Denne metoden beskriver en kronisk forberedelse som tillater optisk tilgang til hippocampus av levende mus. Dette preparatet kan brukes til å utføre langsgående optisk avbildning av neuronal strukturelle plastisitet og aktivitet-fremkalt cellulær plastisitet over en periode på flere uker.
To-Foton mikroskopi er et grunnleggende verktøy for nevrovitenskap som det tillater etterforskning av hjernen av levende dyr på romlige skalaer fra subcellulære til nettverksnivå og i timelige skalaer fra millisekunder til uker. Dessuten, to-Foton tenkelig kan kombinert med en variasjon av opptreden verv å utforske det årsakssammenheng imellom hjernefunksjonen og opptreden. Men i pattedyr, begrenset penetrasjon og spredning av lys har begrenset to-Foton intravital Imaging meste til overfladiske hjernen regioner, og dermed utelukker langsgående undersøkelse av dyp-hjerneområder som hippocampus. Hippocampus er involvert i romlig navigasjon og episodisk minne og er en langvarig modell som brukes til å studere mobilnettet, samt kognitive prosesser viktig for læring og tilbakekalling, både i helse og sykdom. Her er en forberedelse som gjør det mulig med en kronisk optisk tilgang til rygg og hippocampus i levende mus. Dette preparatet kan kombineres med to-Foton optisk bildebehandling ved cellulær og subcellulære oppløsning i hodet faste, anesthetized levende mus over flere uker. Disse teknikkene muliggjør gjentatt bildebehandling av neuronal struktur eller aktivitet-fremkalt plastisitet i titalls til hundrevis av neurons i rygg hippocampus CA1. Videre, denne kronisk forberedelse kan brukes inne kombinasjonen med annet teknikker som mikro-endoskopi, leder-montert bred åker mikroskopi eller tre-Foton mikroskopi, således høyeste ekspanderer det verktøyet å studere Cellular og nettverk prosesser involvert i læring og hukommelse.
I pattedyr, er hippocampus en viktig hjerne region for koding og tilbakekalling av episodisk minner samt for romlig navigasjon1,2,3,4. Av denne grunn har hippocampus vært-og fortsatt er-en svært viktig modell for å studere de grunnleggende mekanismene som gjør at hjernen til å kode og huske minner5,6,7 eller å navigere i et miljø8 ,9 samle belønninger og unngå farer. I tillegg er hippocampus formasjon en av hjernen regionene der nye neurons er generert gjennom hele livet til gnagere10,11 og, muligens, av mennesker12,13. Til slutt, degenerasjon eller svekkelse av hippocampus formasjonen er forbundet med nevrologiske og psykiske lidelser, inkludert Alzheimers sykdom14.
I mus, hippocampus ligger ca 1 mm under hjernen overflaten15. Dens posisjon har hindret optisk tilgang i intakt hjernen og følgelig, langsgående studier av hippocampus dynamikk har støttet seg for det meste på magnetisk resonans (MR) Imaging, elektrofysiologi, og ex vivo Imaging analyser. MR Imaging metoder tillate sporing av biologiske prosesser (f. eks, genuttrykket endringer16) i samme dyr over flere dager, men mangler romlig oppløsning å diskriminere enkelt neurons. Classic in vivo elektrofysiologisk-teknikker gir svært høy Temporal oppløsning og utsøkt følsomhet for endringer i membran potensialet. Men de har en begrenset romlig oppløsning og de mangler evnen til pålitelig spore de samme cellene over lengre tidsperioder. Optisk bildebehandling gjør at flere ulike prosesser kan bli studert i kraft av sine høye timelige og romlige oppløsninger. Men ex vivo Imaging gir bare øyeblikksbilder av pågående prosesser, og dermed er det ikke egnet for langsgående studier der dyrene lære og hente informasjon.
In vivo optisk bildebehandling kombinerer noen fordeler av MR Imaging og elektrofysiologi med de av optiske Imaging. Derfor er det svært godt egnet for langsgående og correlative analyser av mus hjernen dynamikk og atferd. Dette er relevant i studier av biologiske prosesser med svært rask (millisekunder til sekunder) eller svært langsom (dager til uker) tids skalaer. Eksempler for slike prosesser som er relevante for nevrovitenskap er membran spenning dynamikk, ca2 + transienter, cellulær plastisitet og strukturelle endringer, som alle antas å være svært viktig for minne formasjon og tilbakekalling. De ulike metodene har forlenget in vivo Imaging til rygg-eller hippocampus18, 19,20,21,22. Akutte preparater har tillatt sporing av pyramideformet Nevron (PN) aktivitet så vel som deres dendrites og dendrittiske pigger i flere timer20,22. Denne timelige tidsrammen tillater imidlertid ikke langsiktige strukturelle endringer, som kan ligger til grunn trinnvis læring, for å bli studert. Kroniske preparater-i kombinasjon med mikro-endoskoper23,24 eller lang arbeidsavstand (WD) standard mål for mikroskop21 -har aktivert gjentatt bildebehandling av rygg-hippocampus over flere Uker.
Her beskriver vi en kronisk forberedelse som gir tilbakevendende optisk tilgang til CA1 sub-feltet i rygg-mus hippocampus av levende musene ved hjelp av en permanent innsatt Imaging kanyle. Dette preparatet gir gjentatt tilgang til CA1 uten funksjonell forstyrrelse og er egnet for intravital to-Foton (2P) eller bred-feltet epifluorescence Imaging. To eksempler på 2P dype hjernen kronisk Imaging i rygg CA1 av levende mus er detaljert: langsgående Imaging av dendrittiske struktur og dendrittiske ryggraden dynamikk og langsgående Imaging av aktivitet-fremkalt plastisitet. De viktigste fordelene og begrensningene i teknikken diskuteres.
Her beskrives en prosedyre for gjentatt 2P avbildning av rygg CA1 i levende mus. Etter operasjonen, gjenoppretter musen vanligvis innen 2 dager. Prosedyren induserer minimal astrogliosis26,43. Blødning og ødem som kan følge operasjonen er vanligvis re-adsorberes innen 10 til 14 dager. Vanligvis, fra 14 dager etter implantation fremover er forberedelsene tilstrekkelig klart til å utføre intravital avbildning. Suksessen til operasjonen er ikke avhengig av å arbeide i et sterilt miljø. Det er imidlertid avgjørende å opprettholde et høyt nivå av hygiene, for å unngå komplikasjoner på grunn av kirurgi-tilknyttede infeksjoner. Dette oppnås ved omhyggelig rengjøring av kirurgiske instrumenter før og etter operasjonen og ved varme-sterilisering dem umiddelbart før hver bruk (trinn 2.1.1). Den optiske kanyle oppbevares i en ren, sterilisert beholder og skylles med sterilt saltvann rett før implantation. Utføre vanlige kirurgiske praksiser av hendene desinfeksjon og rengjøring av kirurgisk stasjon er også svært viktig. Forberedelsene forblir stabilt og tillater mobilnettet og subcellulære oppløsning Imaging i flere uker26,35.
Kritiske trinn, endringer og feilsøking.
Det er viktig å skrelle den utvendige kapselen til de dypeste fibrene er eksponert. Unnlatelse av å utsette alveus kan resultere i manglende evne til å fokusere på Soma av PNs, eller i redusert oppløsning Imaging dendrittiske pigger, når du bruker kommersielle mål med 3-eller 4-mm WD. Til dette målet, er det nyttig å ablate mektig svært langsomt ved hjelp av en 0,9 mm diameter nål og deretter bytte til en 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) nål for en finere kontroll av sug når du fjerner de mest rygg fibre. Alternativt kan fine tang brukes til å fjerne gjenværende cortex etter fiber eksponering36.
Blødning under operasjonen kan være problematisk, som blod hindrer visningen. Venter på at Clot å danne og deretter skylle med saltvann for å vaske bort rester av blod anbefales. Gjenta etter behov.
