Summary
Denne metoden beskriver en kronisk forberedelse som tillater optisk tilgang til hippocampus av levende mus. Dette preparatet kan brukes til å utføre langsgående optisk avbildning av neuronal strukturelle plastisitet og aktivitet-fremkalt cellulær plastisitet over en periode på flere uker.
Abstract
To-Foton mikroskopi er et grunnleggende verktøy for nevrovitenskap som det tillater etterforskning av hjernen av levende dyr på romlige skalaer fra subcellulære til nettverksnivå og i timelige skalaer fra millisekunder til uker. Dessuten, to-Foton tenkelig kan kombinert med en variasjon av opptreden verv å utforske det årsakssammenheng imellom hjernefunksjonen og opptreden. Men i pattedyr, begrenset penetrasjon og spredning av lys har begrenset to-Foton intravital Imaging meste til overfladiske hjernen regioner, og dermed utelukker langsgående undersøkelse av dyp-hjerneområder som hippocampus. Hippocampus er involvert i romlig navigasjon og episodisk minne og er en langvarig modell som brukes til å studere mobilnettet, samt kognitive prosesser viktig for læring og tilbakekalling, både i helse og sykdom. Her er en forberedelse som gjør det mulig med en kronisk optisk tilgang til rygg og hippocampus i levende mus. Dette preparatet kan kombineres med to-Foton optisk bildebehandling ved cellulær og subcellulære oppløsning i hodet faste, anesthetized levende mus over flere uker. Disse teknikkene muliggjør gjentatt bildebehandling av neuronal struktur eller aktivitet-fremkalt plastisitet i titalls til hundrevis av neurons i rygg hippocampus CA1. Videre, denne kronisk forberedelse kan brukes inne kombinasjonen med annet teknikker som mikro-endoskopi, leder-montert bred åker mikroskopi eller tre-Foton mikroskopi, således høyeste ekspanderer det verktøyet å studere Cellular og nettverk prosesser involvert i læring og hukommelse.
Introduction
I pattedyr, er hippocampus en viktig hjerne region for koding og tilbakekalling av episodisk minner samt for romlig navigasjon1,2,3,4. Av denne grunn har hippocampus vært-og fortsatt er-en svært viktig modell for å studere de grunnleggende mekanismene som gjør at hjernen til å kode og huske minner5,6,7 eller å navigere i et miljø8 ,9 samle belønninger og unngå farer. I tillegg er hippocampus formasjon en av hjernen regionene der nye neurons er generert gjennom hele livet til gnagere10,11 og, muligens, av mennesker12,13. Til slutt, degenerasjon eller svekkelse av hippocampus formasjonen er forbundet med nevrologiske og psykiske lidelser, inkludert Alzheimers sykdom14.
I mus, hippocampus ligger ca 1 mm under hjernen overflaten15. Dens posisjon har hindret optisk tilgang i intakt hjernen og følgelig, langsgående studier av hippocampus dynamikk har støttet seg for det meste på magnetisk resonans (MR) Imaging, elektrofysiologi, og ex vivo Imaging analyser. MR Imaging metoder tillate sporing av biologiske prosesser (f. eks, genuttrykket endringer16) i samme dyr over flere dager, men mangler romlig oppløsning å diskriminere enkelt neurons. Classic in vivo elektrofysiologisk-teknikker gir svært høy Temporal oppløsning og utsøkt følsomhet for endringer i membran potensialet. Men de har en begrenset romlig oppløsning og de mangler evnen til pålitelig spore de samme cellene over lengre tidsperioder. Optisk bildebehandling gjør at flere ulike prosesser kan bli studert i kraft av sine høye timelige og romlige oppløsninger. Men ex vivo Imaging gir bare øyeblikksbilder av pågående prosesser, og dermed er det ikke egnet for langsgående studier der dyrene lære og hente informasjon.
In vivo optisk bildebehandling kombinerer noen fordeler av MR Imaging og elektrofysiologi med de av optiske Imaging. Derfor er det svært godt egnet for langsgående og correlative analyser av mus hjernen dynamikk og atferd. Dette er relevant i studier av biologiske prosesser med svært rask (millisekunder til sekunder) eller svært langsom (dager til uker) tids skalaer. Eksempler for slike prosesser som er relevante for nevrovitenskap er membran spenning dynamikk, ca2 + transienter, cellulær plastisitet og strukturelle endringer, som alle antas å være svært viktig for minne formasjon og tilbakekalling. De ulike metodene har forlenget in vivo Imaging til rygg-eller hippocampus18, 19,20,21,22. Akutte preparater har tillatt sporing av pyramideformet Nevron (PN) aktivitet så vel som deres dendrites og dendrittiske pigger i flere timer20,22. Denne timelige tidsrammen tillater imidlertid ikke langsiktige strukturelle endringer, som kan ligger til grunn trinnvis læring, for å bli studert. Kroniske preparater-i kombinasjon med mikro-endoskoper23,24 eller lang arbeidsavstand (WD) standard mål for mikroskop21 -har aktivert gjentatt bildebehandling av rygg-hippocampus over flere Uker.
Her beskriver vi en kronisk forberedelse som gir tilbakevendende optisk tilgang til CA1 sub-feltet i rygg-mus hippocampus av levende musene ved hjelp av en permanent innsatt Imaging kanyle. Dette preparatet gir gjentatt tilgang til CA1 uten funksjonell forstyrrelse og er egnet for intravital to-Foton (2P) eller bred-feltet epifluorescence Imaging. To eksempler på 2P dype hjernen kronisk Imaging i rygg CA1 av levende mus er detaljert: langsgående Imaging av dendrittiske struktur og dendrittiske ryggraden dynamikk og langsgående Imaging av aktivitet-fremkalt plastisitet. De viktigste fordelene og begrensningene i teknikken diskuteres.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet har blitt godkjent av regjeringen i øvre Bayern (lisens 2016_ROB-55.2 vet-2532. Vet_02-16-48) og ved Stanford og Max Planck Florida Institute for nevrovitenskap administrative paneler på laboratorium Animal Care.
1. utarbeidelse av bilde kanyle
- Hold en presisjons Drill på et borstativ som følger med en bevegelig linjal bord.
- Klem en 3,0 mm diameter rustfritt stål rør på den flyttbare linjalen tabellen.
- Skjær røret til en 1,6 mm lang metall ring. Hvis kantene av ringen ikke er sløv etter klipping, filen ut uregelmessigheter.
- Skyll metallringen og en sirkulær glass dekkglass med 4 mm diameter i 100% aceton og la den tørke i ≈ 5 min.
- Plasser metallringen og glasset dekkglass på en glatt, jevn og ren arbeidsplass, under en stereoscope.
- Plasser en dråpe UV-herding optisk lim på en glatt overflate, for eksempel en Petri parabolen. Bruk en nål eller en slikkepott til å spre ut limet for å danne en tynn (< 0,5 mm) lag.
- Bruk tang til å dyppe den ene siden av metallringen inn i limet. Vær spesielt oppmerksom på ikke å forsegle innsiden av ringen. Hvis dette skjer, bruk en nål for å bryte den optiske limet i ringen.
- Bruk stereoscope til å plassere metallringen i midten av glass dekkglass med den siden av ringen som er dekket av limet som berører dekkglass. En tynn ring av klebemiddel bør danne i grensesnittet mellom metallringen og dekkglass. Unngå at limet sprer seg til midten av dekkglass.
- Slå på UV-herding LED driverenhet og skinne lys (365 NM) i 1 min.
FORSIKTIG: UV-lys provoserer hudforbrenninger og er et mutagent middel. Bruk UV-beskyttende briller og dekk til hender og armer med hansker og en lab-pels for å unngå hud eksponering. - For å kurere limet jevnt, sørg for at alle sider av ringen er like opplyst ved å endre retningen på lyskilden.
- La limet stivne i minst 2 t, fortrinnsvis, over natten.
- Hold kanyle godt fast fra den åpne enden av metallringen ved hjelp av en hemostat. Ved hjelp av en tannlege Drill utstyrt med en roterende fil og arbeider under stereoscope, fil av overflødig glass dekkglass til flush med sidene av ringen (figur 1a).
2. implantation av bilde kanyle over rygg, hippocampus
- Utarbeidelse av utstyr og oppsett
- Kontroller at alle kirurgiske instrumenter er rene og sterile. Hvis du bruker en glass perle steriliseringsapparat til sterilisering, må du rengjøre instrumentene og plassere dem i steriliseringsapparat (innstilt på 250 ° c) i 10 minutter før bruk. Alternativt kan du autoklav instrumentene før bruk.
- Forbered alle materialer som kreves for kirurgi, samt Kirurgiske instrumenter, slik at de kan nås lett.
- Sørg for at det er nok ferskt tilberedte medisiner som smertestillende eller antiinflammatoriske legemidler.
- Kontroller at det er nok isoflurane for hele varigheten av operasjonen (ca 1 t per kirurgi).
- Skru på det gulvteppet og sette den å 37 ° c å oppbevare dyr temperatur stabile stund under bedøvelse.
- Kontroller at rensing system for isoflurane fungerer.
- Åpne ventilen av oksygenstrømmen.
- Anestesi induksjon, og dyr fiksering
- Plasser musen i anestesi induksjon kammeret på 3% isoflurane i 1 L/min O2 og vent til den mister bevisstheten. Vurdere anestesi ved hjelp av toe klype refleks test.
- Veie dyret.
- Påfør anti-inflammatorisk (meloksikam, 1mg/kg) og smertestillende (Vetalgin, 200mg/kg) narkotika subkutant.
- Plasser musen på varme teppet. Pass på at dyret ikke er i direkte kontakt med varme teppet for å unngå termiske brannskader.
- Fest hodet til stereotactic apparatet og plasser nese membranen for å dekke snuten. For å opprettholde anestesi, redusere isoflurane til 1,5-2%. Gjennom hele operasjonen, overvåke musen staten ved visuelt overvåke puste og ved å teste tå klype refleks. Regulere isoflurane prosent hvis nødvendig.
- Påfør øye salve på øynene for å hindre dehydrering og potensiell blindhet.
Merk: for anestesi og dyr medisinering, alternative metoder og narkotika er mulig. Behage, henviser til din dyr med lisens og det slektning litteraturen.
- Optisk kanyle implantation
- Slå på fiberoptisk lyskilde.
- Fjern håret og desinfisere huden over musen hodet.
- Ved hjelp av saks og tang, fjerne musen hodebunnen. Begynn med å lage et lite kutt i hodebunnen i en posisjon i nærheten av lambda. Fortsett ved å åpne hodebunnen på de to sidene. Først flytter sideveis i retning av ørene, deretter rostrally, i retning av øyet baner, for å danne en trekant på sagittal aksen, ca 4 mm rostral til bregma. Vær oppmerksom på ikke å skjære for nær ører og øyne, men utsett bregma og lambda, samt parietal bein og bakre halvdel av frontal bein.
- Påfør en dråpe (≈ 10 mg) av lidokain (28,9% v/v i alkohol) til skallen.
- Fjern periosteum og tørk skallen med en bomullspinne.
- Plasser øret barer, for å fikse musen hodet.
- Lag en liten kraniotomi, ved hjelp av en mikro-Drill med en 0,5 mm bredde Burr. Plasser hullet i frontal benet motsatte til avbildet hippocampus, ca 1,5 mm fra sagittal Sutur og 2 mm fjernt fra koronale Sutur.
- Skru en 0,86 mm bredde rustfritt stål bein skruen inn i skallen hullet.
- Om nødvendig, rengjør rusk og tørk skallen.
- Utarbeidelse av en blanding av hurtig lim sement
- Ved hjelp av en liten skje (≈ 4,5 mm diameter), dispensere 1-1.5 nivå kuler av L-pulver i en blanding godt.
- Dispensere 3-4 dråper av Quick base i brønnen.
- Dispensere 1 dråpe Universal Catalyst i brønnen.
- Rør blandingen for 5-10 s ved hjelp av en presisjon applikator.
Merk: alternative sement er tilgjengelige. Vennligst referer til produsentens instruksjoner.
- Bruk presisjons applikatorer for å påføre hurtig lim sement over hodeskallen, skruen og huden rundt. La det tørke i 30 s til 1 min.
- Bruk en 3,0 mm diameter trephine Drill for å lage en kraniotomi i parietal benet. Plasser hullet omtrent 1,5 mm fjernt fra sagittal Sutur og 2 mm fjernt fra lambdoid Sutur.
- Fjern forsiktig bein klaffen.
- Kontroller størrelsen på kraniotomi ved hjelp av kanyle for å sikre at den passer. Bruk en 0,5 mm eller 0,9 mm bredde mikro-Drill for å forstørre kraniotomi om nødvendig.
- Fjern hjernehinnene ved hjelp av Dumont tang.
- Ablate kortikale saken, for å nå den eksterne kapselen. Bruk en 0,9 mm diameter (19 gauge) stump nål koblet til en vakuumpumpe. Skyll med saltvann for å unngå dehydrering av eksponert vev og for å vaske bort rest blod etter blødning er løst. Sug kortikale vev langsomt, ≈ 50-100 μm om gangen, inntil cortex løsner fra kapselen, utsette fibrene i cingulum eller corpus callosum. Bytt nålen ofte, for å hindre tilstopping.
- Fibrene strekker seg hovedsakelig i tre retninger (figur 1B). Trekk forsiktig rygg fibrene til de dypeste fibrene (alveus av hippocampus) utsettes.
- Skyll vevet med saltvann. Bruk tynne tang å dyppe bunnen kanyle i saltvann og plassere den over skallen hullet. Kanyle og vev må tettes av saltvann for å unngå fangst luftbobler mellom kanyle og vevet.
- Skyv kanyle inn i skallen (figur 1C) til glass dekkglass er i kontakt med fibrene.
- Tørk skallen godt ved hjelp av absorpsjon trekanter, bomullspinner og/eller vakuum pumpen.
- Utarbeidelse av en blanding av hurtig lim sement (se trinn 2.3.10).
- Bruk presisjons applikatorer for å påføre hurtig lim sement over hodeskallen. Påfør limet også på kanten av kanyle. Vær forsiktig så du ikke lar limet renne inn i kanyle. La det tørke i 30 s til 1 min.
- Bruk en stereotaxic arm til å plassere en hode holder plate over kanyle, i kontakt med skallen.
- Utarbeidelse av en blanding av Dental akryl
- Ved hjelp av en skje (≈ 9 mm diameter), dispensere 1 nivå scoop (1 del) av pulver til en blanding godt.
- Dispensere 2-3 deler av væske i samme brønn. Dekk hele pulveret med væsken.
- Rør for ≈ 1 min ved hjelp av en slikkepott.
Merk: alternative akryl er tilgjengelige. Vennligst referer til produsentens instruksjoner.
- Bruk en slikkepott eller en presisjons applikator for å påføre akryl på tvers av kraniet. Dekk hele eksponert skallen, skruen og den åpne huden med Dental akryl. Dette gjør forberedelsen stabil. Ikke la akryl renne ned i nakken, ørene og øynene.
- La akryl tørke og herde i ca 15 min.
- Påfør en flyttbar lim film på hodet holder platen, for å hindre rusk fra å komme inn i kanyle. Det anbefales at filmen størrelse samsvarer med den av platen.
- Slå av isoflurane strømning, Fjern dyret fra stereotactic apparat og plasser det på en varmeplate for å opprettholde fysiologisk kroppstemperatur mens det våkner opp fra anestesi.
- Overvåk dyret til det har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Returnere dyret som har gjennomgått kirurgi til selskapet av andre dyr bare når helt utvinnes.
3. postoperativ behandling
- Sjekk status på musen for 2 dager etter operasjonen, ved å overvåke vekten og generell atferd.
- Påfør anti-inflammatorisk (meloksikam, 1mg/kg) og smertestillende (Vetalgin, 200mg/kg) narkotika subkutant i 2 dager etter operasjonen
Merk: alternative overvåkings prosedyrer, medikamenter og dosering er mulig for postoperativ behandling. Behage, henviser til din dyr med lisens og det slektning litteraturen.
4. utarbeidelse av bildebehandlings økten
- Slå på Imaging setup på forhånd og la laseren å varme opp og stabilisere, om nødvendig.
- Bedøve musen (se trinn 2.2.1).
- Bruk tang for å forsiktig fjerne limet filmen fra hodet holderen plate. Hold musen i en hånd og hodet holderen plate med fingrene. Fjern filmen forsiktig, for å unngå å skade preparatet.
- Plasser musen under mikroskopet, over varme teppet og fest hode platen til holderen (figur 1d).
- Plasser nese membranen for å dekke snuten og Reduser isoflurane til 1,5-2%.
- Påfør øye salve på muse øynene.
- Rengjør bilde kanyle ved å skylle med deionisert vann. Bruk en sprøyte og en tynn nål til å slippe vann inn i kanyle og en vakuumpumpe for å fjerne den.
5. Imaging sesjon
- Bruk lav forstørrelse, lang arbeidsavstand mål å visuelt sjekke kanyle for REST vann, skitt, integritet og tilstedeværelsen av fluorescens.
- Juster kanyle til den optiske aksen ved å justere vinklene til hode holde armene.
- Bytt til 25X 1,0 NA, 4 mm WD eller 40X 0,8 NA, 3 mm WD, vann nedsenking mål. Legg nok deionisert vann til å fylle kanyle og vedlikeholde overflødig vann på toppen av kanyle. Unngå dannelse av luftbobler.
- Bruk 2P eksitasjon og bilde fluorescerende signaler.
Merk: bildebehandlings protokollen er svært avhengig av tid og romlige skalaer for å bli avbildet. Vennligst referer til avsnittene representative resultater og diskusjon for detaljer om Imaging innstillingene vi har brukt til å produsere bildene som vises i denne artikkelen.
Representative Results
Siden kanyle er plassert bare rygg til CA1, er rygg aspektet av CA1 mer proksimale til mikroskopet hvis sammenlignet med ventrale en. Alveus er den mest proksimale strukturen fulgt i rekkefølge av stratum Oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) og stratum lacunosum moleculare (SLM), det mest , C). Langsgående 2P avbildning av neuronal struktur med subcellulære oppløsning og aktivitet-fremkalt plastisitet med mobilnettet oppløsning er presentert som representative resultater. Å opphisse den fluorophores grønne fluorescerende protein (GFP), d2Venus og TurboFP635, en femtosecond pulserende ti: Sapphire laser innstilt til 920 NM brukes og gjennomsnittlig laser kraft er justert til 5-25 mW ved prøven. De ulike utslipps bølgelengdene skilles ved hjelp av utslipps filtre og forskjellige photomultiplier rør.
Langsgående bilde av dendrittiske struktur og dendrittiske pigger dynamikk.
For å tynt merke hippocampus PNs og visualisere deres struktur, er en Thy1-GFP transgene Mouse linje (M linje) brukes. Thy1-GFP mus uttrykker cytoplasmatiske forbedret GFP under kontroll av Thy1 arrangøren i en sparsom, tilfeldig befolkning på PNs25. Generelt er den store aksen av CA1 PNs omtrent vinkelrett på XY-Imaging flyet (tall 1B, figur 2a og supplerende film 1). Basal dendrites strekker seg i SO, fra Soma mot kanyle, mens apikale og apikale tuft dendrites forlenge distally til kanyle, i motsatt retning (supplerende Movie 1). Siden preparatet etterlater de dypeste fibrene i alveus intakt, et par fluorescerende fibre krysser synsfeltet, like under kanyle, skal være synlig (figur 2a og film 1). Preparatet tillater bildebehandling av PN-dendrites med ryggrad oppløsning (figur 2 A-C). Til bilde dendrites og dendrittiske pigger, en 25X 1,0 NA, 4 mm WD, vann nedsenking kommersielle objektiv linse brukes.
For lengde sporing defineres flere hjerneområder innenfor synsfeltet til kanyle under den første bildebehandlings økten. Hver region tilsvarer et areal på ca 240 x 240 μm og inneholder mellom 1 og 7 dendrittiske segmenter (figur 2b). Disse regionene tilordnes manuelt til en tredimensjonal stabel med lav forstørrelse, som viser mønsteret for GFP-uttrykket i volumet under bilde kanyle (figur 2a). Deretter, 1 μm z-trinn bilde stabler av CA1 PN basal dendrites er ervervet ved forskjellige tidsintervaller (fra 24 timer til 3 dager) i opptil ca 14 dager (figur 2C). Lengre bilde varigheter og-intervaller er mulige26. Hver bildebehandlings økt varer ca. 60 til 90 min. Selv om de fleste bildene er av dendrittiske pigger i SO, er det også mulig å bilde dendrittiske pigger i skrå dendrites av SR (tall 2D-F). I tillegg til ryggen tetthet, gjør denne metoden studiet av ryggraden dynamikk ved kvantifisere deres overlevelse, gevinst og tap priser26,27,28,29,30, 31 andre , 32. for å score og spore dendrittiske pigger over tid (figur 2C), brukes et egendefinert MATLAB-grensesnitt. Dette gjør at justeringen av bildet stabler ervervet på ulike tidspunkt poeng og støtter manuell merking av dendrites og pigger mens sporing dendrittiske lengder og ryggraden posisjoner over tid26. Viktigere, kan denne metoden brukes til å skille (per hver gang punkt, unntatt den første) mellom eksisterende og nyfødte dendrittiske pigger. Dette er viktig som de ulike klassene av dendrittiske pigger antas å ha ulike roller i minnet oppkjøp og oppbevaring33.
Langsgående bilde av aktivitet-fremkalt plastisitet.
Til bilde aktivitet-fremkalt plastisitet i CA1 PNs, er rygg CA1 hippocampus området injiseres med en viral vektor uttrykker grønne fluorescerende destabilisert d2Venus via en forbedret form av Synaptic aktivitet-responsive element (E-SARE) innenfor Arc Enhancer/promoter og rød fluorescerende TurboFP635 via ePGK promoter34. Dette gir mulighet for bildebehandling nivåer av aktivitet-fremkalt plastisitet av hundrevis av CA1 PNs i hvert dyr35. Gitt svært tett merking av PNs, er det vanligvis ikke mulig å løse dendrites av CA1 PNs (utfyllende Movie 2).
Til bilde av somata av CA1 PNs, en 40X 0,8 NA, 3 mm WD, vann nedsenking objektiv linse brukes. For langsgående sporing defineres 1 til 9 hjerneregioner per mus under den første bildebehandlings økten. Hver region tilsvarer et areal på ca 300 x 300 μm og inneholder mellom 50 og 150 celler (figur 3a). Disse regionene er manuelt tilordnet lokale vev landemerker synlig ved en lavere forstørrelse. Deretter er 3 μm z-trinn bilde stabler ervervet, som omfatter SP av CA1 PNs (figur 3a og supplerende Movie 2) ved forskjellige tidsintervaller (fra 24 timer til 6 dager) i opptil ca 30 dager. Hver bildebehandlings økt varer ca 60 til 90 min. E-SARE aktiverings topper 6 til 8 timer etter en eksponering for en ny eller beriket miljø (EE, figur 3b) og henfall i løpet av noen dager. Således, vi generelt bilde 6 til 8 timer etter erfaring og tillate 5 dager mellom bildebehandling økter35.
Å kvantifisere d2Venus og TurboFP635 fluorescens verdier, en sirkulær region-of-Interest 4,64 μm i diameter er tegnet, som er mindre enn en nevrale celle kroppen, sentrert til cellen Soma. Vi deretter gå videre til neste gang punktet, scorer Soma av samme celle på samme måte, og gjenta denne prosedyren for all tid poeng og alle synlige celler i den langsgående datasettet. Den gjennomsnittlige verdien av hver Nevron er (aktivitet-avhengige) d2Venus utslipp er normalisert av sin mening (aktivitet-uavhengig) TurboFP635 utslipp. Denne metoden gjør det mulig etterforskning av langsiktige dynamikken i ensemblet plastisitet av CA1 PNs35 (figur 3c).
Figur 1: forberedelse til in vivo dyp hjerne optisk bildebehandling. (A). topp (venstre) og side (høyre) visning av eksempel bilde cannuals. Imaging kanyler har en gjennomsiktig glassbunn for å tillate optisk tilgang til hippocampus. (B). skjematisk beskrivelse av preparatet fremhever den relative plasseringen av Imaging kanyle, en CA1 PN og de tre lag av fibre fra rygg til ventrale. (C, D). Skjematisk beskrivelse av bildeoppsettet (C) og av dyret fiksering (D) under en bildebehandling økt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Langsgående bilde av dendrittiske struktur og dendrittiske pigger dynamikk. (A). 2P bilde stabel (maksimal intensitet projeksjon (MIP) av 59 bilde plan, 2 μm z-avstand) av neurons og dendrites merket av GFP i en live THY1-GFP mus. (B). høyere forstørrelse (MIP av 53 bilde plan, 1 μm z-avstand) detaljering basal dendrites PLASSERT i so. (C). time-lapse bildesekvens av et dendrittiske segment avbildet over 14 dager. Pilspisser angir dendrittiske pigger som spores over 14 dager. (D, E). 2P bilde stabel med neurons og dendrites merket av GFP i en live Thy1-GFP mus; (D) ZY projeksjon (31 bilde plan, 3 μm z-mellomrom) og (E) XY anslag (17 bilde plan, 3 μm z-avstand). (F). høyere forstørrelse (enkelt bilde plan) detaljering apikale dendrites og dendrittiske pigger ligger i SR. pilspisser indikerer dendrittiske pigger. Eksitasjon: 920 NM; høyeste utslipps høyde: 510 NM. Skala stolper: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D og E, 15 μm; F, 4 μm. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Langsgående bilde av aktivitet-fremkalt plastisitet. (A). 2P bilder (enkelt bilde plan) fra en levende mus, viser de samme cellene på Baseline dag 0 og etter ee på dag 1. (B). 2P bilde stabler (MIPs av 4-6 bilde plan, 3 μm z-avstand) som viser E-SARE aktiverings mønstre spesifikt for miljø A (dag 1, 19 og 25) og miljø B (dager 7 og 13). Grønn: d2Venus fluorescens. Rød: TurboFP635-fluorescens. Eksitasjon: 920 NM; d2Venus utslipps topp: 530 NM; TurboFP635 utslipps topp: 635nm. Skala stolper: A, 20 μm; B, 10 μm. Dette tallet har blitt modifisert fra Attardo et al., 201835. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Imaging av neuronal struktur i HIPPOCAMPUS DG ved hjelp av tre-Foton (3p) mikroskopi. (A-H). 3P bilder (enkelt bilde plan) av neurons og dendrites merket av GFP i en live Thy1-GFP mus detaljering (A-E) PNs i CA1 og (F-H) granule celler i DG. Eksitasjon: 1400 NM; høyeste utslipps høyde: 510 NM. Scale bar: 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende film 1: Imaging synsfelt i en live Thy1-GFP mus. 2P bilde stabel (83 bilde plan, 7 μm z-mellomrom) av neurons og dendrites merket med GFP (hvit) i en live Thy1-GFP mus som strekker seg fra bunnen av kanyle til SLM. For å gjøre rede for forfallet av fluorescens signal med økende dybde, brukte vi en ikke-lineær gradient av photomultiplier tuber ' gevinst. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Utfyllende Movie 2: Imaging av aktivitet-fremkalt plastisitet. 2P image stack (28 bilde plan, 3 μm z-mellomrom) av neurons uttrykker E-SARE reporter i benet uttrykk i en levende mus som omfatter SP. grønn: d2Venus fluorescens. Rød: TurboFP635-fluorescens. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Her beskrives en prosedyre for gjentatt 2P avbildning av rygg CA1 i levende mus. Etter operasjonen, gjenoppretter musen vanligvis innen 2 dager. Prosedyren induserer minimal astrogliosis26,43. Blødning og ødem som kan følge operasjonen er vanligvis re-adsorberes innen 10 til 14 dager. Vanligvis, fra 14 dager etter implantation fremover er forberedelsene tilstrekkelig klart til å utføre intravital avbildning. Suksessen til operasjonen er ikke avhengig av å arbeide i et sterilt miljø. Det er imidlertid avgjørende å opprettholde et høyt nivå av hygiene, for å unngå komplikasjoner på grunn av kirurgi-tilknyttede infeksjoner. Dette oppnås ved omhyggelig rengjøring av kirurgiske instrumenter før og etter operasjonen og ved varme-sterilisering dem umiddelbart før hver bruk (trinn 2.1.1). Den optiske kanyle oppbevares i en ren, sterilisert beholder og skylles med sterilt saltvann rett før implantation. Utføre vanlige kirurgiske praksiser av hendene desinfeksjon og rengjøring av kirurgisk stasjon er også svært viktig. Forberedelsene forblir stabilt og tillater mobilnettet og subcellulære oppløsning Imaging i flere uker26,35.
Kritiske trinn, endringer og feilsøking.
Det er viktig å skrelle den utvendige kapselen til de dypeste fibrene er eksponert. Unnlatelse av å utsette alveus kan resultere i manglende evne til å fokusere på Soma av PNs, eller i redusert oppløsning Imaging dendrittiske pigger, når du bruker kommersielle mål med 3-eller 4-mm WD. Til dette målet, er det nyttig å ablate mektig svært langsomt ved hjelp av en 0,9 mm diameter nål og deretter bytte til en 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) nål for en finere kontroll av sug når du fjerner de mest rygg fibre. Alternativt kan fine tang brukes til å fjerne gjenværende cortex etter fiber eksponering36.
Blødning under operasjonen kan være problematisk, som blod hindrer visningen. Venter på at Clot å danne og deretter skylle med saltvann for å vaske bort rester av blod anbefales. Gjenta etter behov.
En tettsittende passform mellom kanyle og kraniotomi bidrar til å øke stabiliteten av preparatet ved å holde kanyle på plass før påføring av sement, spesielt hvis ytterkanten av kanyle er i flukt med skallen. Siden størrelsene på trephine Drill og kanyle er matchet, kan en løs passform oppstå på grunn av uregelmessigheter på siden av kanyle-som krever litt større craniotomies for å passe (se trinn 2.3.14)-eller fra en uregelmessig kraniotomi. Eventuelle kanyle uregelmessigheter må være innlevert av (trinn 1,3 og 1,12) og trephine må holdes vinkelrett på skallen til kraniotomi er fullført (trinn 2.3.12). Hvis du fjerner trephine fra hodeskallen før kraniotomi er fullført, kan det føre til uregelmessig craniotomies.
Begrensninger- Invasiveness og stabilitet av preparatet.
Det er vanskelig å evaluere effekten av kortikale ablasjon som det er krevende å presist definere områdene berørt direkte og indirekte. Generelt, fjerner kirurgi en del av parietal cortex og en del av den visuelle og hindlimb bentap sensoriske cortex21. Den ablated cortex ikke direkte prosjekt til hippocampus og hippocampus vev er verken rørt eller skadet. Viktigere er det vist at implantation av en Imaging kanyle ikke grovt alter hippocampus funksjon og spesielt hippocampus-avhengige læring21,36,37,38, i 39. Likevel, det ville være viktig å kvantifisere i hvilken grad både kanyle og den ytre delen av implantatet (hodet holderen plate og Dental akryl cap) er kroniske stressfaktorer ved å vurdere corticosterone blod nivåer og binyrene vekt i forhold til unimplanted mus.
Preparatet er generelt stabilt fra uker til måneder26. På lang sikt, hud og bein vekst har en tendens til å fortrenge akryl cap og å øke ustabilitet i Imaging forberedelse.
Optiske begrensninger.
Konvensjonelle 2P mikroskopi tillater Imaging opp til ca 1 mm dypt inn neocortical vev40,41. I samsvar med dette, er det mulig å bilde dendrites og dendrittiske pigger ligger i SR (figur 2D-F) eller SLM36. Men Imaging gjennom en kanyle utgjør begrensninger til effektiv NA. For å oppnå maksimal oppløsning, diameteren og dybden av Imaging kanyler bør samsvare med Imaging NA, som mindre diametere og lengre dybder vil klemme lys av høy NA mål. For eksempel når tenkelig med en 1,0 NA vann nedsenking mål gjennom en 1,6 mm lang kanyle, en 3,65 mm indre diameter er nødvendig for å holde hele NA. Men ved hjelp av en kanyle av denne diameteren vil øke kompresjon på hippocampus og kan påvirke helsen til vevet, på grunn av dette, bruker vi en kanyle med en mindre diameter. Når Imaging med en 0,8 NA vann nedsenking objektiv gjennom en 1,6 mm lang kanyle, en indre diameter på 2,5 mm ville være tilstrekkelig til å holde hele NA. Men 0,8 NA vann nedsenking mål har en kortere WD (3 mm i vårt tilfelle), som kan hindre fra å fokusere på SP.
Disse beregningene gjelder for midten av synsfeltet nederst i kanyle. Men å flytte Imaging synsfelt sidelengs-nærmere kantene av kanyle-eller fokusere dypere inn i vevet-lenger fra glassoverflaten av kanyle-ytterligere reduserer den effektive NA på fokalplanet og dermed reduserer oppløsningen. Dette vil føre til ikke-homogen oppløsning på tvers av ulike volumer av avbildet vev og kan være en bekymring for kvantitative Imaging ved subcellulære oppløsning, spesielt når du bruker super-oppløsning teknikker som 2P-STED mikroskopi42. Disse problemene er mindre viktig når Imaging på mobilnettet oppløsning.
Vev bevegelse.
Motion innenfor vevet-som stammer fra pusting og hjerterytme i anesthetized dyr-har en tendens til å bli mer alvorlig med økt avstand fra Imaging kanyle. Dette er muligens fordi Imaging kanyle gjelder mekanisk press til hjernen og dermed motvirke noen av bevegelse i nærheten av kanyle (tilsvarende neocortical preparater). Selv om bilde av dendrittiske pigger er mulig i SR og SLM, i våre hender, er det mest robuste rygg mot SO opp til ≈ 200 μm fra overflaten av kanyle. For å kompensere for bevegelse, bruker vi resonans skannere og offline snitt. Flere bilder (4 til 6 repetisjoner) anskaffes per bilde plan av en z-stabel med maksimal tilgjengelig hastighet (30 bilder/s). Alle repetisjoner for hvert z-fly blir så deconvolved (ved hjelp av kommersiell programvare, AutoQuant), registrert (ved hjelp ImageJ) og gjennomsnitt i et enkelt bilde26. For Imaging av somata, bevegelse er ofte ubetydelig ved anestesi35 og to gjennomsnitt er ofte tilstrekkelig til å kompensere for bevegelse gjenstander.
Fremtidige programmer eller anvisninger for metoden .
Preparatet kan kombineres med mikro-endoskoper26,43. Mikro-endoskoper er stive optikk sonder som bruker gradient brytningsindeks (GRIN) mikrolinser å veilede lys til og fra dype vev18. Bruken av mikro-endoskoper innrømmer kanyler av mindre diameter eller aften nei kanyler i det hele tatt. Imidlertid, reklamen mikro--endoskoper er færre frisk korrigerte for optisk avvik og ha lavere NA enn reklamen målsettinger. Nåværende sonder nå lateral og aksial oppløsninger på ≈ 0.6-1 μm, ≈ 10-12 μm, henholdsvis17,18,44. Bruk av mikro-endoskoper muliggjør også kombinasjonen av dette preparatet med hode montert integrert widefield mikroskop45,46,47.
Metoden egner seg også til bruk i ikke-anesthetized mus, og det har blitt brukt til å undersøke mobilnettet aktivitet ved hjelp av ca2 + sensorer i våken hode-faste mus21,37,48,49. I disse tilfellene, på grunn av den raske tiden skalaer av fluorescens endringer, er det tilrådelig å gjennomføre linje registrering50. Det er også mulig å tilpasse forberedelsene til avbildning av andre hippocampus underregioner som dentate gyrus (DG)39,51,52. Kombinere dette preparatet med 3p eksitasjon53,54 med 1 MHz frekvens pulserende laser innstilt til 1400 NM, kunne vi bildet dypere inn i hippocampus formasjon nådde molekylær laget, granule celle laget og hilus av DG (Figur 4) uten å fjerne overliggende CA1.
Avslutningsvis presenterer vi en metode som gir optisk tilgang til rygg hippocampus og tillater langsgående og correlative studier av dynamikken i hippocampus struktur og aktivitet. Denne teknikken utvider mulighetene for analyse av hippocampus funksjon under fysiologiske og patologiske tilstander.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
U. F. er støttet av Schram fundament; C.-W. T. P. og W. G. støttes av Max Planck Society; Ly og R.Y. er støttet av Max Planck Society og National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. støttes av en FP7 Grant fra European Research Council, ERANET og I-CORE programmer, Chief Scientist Office av det israelske Helsedepartementet, Federal Ministry of Education and Research, Roberto og Renata Ruhman, Bruno og Simone Lich, den Nella og Leon Benoziyo Center for nevrologiske sykdommer, Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging og Genomics, The Israel Science Foundation i Perlman familie, Adelis, Marc Besen, Pratt og Irving I. Moskowitz stiftelser; A. A. støttes av Max Planck Society, Schram stiftelsen og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P bildene ble kjøpt i løpet av avansert kurs om neuroimaging teknikker ved Max Planck Florida Institute for nevrovitenskap. Den avanserte Course på neuroimaging teknikker støttes av Max Planck Society, Florida State Max Planck Scientific Fellowship Program og ved Max Planck Florida Institute Corporation Partnership program. Vi vil gjerne takke Thorlabs, sammenhengende og SpectraPhysics for å gi støtte og utstyr for 2P/3P Imaging system i løpet av kurset. Vi er også takknemlige for Henry Haeberle og Melissa Eberle for å få hjelp med systemet i løpet av kurset.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
- O’Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press; Oxford University Press. (1978).
- Zola-Morgan, S., Squire, L. R. Memory Impairment in Monkeys Following Lesions Limited to the Hippocampus. Behavioral Neuroscience. 100 (2), 155-160 (1986).
- Squire, L., Zola-Morgan, S. The medial temporal lobe memory system. Science. 253 (5026), 1380-1386 (1991).
- Leutgeb, S., Leutgeb, J. K., Barnes, C. A., Moser, E. I., McNaughton, B. L., Moser, M. B. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Silva, A. J., Zhou, Y., Rogerson, T., Shobe, J., Balaji, J. Molecular and cellular approaches to memory allocation in neural circuits. Science. 326 (5951), 391-395 (2009).
- Tonegawa, S., Pignatelli, M., Roy, D. S., Ryan, T. J. Memory engram storage and retrieval. Current Opinion in Neurobiology. 35, 101-109 (2015).
- Poo, M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, (2016).
- O’Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
- Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
- Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anatomical Record. 145, 573-591 (1963).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Sorrells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Boldrini, M., et al. Human hippocampal neurogenesis persists throughout aging. Cell Stem Cell. 22 (4), 589-599 (2018).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity — towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2017).
- Rosene, D. L., Van Hoesen, G. W., et al. The hippocampal formation of the primate brain. in Cerebral Cortex. Jones, E. G., et al. Chapter 9, Plenum Press. New York. 345-456 (1987).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist. 17 (5), 539-559 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Reviewof Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Jung, J. C., Schnitzer, M. J. Multiphoton endoscopy. Optics Letters. 28 (11), 902 (2003).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution in vivo imaging of hippocampal dendrites and spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147-3151 (2004).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid- for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (22), 8740-8745 (2012).
- Jung, J. C., Mehta, A. D., Aksay, E., Stepnoski, R., Schnitzer, M. J. In vivo mammalian brain imaging using one- and two-photon fluorescence microendoscopy. Journal of Neurophysiology. 92 (5), 3121-3133 (2004).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W. B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-265 (2005).
- Holtmaat, A. J. G. D., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34, 13948-13953 (2014).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (42), 177-187 (2011).
- Kawashima, T., et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods. 10 (9), 889-895 (2013).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media. Optics Communications. 188, 25-29 (2001).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 mm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
- Pfeiffer, T., et al. Chronic 2P-STED imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. eLife. 7, e34700 (2018).
- Barretto, R. P. J., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature Medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), aaa5694 (2016).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. SIMA: Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, (2014).
- Gonçalves, J. T., et al. In vivo imaging of dendritic pruning in dentate granule cells. Nature Neuroscience. 19 (6), 788-791 (2016).
- Danielson, N. B., et al. Distinct contribution of adult-born hippocampal granule cells to context encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 1 (1), 71 (1996).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
