Summary
Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.
Abstract
La microscopía de dos fotones es una herramienta fundamental para la neurociencia, ya que permite la investigación del cerebro de animales vivos a escalas espaciales que van desde los niveles subcelulares a los niveles de red y a escalas temporales de milisegundos a semanas. Además, las imágenes de dos fotones se pueden combinar con una variedad de tareas conductuales para explorar las relaciones causales entre la función cerebral y el comportamiento. Sin embargo, en los mamíferos, la penetración limitada y la dispersión de la luz han limitado las imágenes intravitales de dos fotones principalmente a las regiones cerebrales superficiales, lo que excluye la investigación longitudinal de áreas del cerebro profundo como el hipocampo. El hipocampo participa en la navegación espacial y la memoria episódica y es un modelo de larga data utilizado para estudiar procesos celulares y cognitivos importantes para el aprendizaje y la memoria, tanto en salud como en enfermedades. Aquí, se detalla una preparación que permite el acceso óptico crónico al hipocampo dorsal en ratones vivos. Esta preparación se puede combinar con imágenes ópticas de dos fotones a resolución celular y subcelular en ratones vivos fijos y anestesiados durante varias semanas. Estas técnicas permiten tomar imágenes repetidas de la estructura neuronal o la plasticidad evocada por la actividad en decenas a cientos de neuronas en el hipocampo dorsal CA1. Además, esta preparación crónica se puede utilizar en combinación con otras técnicas como la microendoscopia, la microscopía de campo ancho montada en la cabeza o la microscopía de tres fotones, ampliando así en gran medida la caja de herramientas para estudiar los procesos celulares y de red involucrados en el aprendizaje y la memoria.
Introduction
En los mamíferos, el hipocampo es una región cerebral clave para la codificación y recuperación de recuerdos episódicos, así como para la navegación espacial1,2,3,4. Por esta razón, el hipocampo ha sido -y sigue siendo- un modelo muy importante para estudiar los mecanismos básicos que permiten al cerebro codificar y recordar recuerdos5,6,7 o navegar en un entorno8 ,9 recogiendo recompensas y evitando peligros. Además, la formación del hipocampo es una de las regiones cerebrales donde se generan nuevas neuronas a lo largo de la vida de los roedores10,11 y, posiblemente, de los seres humanos12,13. Finalmente, la degeneración o deterioro de la formación del hipocampo se asocian con trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer14.
En ratones, el hipocampo se encuentra aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie cerebral15. Su posición ha impedido el acceso óptico en el cerebro intacto y, en consecuencia, los estudios longitudinales de la dinámica del hipocampo se han basado principalmente en imágenes de resonancia magnética (RM), electrofisiología y análisis de imágenes ex vivos. Los métodos de diagnóstico por rmn permiten el seguimiento de los procesos biológicos (por ejemplo, cambios en la expresión génica16) en el mismo animal durante varios días, pero carecen de la resolución espacial para discriminar las neuronas individuales. Las técnicas electrofisiológicas clásicas in vivo ofrecen una resolución temporal muy alta y una sensibilidad exquisita a los cambios en el potencial de la membrana. Sin embargo, tienen una resolución espacial limitada y carecen de la capacidad de rastrear de forma fiable las mismas celdas durante períodos de tiempo más largos. Las imágenes ópticas permiten estudiar procesos más diversos en virtud de sus altas resoluciones temporales y espaciales. Sin embargo, las imágenes ex vivo sólo proporcionan instantáneas de los procesos en curso, por lo que no es adecuada para estudios longitudinales durante los cuales los animales aprenden y recuerdan información.
La imagen óptica in vivo combina algunas ventajas de la imagen por RMN y la electrofisiología con las de las imágenes ópticas. Por lo tanto, es muy adecuado para análisis longitudinales y correlativos de la dinámica y el comportamiento del cerebro del ratón. Esto es relevante en estudios de procesos biológicos con escalas de tiempo muy rápidas (milisegundos a segundos) o muy lentas (días a semanas). Ejemplos de tales procesos que son relevantes para la neurociencia son la dinámica de voltaje de membrana, Ca2+ transitorios, plasticidad celular y cambios estructurales, que se cree que son muy importantes para la formación de la memoria y la memoria. Diferentes métodos han extendido la imagen in vivo al hipocampo dorsal18,19,20,21,22. Las preparaciones agudas han permitido el seguimiento de la actividad de la neurona piramidal (PN), así como sus dendritas y espinas dendríticas durante varias horas20,22. Este marco temporal, sin embargo, no permite estudiar los cambios estructurales a largo plazo, que podrían subyacen al aprendizaje incremental. Las preparaciones crónicas - en combinación con microendoscopios23,24 o con objetivos estándar de microscopio de larga distancia de trabajo (WD)21 - han permitido la toma repetida de imágenes del hipocampo dorsal en varios Semanas.
Aquí, describimos una preparación crónica que proporciona acceso óptico recurrente al subcampo CA1 del hipocampo dorsal de ratones vivos utilizando una cánula de imagen insertada permanentemente. Esta preparación permite el acceso repetido al CA1 sin perturbaciones funcionales y es adecuada para imágenes intravitales de dos fotones (2P) o epifluorescencia de campo ancho. Se detallan dos ejemplos de imágenes crónicas del cerebro profundo 2P en la CA1 dorsal de ratones vivos: imágenes longitudinales de la estructura dendrítica y dinámica delatrítica de la columna vertebral e imágenes longitudinales de plasticidad evocada por la actividad. Se discuten las ventajas y limitaciones más destacadas de la técnica.
Protocol
Todos los métodos descritos han sido aprobados por el Gobierno de Alta Baviera (licencia 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48) y por el Stanford y Max Planck Florida Institute for Neuroscience Administrative Panels on Laboratory Animal Care.
1. Preparación de la cánula de imagen
- Sostenga un taladro de precisión en un soporte de perforación suministrado con una tabla de reglas móvil.
- Sujete un tubo de acero inoxidable de 3,0 mm de diámetro sobre la mesa de la regla móvil.
- Corte el tubo a un anillo metálico de 1,6 mm de largo. Si los bordes del anillo no son contundentes después del corte, presente las irregularidades.
- Enjuague el anillo metálico y un cubredes de vidrio circular de 4 mm de diámetro en acetona 100% y deje secar durante 5 min.
- Coloque el anillo metálico y la cubierta de vidrio en un lugar de trabajo suave, uniforme y limpio, bajo un estereoscopio.
- Coloque una gota de adhesivo óptico de curado UV sobre una superficie lisa, como una placa Petri. Utilice una aguja o una espátula para esparcir el adhesivo para formar una capa delgada (<0,5 mm).
- Utilice fórceps para sumergir un lado del anillo de metal en el adhesivo. Preste especial atención a no sellar el interior del anillo. Si esto sucede, utilice una aguja para romper el adhesivo óptico en el anillo.
- Con el estereoscopio, coloque el anillo metálico en el centro de la cubierta de vidrio con el lado del anillo cubierto por adhesivo que toca el cubreobjetos. Se debe formar un anillo delgado de adhesivo en la interfaz entre el anillo metálico y el cubreobjetos. Evite que el adhesivo se extienda al centro de la cubierta.
- Encienda la unidad del controlador LED de curado UV y brille la luz (365 nm) durante 1 min.
ADVERTENCIA: La luz UV provoca quemaduras en la piel y es un agente mutagénico. Use gafas que protejan los rayos UV y cubra las manos y los brazos con guantes y una capa de laboratorio para evitar la exposición a la piel. - Para curar el adhesivo uniformemente, asegúrese de que todos los lados del anillo estén igualmente iluminados cambiando la dirección de la fuente de luz.
- Deje que el adhesivo se endurezque durante al menos 2 h, preferiblemente durante la noche.
- Sostenga firmemente la cánula desde el extremo abierto del anillo de metal por medio de un hemostat. Usando un taladro dental equipado con un archivo giratorio y trabajando bajo el estereoscopio, archive el exceso de cubrevidrio de vidrio hasta que esté al ras con los lados del anillo (Figura1A).
2. Implantación de la cánula de imagen sobre el hipocampo dorsal
- Preparación del equipo y configuración
- Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos estén limpios y estériles. Si utiliza un esterilizador de perlas de vidrio para la esterilización, limpie los instrumentos y colóquelos en el esterilizador (establecido a 250 oC) durante 10 minutos, antes de su uso. Alternativamente, autoclave los instrumentos antes de su uso.
- Preparar todos los materiales necesarios para la cirugía, así como los instrumentos quirúrgicos, para que puedan ser alcanzados fácilmente.
- Asegúrate de que haya suficientes medicamentos recién preparados, como analgésicos o antiinflamatorios.
- Asegúrese de que haya suficiente isoflurano durante toda la duración de la cirugía (aproximadamente 1 h por cirugía).
- Encienda la alfombra de calefacción y establézquela a 37 oC para mantener la temperatura de los animales estable mientras está bajo anestesia.
- Asegúrese de que el sistema de barrido de isoflurano está funcionando.
- Abra la válvula de flujo de oxígeno.
- Inducción de anestesia y fijación animal
- Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia en 3% de isoflurano en 1 L/min O2 y espere hasta que pierda el conocimiento. Evalúe la anestesia con la prueba de reflejo de pellizcar del dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Pesa el animal.
- Aplicar medicamentos antiinflamatorios (Meloxicam, 1mg/Kg) y analgésicos (Vetalgin, 200mg/kg) por vía subcutánea.
- Coloque el ratón sobre la alfombra de calefacción. Asegúrese de que el animal no esté en contacto directo con la alfombra calefactora para evitar quemaduras térmicas.
- Fije la cabeza al aparato estereotáctico y coloque el cono de la nariz para cubrir el hocico. Para mantener la anestesia, disminuir el isoflurano a 1.5-2%. A lo largo de la cirugía, monitoree el estado del ratón monitoreando visualmente la respiración y probando el reflejo de pellizcar del dedo del dedo del tiempo. Regular el porcentaje de isoflurano si es necesario.
- Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y la posible ceguera.
NOTA: Para la anestesia y los medicamentos para animales, son posibles métodos alternativos y medicamentos. Por favor, consulte su licencia de animal y la literatura relativa.
- Implantación de cánula óptica
- Encienda la fuente de luz de fibra óptica.
- Retire el cabello y desinfecte la piel sobre la cabeza del ratón.
- Con tijeras y fórceps, retire el cuero cabelludo del ratón. Comienza haciendo un pequeño corte en el cuero cabelludo en una posición cercana a la lambda. Continúe abriendo el cuero cabelludo en los dos lados. Primero muévete lateralmente en la dirección de las orejas, luego rostrally, en la dirección de las órbitas oculares, para formar un triángulo en el eje sagital, aproximadamente 4 mm rostral a bregma. Preste atención para no cortar demasiado cerca de los oídos y los ojos, pero exponer bregma y lambda, así como los huesos parietales y la mitad posterior de los huesos frontales.
- Aplique una gota (10 mg) de lidocaína (28,9% v/v en alcohol) en el cráneo.
- Limpiar el periosteum y secar el cráneo con un hisopo de algodón.
- Coloque las barras de los oídos, para fijar la cabeza del ratón.
- Haga una pequeña craneotomía, usando un micro-taladro con una rebaba de 0.5 mm de ancho. Coloque el agujero en el hueso frontal opuesto al hipocampo de la imagen, aproximadamente a 1,5 mm de la sutura sagital y 2 mm distante de la sutura coronal.
- Atornille un tornillo óseo de acero inoxidable de 0,86 mm de ancho en el orificio del cráneo.
- Si es necesario, limpie los escombros y seque el cráneo.
- Preparación de una mezcla de cemento adhesivo rápido
- Con una cuchara pequeña (4,5 mm de diámetro), dispensar 1-1,5 cucharadas de l-polvo en un pozo de mezcla.
- Dispensar 3-4 gotas de Quick Base en el pozo.
- Dispensar 1 gota de Catalyst universal en el pozo.
- Revuelva la mezcla durante 5-10 s utilizando un aplicador de precisión.
NOTA: Hay cementos alternativos disponibles. Consulte las instrucciones de su fabricante.
- Utilice aplicadores de precisión para aplicar cemento adhesivo rápido sobre el cráneo, el tornillo y la piel circundante. Dejar secar durante 30 s a 1 min.
- Utilice un taladro trephine de 3,0 mm de diámetro para hacer una craneotomía en el hueso parietal. Coloque el agujero aproximadamente 1,5 mm de distancia de la sutura sagital y 2 mm de distancia de la sutura lambdoid.
- Retire con cuidado el colgajo óseo.
- Compruebe el tamaño de la craneotomía usando la cánula para asegurarse de que se ajuste. Utilice un micro-taladro de 0,5 mm o 0,9 mm de ancho para agrandar la craneotomía si es necesario.
- Retire las meninges usando fórceps de Dumont.
- Ablate materia cortical, para llegar a la cápsula externa. Utilice una aguja contundente de 0,9 mm de diámetro (calibre 19) conectada a una bomba de vacío. Irrigar con salina para evitar la deshidratación del tejido expuesto y para lavar la sangre residual después de que se resuelva el sangrado. Succionar el tejido cortical lentamente, 50-100 m a la vez, hasta que la corteza se separa de la cápsula, exponiendo las fibras del cingulum o el cuerpo calloso. Cambie la aguja con frecuencia, para evitar obstrucciones.
- Las fibras se extienden principalmente en tres direcciones (Figura1B). Pela cuidadosamente las fibras dorsales hasta que las fibras más profundas(alveus del hipocampo) estén expuestas.
- Enjuague el tejido con salina. Usa fórceps delgados para sumergir la cánula inferior en salina y colocarla sobre el agujero del cráneo. La cánula y el tejido deben sellarse con salina para evitar atrapar burbujas de aire entre la cánula y el tejido.
- Empuje la cánula dentro del cráneo (Figura1C)hasta que el cubreobjetos de vidrio esté en contacto con las fibras.
- Seque bien el cráneo usando triángulos de absorción, hisopos de algodón y/o la bomba de vacío.
- Preparación de una mezcla de cemento adhesivo rápido (consulte el paso 2.3.10).
- Utilice aplicadores de precisión para aplicar cemento adhesivo rápido sobre el cráneo. Aplicar adhesivo también en el borde de la cánula. Tenga cuidado de no dejar que el adhesivo corra hacia la cánula. Dejar secar durante 30 s a 1 min.
- Utilice un brazo estereotaxico para colocar una placa de soporte de cabeza sobre la cánula, en contacto con el cráneo.
- Preparación de una mezcla de acrílico dental
- Usando una cuchara (diámetro de 9 mm), dispensar 1 cazo de nivel (1 parte) de polvo en un pozo de mezcla.
- Dispensar 2-3 partes de líquido en el mismo pozo. Cubra todo el polvo con el líquido.
- Revuelva durante 1 min con una espátula.
NOTA: Hay acrílicos alternativos disponibles. Consulte las instrucciones de su fabricante.
- Utilice una espátula o un aplicador de precisión para aplicar acrílico a través del cráneo. Cubra todo el cráneo expuesto, el tornillo y la piel abierta con acrílico dental. Esto hace que la preparación sea estable. No deje que el acrílico corra por el cuello, las orejas y los ojos.
- Deje que el acrílico se seque y endurezca durante unos 15 minutos.
- Aplique una película adhesiva extraíble en la placa del soporte de la cabeza, para evitar que los residuos entren en la cánula. Se recomienda que el tamaño de la película coincida con el de la placa.
- Apague el flujo de isoflurano, retire al animal del aparato estereotáctico y colóquelo en una placa de calentamiento para mantener la temperatura corporal fisiológica mientras se despierta de la anestesia.
- Monitoree al animal hasta que haya recuperado suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal.
- Devolver el animal que se ha sometido a cirugía a la compañía de otros animales sólo cuando esté completamente recuperado.
3. Cuidado postoperatorio
- Compruebe el estado del ratón durante 2 días después de la cirugía, monitoreando el peso y el comportamiento general.
- Aplicar medicamentos antiinflamatorios (Meloxicam, 1mg/Kg) y analgésicos (Vetalgin, 200mg/kg) por vía subcutánea durante 2 días después de la cirugía
NOTA: Los procedimientos alternativos de monitoreo, medicamentos y dosis son posibles para la atención postoperatoria. Por favor, consulte su licencia de animal y la literatura relativa.
4. Preparación de la sesión de imágenes
- Encienda la configuración de imágenes por adelantado y deje que el láser se caliente y se estabilice, si es necesario.
- Anestetizar el ratón (consulte el paso 2.2.1).
- Utilice fórceps para retirar cuidadosamente la película adhesiva de la placa del soporte de la cabeza. Sostenga el ratón en una mano y la placa del soporte de la cabeza con los dedos. Retire la película suavemente, para evitar dañar la preparación.
- Coloque el ratón debajo del microscopio, sobre la alfombra calefactora y fije la placa de la cabeza al soporte (Figura1D).
- Coloque el cono nasal para cubrir el hocico y disminuya el isoflurano a 1,5-2%.
- Aplique pomada oftálmica a los ojos del ratón.
- Limpie la cánula de imágenes encerrando con agua desionizada. Utilice una jeringa y una aguja delgada para soltar agua en la cánula y una bomba de vacío para extraerla.
5. Sesión de imágenes
- Utilice objetivos de bajo aumento y larga distancia de trabajo para comprobar visualmente la cánula en busca de agua residual, suciedad, integridad y presencia de fluorescencia.
- Alinee la cánula con el eje óptico ajustando los ángulos de los brazos del soporte de la cabeza.
- Cambie a los objetivos de inmersión en agua 25X 1.0 NA, 4 mm WD o 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Agregue suficiente agua desionizada para llenar la cánula y mantener el exceso de agua enlaparte de la cánula. Evitar la formación de burbujas de aire.
- Utilice señales fluorescentes de imagen y excitación 2P.
NOTA: El protocolo de imágenes depende en gran medida del tiempo y las escalas espaciales que se van a crear imágenes. Consulte los resultados representativos de las secciones y la discusión para obtener más información sobre la configuración de imágenes que hemos utilizado para producir las imágenes que se muestran en este artículo.
Representative Results
Dado que la cánula se coloca simplemente dorsal a CA1, el aspecto dorsal del CA1 es más proximal al microscopio si se compara con el ventral. El alveus es la estructura más proximal seguida en orden por el estrato oriens (SO), el estrato piramidal (SP), el estrato radiatum (SR) y el estrato lacunos moleculare (SLM), la capa más distal (Figuras 1B), la capa más distal (Figuras1B , C). Las imágenes longitudinales 2P de la estructura neuronal con resolución subcelular y de plasticidad evocada por la actividad con resolución celular se presentan como resultados representativos. Para excitar la proteína fluorescente verde (GFP), d2Venus y TurboFP635, se utiliza un láser Ti:Sapphire pulsado por femtosegundo sintonizado a 920 nm y la potencia media del láser se ajusta a 5-25 mW en la muestra. Las diferentes longitudes de onda de emisión se separan utilizando filtros de emisión y diferentes tubos fotomultiplicadores.
Imagen longitudinal de la estructura dendrítica y la dinámica de las espinas dendríticas.
Para etiquetar escasamente los PN hipocampales y visualizar su estructura, se utiliza una línea de ratón transgénica Thy1-GFP (línea M). Los ratones Thy1-GFP expresan un GFP mejorado citóflámicos bajo el control del promotor Thy1 en una población escasa y aleatoria de PNs25. Generalmente, el eje principal de los PN CA1 es aproximadamente perpendicular al plano de imagen XY (Figuras1B, Figura 2A y Película Suplementaria 1). Las dendritas basales se extienden en el SO, desde el soma hacia la cánula, mientras que las dendritas apicales y apicales se extienden distalmente a la cánula, en la dirección opuesta (Películasuplementaria 1). Dado que la preparación deja intactas las fibras más profundas del alveus, algunas fibras fluorescentes que atraviesan el campo de visión, justo debajo de la cánula, deben ser visibles (Figura2A y Película 1). La preparación permite la toma de imágenes de dendritas PN con resolución de columna vertebral (Figura2 A-C). Para la imagen de dendritas y espinas dendríticas, se utiliza una lente objetivo comercial de inmersión en agua de 25X 1.0 NA, 4 mm WD.
Para el seguimiento longitudinal, varias regiones cerebrales dentro del campo de visión de la cánula se definen durante la primera sesión de imágenes. Cada región corresponde a un área de aproximadamente 240 x 240 m y contiene entre 1 y 7 segmentos dendríticos (Figura2B). Estas regiones se asignan manualmente a una pila tridimensional de bajo aumento que muestra el patrón de expresión GFP en el volumen por debajo de la cánula de imagen (Figura2A). A continuación, se adquieren 1 m de dendritas basales CA1 PN en diferentes intervalos de tiempo (de 24 h a 3 días) durante un máximo de 14 días (Figura2C). Las duraciones e intervalos de imágenes más largos son posibles26. Cada sesión de diagnóstico por imágenes dura aproximadamente de 60 a 90 min. Aunque la mayoría de las imágenes son de espinas dendríticas en el SO, también es posible imágenes de espinas dendríticas en las dendritas oblicuas de SR (Figuras 2D-F). Además de la densidad de la columna vertebral, este método permite el estudio de la dinámica de la columna vertebral mediante la cuantificación de sus tasas de supervivencia, ganancia y pérdida26,27,28,29,30, 31 , 32. Para puntuar y realizar un seguimiento de las espinas dendríticas a lo largo del tiempo (figura2C),se utiliza una interfaz MATLAB personalizada. Esto permite la alineación de las pilas de imágenes adquiridas en diferentes puntos de tiempo y admite el etiquetado manual de dendritas y espinas mientras se realiza un seguimiento de longitudes dendríticas y posiciones de columna vertebral a lo largo del tiempo26. Es importante destacar que este método se puede utilizar para distinguir (por cada punto de tiempo, excluyendo el primero) entre las espinas dendríticas preexistentes y recién nacidas. Esto es importante ya que se cree que las diferentes clases de espinas dendríticas tienen diferentes roles en la adquisición y retención de memoria33.
Imagen longitudinal de la plasticidad evocada porla actividad.
Para la plásticaidad evocada por la actividad en los PN CA1, el área del hipocampo CA1 dorsal se inyecta con un vector viral que expresa d2Venus fluorescente verde desestabilizado a través de una forma mejorada del elemento sensible a la actividad sináptica (E-SARE) dentro del Arco potenciador/promotor y fluorescente rojo TurboFP635 a través del promotor ePGK 34. Esto permite obtener niveles de imagen de plasticidad evocada por la actividad de cientos de PN CA1 en cada animal35. Dado el etiquetado muy denso de los PN, generalmente no es posible resolver las dendritas de los PN CA1 (PelículaSuplementaria 2).
Para tomar imágenes de los somatas de los PN CA1, se utiliza una lente objetivo de inmersión en agua de 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Para el seguimiento longitudinal, se definen de 1 a 9 regiones cerebrales por ratón durante la primera sesión de imágenes. Cada región corresponde a un área de aproximadamente 300 x 300 m y contiene entre 50 y 150 celdas (Figura3A). Estas regiones se asignan manualmente a puntos de referencia de tejido locales visibles con un aumento menor. A continuación, se adquieren pilas de imágenes de paso z de 3 m, que abarcan el SP de pN CA1 (figura3A y película suplementaria 2) en diferentes intervalos de tiempo (de 24 h a 6 días) durante un máximo de 30 días. Cada sesión de diagnóstico por imágenes dura aproximadamente 60 a 90 min. La activación de E-SARE alcanza los picos de 6 a 8 h después de una exposición a un entorno nuevo o enriquecido (EE, Figura 3B)y decae en el transcurso de unos pocos días. Por lo tanto, generalmente imagen de 6 a 8 h después de la experiencia y permitir 5 días entre las sesiones de imágenes35.
Para cuantificar los valores de fluorescencia d2Venus y TurboFP635, se dibuja una región circular de interés de 4,64 m de diámetro, que es más pequeña que un cuerpo de células neurales, centrada en el soma celular. Luego progresamos al siguiente punto de tiempo, puntuamos el soma de la misma célula de la misma manera, e iteramos este procedimiento para todos los puntos de tiempo y todas las celdas visibles en el dataset longitudinal. El valor medio de la emisión d2Venus de cada neurona (dependiente de la actividad) se normaliza por su emisión media (independiente de la actividad) de TurboFP635. Este método permite la investigación de la dinámica a largo plazo de la plasticidad del conjunto de CA1 PNs35 (Figura3C).
Figura 1: Preparación para imágenes ópticas cerebrales profundas in vivo. (A). Vistas superior (izquierda) y lateral (derecha) de ejemplo de imágenes cannuals. Las cánulas de imagen tienen un fondo de vidrio transparente para permitir el acceso óptico al hipocampo. (B). Descripción esquemática de la preparación que resalta la posición relativa de la cánula de imagen, un CA1 PN y las tres capas de fibras de dorsal a ventral. (C, D). Descripción esquemática de la configuración de imágenes (C) y de la fijación animal (D) durante una sesión de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen longitudinal de la estructura dendrítica y la dinámica de las espinas dendríticas. (A). Pila de imágenes 2P (Proyección de Intensidad Máxima (MIP) de 59 planos de imagen, 2 m z-espaciado) de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP en un ratón Thy1-GFP vivo. (B). Mayor aumento (MIP de 53 planos de imagen, 1 m de espaciado z) que detallan las dendritas basales ubicadas en SO. (C). Secuencia de imágenes de lapso de tiempo de un segmento dendrítico que se ha generado durante 14 días. Las puntas de flecha indican espinas dendríticas rastreadas durante 14 días. (D, E). Pila de imágenes 2P de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP en un ratón Thy1-GFP vivo; (D) Proyección ZY (31 planos de imagen, 3 m de espaciado z) y (E) proyecciones XY (17 planos de imagen, 3 m de espaciado z). (F). Mayor ampliación (plano de imagen única) que detalla dendritas apicales y espinas dendríticas ubicadas en SR. Las puntas de flecha indican espinas dendríticas. Excitación: 920 nm; pico de emisión: 510 nm. Barras de escala: A, 50 m; B, 10 m; C, 2 m; D y E, 15 m; F, 4 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen longitudinal de la plasticidad evocada por la actividad. (A). imágenes 2P (planos de imagen única) de un ratón activo, mostrando las mismas celdas en el Día de línea base 0 y después de EE en el Día 1. (B). pilas de imágenes 2P (MIPs de 4-6 planos de imagen, 3 m de espaciado z) que muestran patrones de activación E-SARE específicos para el entorno A (días 1, 19 y 25) y el entorno B (días 7 y 13). Verde: fluorescencia d2Venus. Rojo: Fluorescencia TurboFP635. Excitación: 920 nm; d2Venus pico de emisión: 530 nm; TurboFP635 pico de emisión: 635nm. Barras de escala: A, 20 m; B, 10 m. Esta cifra ha sido modificada de Attardo et al., 201835. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen de la estructura neuronal en la DG del hipocampo mediante microscopía de tres fotones (3P). (A-H). Imágenes 3P (planos de imagen única) de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP en un ratón Thy1-GFP vivo que detalla (A-E) PNs en las células de gránulo CA1 y (F-H) en la DG. Excitación: 1400 nm; pico de emisión: 510 nm. Barra de escala: 40 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementaria 1: Campo de visión de imágenes en un ratón Thy1-GFP en vivo. Pila de imágenes 2P (83 planos de imagen, 7 m z-espaciado) de neuronas y dendritas etiquetadas por GFP (blanco) en un ratón Thy1-GFP vivo que se extiende desde la parte inferior de la cánula hasta SLM. Para tener en cuenta la descomposición de la señal de fluorescencia con una profundidad creciente, utilizamos un gradiente no lineal de ganancia de tubos fotomultiplicadores. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película complementaria 2: Imagen de la plasticidad evocada por la actividad. Pila de imágenes 2P (28 planos de imagen, 3 m z-spacing) de neuronas que expresan a e-SARE reportero de expresión IEG en un ratón en vivo que abarca SP. Verde: fluorescencia d2Venus. Rojo: Fluorescencia TurboFP635. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Aquí, se describe un procedimiento para imágenes 2P repetidas del CA1 dorsal en ratones vivos. Después de la cirugía, el ratón generalmente se recupera dentro de 2 días. El procedimiento induce astrogliosis mínima26,43. La hemorragia y el edema que podrían seguir la cirugía generalmente se reabsorben dentro de 10 a 14 días. Generalmente, a partir de los 14 días después de la implantación, la preparación es lo suficientemente clara como para realizar imágenes intravitales. El éxito de la cirugía no depende de trabajar en un ambiente estéril. Sin embargo, es crucial mantener un alto nivel de higiene, para evitar complicaciones debido a infecciones asociadas a la cirugía. Esto se obtiene limpiando meticulosamente los instrumentos quirúrgicos antes y después de la cirugía y esterilizando con calor inmediatamente antes de cada uso (paso 2.1.1). La cánula óptica se mantiene en un recipiente limpio y esterilizado y se enjuaga con solución salina estéril justo antes de la implantación. La realización de prácticas quirúrgicas comunes de desinfección de manos y limpieza de la estación quirúrgica también es muy importante. La preparación se mantiene estable y permite la toma de imágenes de resolución celular y subcelular durante varias semanas26,35.
Pasos críticos, modificaciones y solución de problemas.
Es importante pelar la cápsula externa hasta que las fibras más profundas estén expuestas. Si no se expone el alveus, la incapacidad de centrarse en el soma de los PN, o en espinas dendríticas por imágenes de resolución reducida, cuando se utilizan objetivos comerciales con WD de 3 o 4 mm. Para ello, es útil ablar el neocórtex muy lentamente usando una aguja de 0,9 mm de diámetro y luego cambiar a una aguja de 0,3-0,5 mm de diámetro (calibre 24-29) para un control más fino de la succión al retirar la mayoría de las fibras dorsales. Alternativamente, los fórceps finos se pueden utilizar para eliminar la corteza restante después de la exposición a la fibra36.
El sangrado durante la cirugía puede ser problemático, ya que la sangre obstruye la vista. Se recomienda esperar a que se forme el coágulo y luego encerrarse con salina para lavar la sangre residual. Repita según sea necesario.
Un ajuste ceñido entre la cánula y la craneotomía ayuda a aumentar la estabilidad de la preparación manteniendo la cánula en su lugar antes de la aplicación del cemento, especialmente si el borde exterior de la cánula está al ras con el cráneo. Dado que los tamaños del taladro trephine y la cánula están emparejados, puede surgir un ajuste suelto debido a irregularidades en el lado de la cánula - que requieren craneotomías ligeramente más grandes para caber (ver paso 2.3.14) - o de una craneotomía irregular. Cualquier irregularidad de cánula debe ser archivada (pasos 1.3 y 1.12) y la trefina debe mantenerse perpendicular al cráneo hasta que se complete la craneotomía (paso 2.3.12). La eliminación de la trephina del cráneo antes de que se complete la craneotomía puede dar lugar a craneotomias irregulares.
Limitaciones- Invasividad y estabilidad de la preparación.
Es difícil evaluar el efecto de la ablación cortical, ya que es arduo definir con precisión las zonas afectadas directa e indirectamente. En general, la cirugía extirpa parte de la corteza parietal y parte de la corteza sensorial visual y de las extremidades posteriores21. La corteza ablada no se proyecta directamente al hipocampo y el tejido del hipocampo no se toca ni se lesiona. Es importante destacar que se ha demostrado que la implantación de una cánula de imagen no altera gravemente la función del hipocampo y específicamente el aprendizaje dependiente del hipocampo21,36,37,38, 39. Aún así, sería importante cuantificar en qué medida tanto la cánula como la parte externa del implante (placa de soporte de cabeza y tapa de acrílico dental) son estresores crónicos mediante la evaluación de los niveles de la sangre de corticosterona y el peso de la glándula suprarrenal en comparación con ratones no implantados.
La preparación generalmente se mantiene estable de semanas a meses26. A largo plazo, el crecimiento de la piel y los huesos tiende a desplazar la tapa de acrílico y a aumentar la inestabilidad de la preparación por imágenes.
Limitaciones ópticas.
La microscopía 2P convencional permite tomar imágenes de hasta 1 mm de profundidad en el tejido neocortical40,41. De acuerdo con esto, es posible tomar imágenes dendritas y espinas dendríticas ubicadas en el SR (Figura 2D-F) o SLM36. Sin embargo, la toma de imágenes a través de una cánula presenta limitaciones a la NA efectiva. Para lograr la máxima resolución, el diámetro y la profundidad de las cánulas de imagen deben coincidir con la nA de imagen, ya que los diámetros más pequeños y las profundidades más largas recortarán la luz de los objetivos de nA altos. Por ejemplo, cuando se toma imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 1,0 NA a través de una cánula de 1,6 mm de largo, se necesita un diámetro interior de 3,65 mm para mantener el NA completo. Sin embargo, el uso de una cánula de este diámetro aumentará la compresión en el hipocampo y podría afectar a la salud del tejido, por esta razón, utilizamos una cánula con un diámetro más pequeño. Cuando se toma imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 0,8 NA a través de una cánula de 1,6 mm de largo, un diámetro interior de 2,5 mm sería suficiente para mantener el NA completo. Sin embargo, los objetivos de inmersión en agua de 0,8 NA tienen un WD más corto (3 mm en nuestro caso), lo que puede evitar que se enfoque en el SP.
Estos cálculos se aplican al centro del campo de visión en la parte inferior de la cánula. Sin embargo, mover el campo de visión de imágenes de lado - más cerca de los bordes de la cánula - o enfocar más profundamente en el tejido - más lejos de la superficie de vidrio de la cánula - disminuye aún más el NA efectivo en el plano focal y, por lo tanto, reduce la resolución. Esto conducirá a una resolución no homogénea en los diferentes volúmenes de tejido con imágenes y puede ser una preocupación por las imágenes cuantitativas a resolución subcelular, especialmente cuando se utilizan técnicas de superresolución como la microscopía 2P-STED42. Estos problemas son menos importantes cuando se toma imágenes a la resolución celular.
Movimiento de tejido.
El movimiento dentro del tejido, que se origina en la respiración y los latidos del corazón en animales anestesiados, tiende a ser más grave con una mayor distancia desde la cánula de imágenes. Esto es posiblemente porque la cánula de imagen aplica presión mecánica al cerebro, lo que contrarresta parte del movimiento en las proximidades de la cánula (de forma similar a las preparaciones neocorticales). Por lo tanto, aunque la toma de imágenes de espinas dendríticas es posible en SR y SLM, en nuestras manos, es más robusto dorsal a la SO hasta 200 m de la superficie de la cánula. Para compensar el movimiento, utilizamos escáneres resonantes y promediación fuera de línea. Se adquieren varias imágenes (de 4 a 6 repeticiones) por plano de imagen de una pila z a la velocidad máxima disponible (30 fotogramas/s). Todas las repeticiones para cada plano z se desconvolved (utilizando el software comercial, AutoQuant), registrado (usando ImageJ) y promediado en una sola imagen26. Para las imágenes de somata, el movimiento a menudo es insignificante con la anestesia35 y dos promedios a menudo son suficientes para compensar los artefactos de movimiento.
Futuras aplicaciones o direcciones del método .
La preparación se puede combinar con microendoscopios26,43. Los microendoscopios son sondas ópticas rígidas que utilizan microlentes de índice de refracción de gradiente (GRIN) para guiar la luz hacia y desde el tejido profundo18. El uso de microendoscopios permite cánulas de diámetros más pequeños o incluso no cánulas en absoluto. Sin embargo, los microendoscopios comerciales están menos bien corregidos para las aberraciones ópticas y tienen nA más bajo que los objetivos comerciales. Las sondas de corriente alcanzan resoluciones laterales y axiales de 0,6-1 m, 10-12 m, respectivamente17,18,44. El uso de microendoscopios también permite la combinación de esta preparación con microscopios de campo ancho integrados montados en la cabeza45,46,47.
El método se presta también para su uso en ratones no anestesiados, y se ha utilizado para investigar la actividad celular utilizando sensores Ca2+ en ratones fijos en la cabeza despiertos21,37,48,49. En estos casos, debido a las rápidas escalas de tiempo de los cambios de fluorescencia, es aconsejable implementar el registro de línea50. También es posible adaptar la preparación para la toma de imágenes de otras subregiones hipocampales como el gyrus dentate (DG)39,51,52. Combinando esta preparación con la excitación 3P53,54 con 1 MHz frecuencia pulsada láser sintonizado a 1400 nm, pudimos imagen más profunda en la formación del hipocampo llegando a la capa molecular, capa de células gránulo y la capa de células del gránulo y la hilus de la DG (Figura 4) sin quitar la superposición CA1.
En conclusión, presentamos un método que proporciona acceso óptico al hipocampo dorsal y permite estudios longitudinales y correlativos de la dinámica de la estructura y actividad del hipocampo. Esta técnica amplía las posibilidades de análisis de la función del hipocampo en condiciones fisiológicas y patológicas.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
U. A. F. cuenta con el apoyo de la Fundación Schram; C.-W. T. P. y W. G. cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck; L.Y. y R.Y. cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck y el Instituto Nacional de Salud (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. cuenta con el apoyo de una beca del 7PM del Consejo Europeo de Investigación, los programas ERANET e I-CORE, la Oficina Principal de Científicos del Ministerio de Salud de Israel, el Ministerio Federal de Educación e Investigación, Roberto y Renata Ruhman, Bruno y Simone Lich, Nella y Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, el Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt and Irving I. Moskowitz foundations; A. A. cuenta con el apoyo de la Max Planck Society, la Fundación Schram y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Las imágenes 3P fueron adquiridas durante el Curso Avanzado de Técnicas de Neuroimagen en el Instituto Max Planck Florida de Neurociencia. El Curso Avanzado sobre Técnicas de Neuroimagen es apoyado por la Sociedad Max Planck, el programa de Becas Científicas Max Planck del Estado de Florida y el programa de Asociación de La Corporación del Instituto Max Planck Florida. Nos gustaría agradecer a Thorlabs, Coherent y SpectraPhysics por proporcionar soporte y equipo para el sistema de imágenes 2P / 3P durante el curso. También estamos agradecidos a Henry Haeberle y Melissa Eberle por la ayuda con el sistema durante el curso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
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