En tettsittende passform mellom kanyle og kraniotomi bidrar til å øke stabiliteten av preparatet ved å holde kanyle på plass før påføring av sement, spesielt hvis ytterkanten av kanyle er i flukt med skallen. Siden størrelsene på trephine Drill og kanyle er matchet, kan en løs passform oppstå på grunn av uregelmessigheter på siden av kanyle-som krever litt større craniotomies for å passe (se trinn 2.3.14)-eller fra en uregelmessig kraniotomi. Eventuelle kanyle uregelmessigheter må være innlevert av (trinn 1,3 og 1,12) og trephine må holdes vinkelrett på skallen til kraniotomi er fullført (trinn 2.3.12). Hvis du fjerner trephine fra hodeskallen før kraniotomi er fullført, kan det føre til uregelmessig craniotomies.
Begrensninger- Invasiveness og stabilitet av preparatet.
Det er vanskelig å evaluere effekten av kortikale ablasjon som det er krevende å presist definere områdene berørt direkte og indirekte. Generelt, fjerner kirurgi en del av parietal cortex og en del av den visuelle og hindlimb bentap sensoriske cortex21. Den ablated cortex ikke direkte prosjekt til hippocampus og hippocampus vev er verken rørt eller skadet. Viktigere er det vist at implantation av en Imaging kanyle ikke grovt alter hippocampus funksjon og spesielt hippocampus-avhengige læring21,36,37,38, i 39. Likevel, det ville være viktig å kvantifisere i hvilken grad både kanyle og den ytre delen av implantatet (hodet holderen plate og Dental akryl cap) er kroniske stressfaktorer ved å vurdere corticosterone blod nivåer og binyrene vekt i forhold til unimplanted mus.
Preparatet er generelt stabilt fra uker til måneder26. På lang sikt, hud og bein vekst har en tendens til å fortrenge akryl cap og å øke ustabilitet i Imaging forberedelse.
Optiske begrensninger.
Konvensjonelle 2P mikroskopi tillater Imaging opp til ca 1 mm dypt inn neocortical vev40,41. I samsvar med dette, er det mulig å bilde dendrites og dendrittiske pigger ligger i SR (figur 2D-F) eller SLM36. Men Imaging gjennom en kanyle utgjør begrensninger til effektiv NA. For å oppnå maksimal oppløsning, diameteren og dybden av Imaging kanyler bør samsvare med Imaging NA, som mindre diametere og lengre dybder vil klemme lys av høy NA mål. For eksempel når tenkelig med en 1,0 NA vann nedsenking mål gjennom en 1,6 mm lang kanyle, en 3,65 mm indre diameter er nødvendig for å holde hele NA. Men ved hjelp av en kanyle av denne diameteren vil øke kompresjon på hippocampus og kan påvirke helsen til vevet, på grunn av dette, bruker vi en kanyle med en mindre diameter. Når Imaging med en 0,8 NA vann nedsenking objektiv gjennom en 1,6 mm lang kanyle, en indre diameter på 2,5 mm ville være tilstrekkelig til å holde hele NA. Men 0,8 NA vann nedsenking mål har en kortere WD (3 mm i vårt tilfelle), som kan hindre fra å fokusere på SP.
Disse beregningene gjelder for midten av synsfeltet nederst i kanyle. Men å flytte Imaging synsfelt sidelengs-nærmere kantene av kanyle-eller fokusere dypere inn i vevet-lenger fra glassoverflaten av kanyle-ytterligere reduserer den effektive NA på fokalplanet og dermed reduserer oppløsningen. Dette vil føre til ikke-homogen oppløsning på tvers av ulike volumer av avbildet vev og kan være en bekymring for kvantitative Imaging ved subcellulære oppløsning, spesielt når du bruker super-oppløsning teknikker som 2P-STED mikroskopi42. Disse problemene er mindre viktig når Imaging på mobilnettet oppløsning.
Vev bevegelse.
Motion innenfor vevet-som stammer fra pusting og hjerterytme i anesthetized dyr-har en tendens til å bli mer alvorlig med økt avstand fra Imaging kanyle. Dette er muligens fordi Imaging kanyle gjelder mekanisk press til hjernen og dermed motvirke noen av bevegelse i nærheten av kanyle (tilsvarende neocortical preparater). Selv om bilde av dendrittiske pigger er mulig i SR og SLM, i våre hender, er det mest robuste rygg mot SO opp til ≈ 200 μm fra overflaten av kanyle. For å kompensere for bevegelse, bruker vi resonans skannere og offline snitt. Flere bilder (4 til 6 repetisjoner) anskaffes per bilde plan av en z-stabel med maksimal tilgjengelig hastighet (30 bilder/s). Alle repetisjoner for hvert z-fly blir så deconvolved (ved hjelp av kommersiell programvare, AutoQuant), registrert (ved hjelp ImageJ) og gjennomsnitt i et enkelt bilde26. For Imaging av somata, bevegelse er ofte ubetydelig ved anestesi35 og to gjennomsnitt er ofte tilstrekkelig til å kompensere for bevegelse gjenstander.
Fremtidige programmer eller anvisninger for metoden .
Preparatet kan kombineres med mikro-endoskoper26,43. Mikro-endoskoper er stive optikk sonder som bruker gradient brytningsindeks (GRIN) mikrolinser å veilede lys til og fra dype vev18. Bruken av mikro-endoskoper innrømmer kanyler av mindre diameter eller aften nei kanyler i det hele tatt. Imidlertid, reklamen mikro–endoskoper er færre frisk korrigerte for optisk avvik og ha lavere NA enn reklamen målsettinger. Nåværende sonder nå lateral og aksial oppløsninger på ≈ 0.6-1 μm, ≈ 10-12 μm, henholdsvis17,18,44. Bruk av mikro-endoskoper muliggjør også kombinasjonen av dette preparatet med hode montert integrert widefield mikroskop45,46,47.
Metoden egner seg også til bruk i ikke-anesthetized mus, og det har blitt brukt til å undersøke mobilnettet aktivitet ved hjelp av ca2 + sensorer i våken hode-faste mus21,37,48,49. I disse tilfellene, på grunn av den raske tiden skalaer av fluorescens endringer, er det tilrådelig å gjennomføre linje registrering50. Det er også mulig å tilpasse forberedelsene til avbildning av andre hippocampus underregioner som dentate gyrus (DG)39,51,52. Kombinere dette preparatet med 3p eksitasjon53,54 med 1 MHz frekvens pulserende laser innstilt til 1400 NM, kunne vi bildet dypere inn i hippocampus formasjon nådde molekylær laget, granule celle laget og hilus av DG (Figur 4) uten å fjerne overliggende CA1.
Avslutningsvis presenterer vi en metode som gir optisk tilgang til rygg hippocampus og tillater langsgående og correlative studier av dynamikken i hippocampus struktur og aktivitet. Denne teknikken utvider mulighetene for analyse av hippocampus funksjon under fysiologiske og patologiske tilstander.
The authors have nothing to disclose.
U. F. er støttet av Schram fundament; C.-W. T. P. og W. G. støttes av Max Planck Society; Ly og R.Y. er støttet av Max Planck Society og National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. støttes av en FP7 Grant fra European Research Council, ERANET og I-CORE programmer, Chief Scientist Office av det israelske Helsedepartementet, Federal Ministry of Education and Research, Roberto og Renata Ruhman, Bruno og Simone Lich, den Nella og Leon Benoziyo Center for nevrologiske sykdommer, Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging og Genomics, The Israel Science Foundation i Perlman familie, Adelis, Marc Besen, Pratt og Irving I. Moskowitz stiftelser; A. A. støttes av Max Planck Society, Schram stiftelsen og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P bildene ble kjøpt i løpet av avansert kurs om neuroimaging teknikker ved Max Planck Florida Institute for nevrovitenskap. Den avanserte Course på neuroimaging teknikker støttes av Max Planck Society, Florida State Max Planck Scientific Fellowship Program og ved Max Planck Florida Institute Corporation Partnership program. Vi vil gjerne takke Thorlabs, sammenhengende og SpectraPhysics for å gi støtte og utstyr for 2P/3P Imaging system i løpet av kurset. Vi er også takknemlige for Henry Haeberle og Melissa Eberle for å få hjelp med systemet i løpet av kurset.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |