מלח כדי לשטוף את הדם שיורית מומלץ. חזור על הנדרש.

התאמה חמימה בין הצינורית לבין הפיום מסייעת להגברת יציבות ההכנה על-ידי שמירה על הצינורית במקומה לפני יישום הבטון, במיוחד אם השפה החיצונית של הצינורית מגולפת עם הגולגולת. מאחר שגודל מקדחה הטרפין והצינורית מתאימים, התאמה רופפת יכולה להתעורר בגלל אי סדירות בצד הצינורית-הדורשת הרבה יותר כריתת גולגולת מתאימה (ראו שלב 2.3.14)-או מפתיחת גולגולת בלתי סדירה. יש לתייק כל צינורית אי-סדירות (שלבים 1.3 ו-1.12) והטרפין חייבת להיות מוחזקת בניצב לגולגולת עד להשלמת הפיום (שלב 2.3.12). הסרת הטרפין מהגולגולת לפני השלמת פתיחת הגולגולת עלולה לגרום לפעולת כריתת גולגולת לא סדירה.

מגבלות- -החלטיות ויציבות ההכנה.

קשה להעריך את ההשפעה של אבלציה קורטיקלית כפי שהוא מפרך כדי להגדיר במדויק את האזורים המושפעים ישירות ובעקיפין. באופן כללי, הניתוח מסיר חלק מקליפת המוח הקודקודית וחלק מקליפת החושים החזותית והגוף21. הקורנן אינו מקרין במישרין את ההיפוקמפוס ואת רקמת ההיפוקמאל לא נגע ולא נפגע. וחשוב מכך, הוכח כי השרשה של צינורית דימות אינה משנה את תפקוד ההיפוקאמאל באופן בלתי מפורש, ובמיוחד היפוקאמאל למידה21,36,37,38, 39. עדיין, זה יהיה חשוב לכמת עד כמה במידה הן הצינורית ואת החלק החיצוני של השתל (לוחית הראש המחזיק וכובע אקריליק שיניים) הם מcorticosterone כרוניים על ידי הערכת רמות דם ומשקל בלוטת יותרת הכליה בהשוואה עכברים שאינם מושתלים.

ההכנה בדרך כלל ממשיכה להיות יציבה משבועות ועד לחודשים26. בטווח הארוך, העור ואת הצמיחה העצם נוטים לתפוס את הכובע אקריליק כדי להגביר את חוסר היציבות של הכנת ההדמיה.

מגבלות אופטיות.

מיקרוסקופ 2p קונבנציונאלי מאפשר הדמיה עד בערך 1 מ"מ לתוך רקמות neoקורטיקלית40,41. בהתאם לכך, ניתן לצלם את הדנדריטים ואת הקוצים הדנדריטים הממוקמים ב-SR (איור 2D-F) או בסים36. עם זאת, הדמיה באמצעות צינורית מציב מגבלות על NA אפקטיבי. כדי להשיג את הרזולוציה המקסימלית, הקוטר והעומק של צינורית ההדמיה צריך להיות מותאם ל-NA הדמיה, כמו קטרים קטנים יותר בעומקים יותר יהיה קליפ אור של מטרות NA גבוהה. למשל, כאשר הדמיה עם 1.0 NA לטבילה מים המטרה באמצעות צינורית 1.6 mm ארוך, הקוטר הפנימי 3.65 מ מ"מ נדרש כדי לשמור על NA מלא. עם זאת, שימוש בצינורית בקוטר זה יגביר את הדחיסה על ההיפוקמפוס ועלול להשפיע על בריאות הרקמה, מסיבה זו, נשתמש בצינורית בקוטר קטן יותר. כאשר הדמיה עם 0.8 NA מטרה טבילה מים באמצעות צינורית 1.6 מ"מ ארוך, קוטר פנימי של 2.5 מ"מ יהיה מספיק כדי לשמור על NA מלאה. עם זאת, 0.8 NA מטרות טבילה מים יש WD קצר (3 מ"מ במקרה שלנו), אשר יכול למנוע התמקדות ב SP.

חישובים אלה חלים על מרכז שדה התצוגה בתחתית הצינורית. עם זאת, הזזת שדה ההדמיה של מבט צדדי-קרוב יותר לקצות הצינורית-או התמקדות עמוק יותר לתוך הרקמה-רחוק יותר ממשטח הזכוכית של הצינורית-עוד מקטין את NA אפקטיבי במישור המוקד וכך מפחית את הרזולוציה. פעולה זו תוביל לרזולוציה לא-הומוגנית על-פני אמצעי האחסון השונים של רקמת הדמיה ויכולה להיות דאגה לדימות כמותי ברזולוציה תת-תאית, במיוחד כאשר משתמשים בטכניקות ברזולוציה סופר כגון מיקרוסקופ 2P-היסטד42. בעיות אלה פחות חשובות בעת דימות ברזולוציה התאית.

. תנועה ברקמה

התנועה בתוך הרקמה הנובעת מנשימה ודופק בבעלי חיים מוזנחים-נוטה להחמיר יותר עם מרחק מוגבר מצינורית ההדמיה. ייתכן שהסיבה לכך היא שצינורית ההדמיה מחילה לחץ מכני על המוח ובכך מבטלת חלק מהתנועה באזור הצינורית (בדומה להכנות הנאוקורטיאנית). כך, למרות הדמיה של השדרה הדנדריטי אפשרי SR ו-סים, בידינו, זה חזק ביותר על גבי עד כדי ≈ 200 יקרומטר מהמשטח של הצינורית. כדי לפצות על התנועה, אנו משתמשים בסורקי תהודה ובממוצע לא מקוון. מספר תמונות (4 עד 6 חזרות) נרכשים למישור תמונה של מחסנית z במהירות המירבית הזמינה (30 מסגרות/s). כל החזרות עבור כל מטוס z הם לאחר מכן (באמצעות התוכנה המסחרית, AutoQuant), רשום (באמצעות ImageJ) והממוצע לתמונה אחת26. עבור הדמיה של somata, התנועה היא לעתים קרובות זניח על הרדמה35 ושני ממוצעים מספיקים לעתים קרובות כדי לפצות על חפצי תנועה.

יישומים או כיוונים עתידיים של השיטה .

ההכנה יכולה להשתלב עם מיקרו-אנדוסקופים26,43. מיקרו אנדוסקופים הם בדיקה אופטית נוקשה אשר להשתמש במעבר מעבר השבירה מדד (גרין) microlenses להנחות אור אל רקמות עמוקות18. השימוש במיקרו-אנדוסקופים מאפשר להשתמש בצינורית של קטרים קטנים יותר או אפילו לא בשום צינורית. עם זאת, מיקרו אנדוסקופים מסחריים מתוקנים פחות היטב עבור סטיות אופטיות יש NA נמוכה יותר מאשר מטרות מסחריות. הבדיקות הנוכחיות להגיע החלטות לרוחב ו צירית של ≈ 0.6-1 μm, ≈ 10-12 μm, בהתאמה17,18,44. השימוש במיקרו-אנדוסקופים מאפשר גם שילוב ההכנה עם ראש שטח משולב מיקרוסקופים45,46,47.

השיטה משאיל את עצמה גם לשימוש בעכברים לא מסוערים, והיא שימש לחקור פעילות תאית באמצעות Ca2 + חיישנים בעכברים הקבועים קבוע21,37,48,49. במקרים אלה, בשל סולמות הזמן המהיר של שינויי הזריחה, מומלץ לבצע רישום קו50. כמו כן ניתן להתאים את ההכנה לדימות של אזורי משנה אחרים של היפוקמאל כגון גירוס (DG)39,51,52. שילוב זה עם עירור 3p53,54 עם תדר 1 MHz לייזר פעמו מכוון 1400 nm, היינו מסוגלים התמונה עמוק יותר לתוך היווצרות היפוקמאל להגיע לשכבה המולקולרית, שכבת התאים הגרריר ואת ה פילוס של ה-DG (איור 4) ללא הסרת כיסה CA1.

לסיכום, אנו מציגים שיטה המספקת גישה אופטית להיפוקמפוס הגבי ומאפשרת מחקרים האורך והקשור של הדינמיקה של מבנה היפוקמאל ופעילות. טכניקה זו מרחיבה את אפשרויות הניתוח של תפקוד ההיפוקמאל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ה. א. פ. נתמך על ידי קרן שראם; החברה מקיימת תמיכה ב-C. T ו-W. G. L.Y. ו R.Y. נתמכים על ידי החברה מקס פלאנק והמכון הלאומי לבריאות (R01MH080047, 1DP1NS096787); א. ג. נתמך על ידי מענק FP7 ממועצת המחקר האירופית, התוכניות של eranet ו-I-CORE, המדען הראשי של משרד הבריאות, המשרד הפדרלי לחינוך ומחקר, רוברטו ורנטה רוכמן, ברונו וסימון ליך, ה מרכז נלה וליאון בנוזיו למחלות נוירולוגיות, המכון הישראלי למדעי המחקר ע ש הנרי חנוך והגנומיקה, הקרן הלאומית למדע, משפחת פרלמן, אדלייד, מרק בוסן, פראט ואירווינג מוסקוביץ '; א. א. נתמך על ידי אגודת מקס פלנק, קרן שראם והגרמני פורשונגססייגמיייסייבאטא (DFG). תמונות 3P נרכשו במהלך קורס מתקדם על טכניקות דימות מוחי במכון מקס פלאנק פלורידה למדעי המוח. הקורס המתקדם על טכניקות דימות מוחי נתמך על ידי אגודת מקס פלאנק, התוכנית המדעית של מדינת פלורידה מקס פלנק והתוכנית לשיתוף מכון מקס פלאנק פלורידה. אנו רוצים להודות Thorlabs, קוהרנטית ו SpectraPhysics עבור מתן תמיכה וציוד עבור מערכת הדמיה 2P/3P במהלך הקורס. אנחנו גם אסירי תודה להנרי האברלה ולמליסה אברלה לקבלת סיוע במערכת במהלך הקורס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Professional drill/grinder IBS/E Proxxon GmbH 28481 Pecision drill
MICROMOT drill stand MB 200 Proxxon GmbH 28600 Movable ruler table
MICRO compound table KT 70 Proxxon GmbH 27100 Movable ruler table
Machine vice MS 4 Proxxon GmbH 28132 Movable ruler table
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm Sawade R00303 Stainless steel tube for the cannula metal ring
Microscope Cover glass (4 mm round) Engelbrecht Medizin and Labortechnik Glass coverslips for the cannula glass
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui Hoffmann Group 713750 160 Manual files
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 Hoffmann Group 527230 4 Manual files
UV-Curing Optical Adhesives Thorlabs NOA81 UV-curing adhesive
UV Curing LED System, 365 nm Thorlabs CS2010 UV-curing LED driver unit
Stemi 305 Zeiss Stereoscope
Presto II NSK-Nakanishi Germany Z307015 Dental drill
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein MF Dental F837.014.FG Files for the dental drill
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob MF Dental G837.014.FG Files for the dental drill
Graefe Forceps - Straight / Serrated Fine Science Tools 11050-10 Forceps for the surgery
Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19008-05 0.5 mm width burr for the micro-drill
Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19008-09 0.9 mm width burr for the micro-drill
MicroMotor mit Handstück DentaTec MM11 Micro-drill for the craniotomy
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30 Dumont forceps for the surgery
Fine Scissors - ToughCut Fine Science Tools 14058-09 Scissors for the surgery
Trephine MW Dental 229-020 Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws Fine Science Tools 19010-10 0.86 mm width bone screws
Stereotaxic apparatus Kopf Stereotaxic apparatus
3-D-Gelenkarm Hoffmann Group 442114 Stereotaxic arm and plate holder
Aufnahme 2SM Hoffmann Group 442100 2SM Stereotaxic arm and plate holder
Hot Bead Sterilizers Fine Science Tools 18000-45 Glass beads sterilizer
Isofluran CP, Flasche 250 ml Henry Schein VET GmbH 798932 Liquid isoflurane for anesthesia
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer Harvard Apparatus GmbH 34-1040 Isoflurane vaporizer
Lab Active Scavenger Gropper Medizintechnik UV17014 Isoflurane scavenger system
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml Henry Schein VET GmbH 798566 Meloxicam, anti-inflammatory
Vetalgin 500 mg/ml MSD Tiergesundheit Vetalgin, pain killer
CMA 450 Temperature Controller Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH 8003770 Heating blanket
Bepanthen Augen- und Nasensalbe Bayer AG Ophtalmic ointment
KL 1500 LCD Schott Fiber optic light source
Xylocain Pumpspray AstraZeneca GmbH Lidocain, local anesthetic
Absorption Triangles - Unmounted Fine Science Tools 18105-03 Absorption triangles for the surgery
Parkell C&B Metabond clear powder L Hofmeester dental 013622 Quick adhesive cement
Parkell C&B Metabond Quick Base B Hofmeester dental 013621 Quick adhesive cement
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C Hofmeester dental 013620 Quick adhesive cement
Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379 Precision applicators for the surgery
Blunt needles 0.9x23 mm Dentina 0441324 Blunt needles
Blunt needles 0.5x42 mm Dentina 0452155 Blunt needles
Blunt needles 0.3x23 mm Dentina 0553532 Blunt needles
Kallocryl A/C Speiko 1615 Acrylic liquid component
Kallocryl Speiko 1609 Acrylic powder
Hydrofilm transparent roll Hartmann Adhesive film
Head plates Custom made 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium
Head plate clamp Custom made Head plate holder
Pedestal post holders Thorlabs PH20E/M Head plate holder
Stainless steel post Thorlabs TR30/M Head plate holder
Stainless steel post Thorlabs TR75/M Head plate holder
Stainless steel post Thorlabs TR150/M Head plate holder
Post connector clamps Custom made Head plate holder
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps Thorlabs MB3045/M Microscope stage
7" x 4" Lab Jack Thorlabs L490/M Microscope stage
Low profile face mask small mice Emka Technologies VetFlo-0801 Anesthesia facemask holder
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table Newport Floating table
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling Newport Floating table
Power Meter Model 1918-R Newport Power meter
X-Cite 120Q Excelitas Technologies Fluorescence lamp
Two-photon microscope Bruker Ultima IV Two-photon microscopes
Two-photon microscope Thorlabs Bergamo Two-photon microscopes
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 Olympus Objectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 Olympus Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 Olympus Objectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 Olympus Objectives
Ultafast tunable laser for 2P excitation Spectraphysics Mai Tai Deep See Excitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 2P excitation Spectraphysics InSight DS+ Dual beam Excitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 3P excitation Coherent Monaco Excitaiton lasers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O’Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press; Oxford University Press. (1978).
  2. Zola-Morgan, S., Squire, L. R. Memory Impairment in Monkeys Following Lesions Limited to the Hippocampus. Behavioral Neuroscience. 100 (2), 155-160 (1986).
  3. Squire, L., Zola-Morgan, S. The medial temporal lobe memory system. Science. 253 (5026), 1380-1386 (1991).
  4. Leutgeb, S., Leutgeb, J. K., Barnes, C. A., Moser, E. I., McNaughton, B. L., Moser, M. B. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
  5. Silva, A. J., Zhou, Y., Rogerson, T., Shobe, J., Balaji, J. Molecular and cellular approaches to memory allocation in neural circuits. Science. 326 (5951), 391-395 (2009).
  6. Tonegawa, S., Pignatelli, M., Roy, D. S., Ryan, T. J. Memory engram storage and retrieval. Current Opinion in Neurobiology. 35, 101-109 (2015).
  7. Poo, M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, (2016).
  8. O’Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
  9. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  10. Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anatomical Record. 145, 573-591 (1963).
  11. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  12. Sorrells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  13. Boldrini, M., et al. Human hippocampal neurogenesis persists throughout aging. Cell Stem Cell. 22 (4), 589-599 (2018).
  14. Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity — towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2017).
  15. Rosene, D. L., Van Hoesen, G. W., et al. The hippocampal formation of the primate brain. in Cerebral Cortex. Jones, E. G., et al. Chapter 9, Plenum Press. New York. 345-456 (1987).
  16. Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist. 17 (5), 539-559 (2011).
  17. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Reviewof Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  18. Jung, J. C., Schnitzer, M. J. Multiphoton endoscopy. Optics Letters. 28 (11), 902 (2003).
  19. Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
  20. Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution in vivo imaging of hippocampal dendrites and spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147-3151 (2004).
  21. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  22. Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid- for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (22), 8740-8745 (2012).
  23. Jung, J. C., Mehta, A. D., Aksay, E., Stepnoski, R., Schnitzer, M. J. In vivo mammalian brain imaging using one- and two-photon fluorescence microendoscopy. Journal of Neurophysiology. 92 (5), 3121-3133 (2004).
  24. Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  26. Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
  27. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  28. Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W. B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-265 (2005).
  29. Holtmaat, A. J. G. D., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
  30. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  31. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  32. Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34, 13948-13953 (2014).
  33. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (42), 177-187 (2011).
  34. Kawashima, T., et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods. 10 (9), 889-895 (2013).
  35. Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
  36. Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
  37. Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
  38. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
  39. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  40. Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media. Optics Communications. 188, 25-29 (2001).
  41. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 mm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  42. Pfeiffer, T., et al. Chronic 2P-STED imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. eLife. 7, e34700 (2018).
  43. Barretto, R. P. J., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature Medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
  44. Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
  45. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  46. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
  47. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  48. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  49. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), aaa5694 (2016).
  50. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. SIMA: Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, (2014).
  51. Gonçalves, J. T., et al. In vivo imaging of dendritic pruning in dentate granule cells. Nature Neuroscience. 19 (6), 788-791 (2016).
  52. Danielson, N. B., et al. Distinct contribution of adult-born hippocampal granule cells to context encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
  53. Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 1 (1), 71 (1996).
  54. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).

Tags

התנהגות סוגיה 148 היפוקמפוס הדמיה אופטית ב vivo אורך עכבר שני-פוטון ניתוח הפלסטיות העצבית
אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ulivi, A. F., Castello-Waldow, T.… More

Ulivi, A. F., Castello-Waldow, T. P., Weston, G., Yan, L., Yasuda, R., Chen, A., Attardo, A. Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice. J. Vis. Exp. (148), e59598, doi:10.3791/59598 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter