Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

التصوير الطولي اثنين من الفوتون من CA1 فرس النهر الأورسيال في الفئران الحية

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/59598
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 1,4, 1
1Dept. of Stress Neurobiology and Neurogenetics, Max Planck Institute of Psychiatry, 2Graduate School of Systemic Neurosciences, Ludwig Maximilians University, 3Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 4Dept. of Neurobiology, Weizmann Institute of Science

Summary

تصف هذه الطريقة إعداد مزمن يسمح بالوصول البصري إلى الحصين من الفئران الحية. ويمكن استخدام هذا الإعداد لأداء التصوير البصري الطولي من اللدونة الهيكلية العصبية واللدونة الخلوية التي تثير النشاط على مدى عدة أسابيع.

Abstract

يعتبر الفحص المجهري ثنائي الفوتون أداة أساسية لعلوم الأعصاب لأنه يسمح بالتحقيق في دماغ الحيوانات الحية على نطاقات مكانية تتراوح بين مستويات دون الخلية إلى مستويات الشبكة وعلى نطاقات زمنية من مللي ثانية إلى أسابيع. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين التصوير بالفوتونين مع مجموعة متنوعة من المهام السلوكية لاستكشاف العلاقات السببية بين وظيفة الدماغ والسلوك. ومع ذلك، في الثدييات، والاختراق المحدود وتشتت الضوء محدودة اثنين من الفوتون التصوير داخل الحيوية في الغالب إلى مناطق الدماغ السطحية، وبالتالي منع التحقيق الطولي من مناطق الدماغ العميق مثل الحصين. يشارك الحصين في الملاحة المكانية والذاكرة العرضية وهو نموذج طويل الأمد يستخدم لدراسة العمليات الخلوية وكذلك المعرفية الهامة للتعلم والتذكير، سواء في الصحة أو المرض. هنا، يتم تفصيل إعداد التي تمكن الوصول البصري المزمن إلى الحصين الظهري في الفئران الحية. ويمكن الجمع بين هذا الإعداد مع التصوير البصري اثنين من الفوتون في دقة الخلوية ودون الخلوية في الرأس ثابتة، والتخدير الفئران الحية على مدى عدة أسابيع. هذه التقنيات تمكين التصوير المتكرر للبنية العصبية أو اللدونة التي تثيرها الأنشطة في عشرات إلى مئات من الخلايا العصبية في CA1 فرس النهر الظهري. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الإعداد المزمن جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى مثل التنظير المجهري الدقيق، والفحص المجهري الميداني الواسع المثبت على الرأس أو الفحص المجهري ثلاثي الفوتون، وبالتالي توسيع نطاق الأدوات بشكل كبير لدراسة العمليات الخلوية والشبكة المعنية في التعلم والذاكرة.

Introduction

في الثدييات، والحصين هو منطقة الدماغ الرئيسية لترميز واستدعاء الذكريات العرضيةوكذلك للملاحة المكانية 1،2،3،4. لهذا السبب، كان الحصين - ولا يزال - نموذجا هاما جدا لدراسة الآليات الأساسية التي تسمح للدماغ لترميز واستدعاء الذكريات5و6و7 أو للتنقل في بيئة8 ،9 جمع المكافآت وتجنب المخاطر. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تشكيل فرس النهر هي واحدة من مناطق الدماغ حيث يتم توليد الخلايا العصبية الجديدة في جميع أنحاء حياة القوارض10،11 ، وربما ، من البشر12،13. وأخيرا، يرتبط انحطاط أو ضعف تشكيل فرس النهر مع الاضطرابات العصبية والنفسية، بما في ذلك مرض الزهايمر14.

في الفئران، ويقع الحصين ما يقرب من 1 ملم تحت سطح الدماغ15. وقد منع موقعها الوصول البصري في الدماغ سليمة، وبالتالي، اعتمدت الدراسات الطولية لديناميات فرس النهر في الغالب على التصوير بالرنين المغناطيسي (MR)، والفيزيولوجيا الكهربائية، وتحليلات التصوير في الجسم الحي السابق. طرق التصوير بالرنين المغناطيسي تسمح تتبع العمليات البيولوجية (على سبيل المثال، تغيير التعبير الجيني16)في نفس الحيوان على مدى عدة أيام، ولكن تفتقر إلى القرار المكاني للتمييز الخلايا العصبية واحدة. الكلاسيكية في التقنيات الكهرولوجية الجسم توفر دقة زمنية عالية جدا وحساسية رائعة للتغيرات في إمكانات الغشاء. ومع ذلك، لديهم دقة مكانية محدودة، وأنها تفتقر إلى القدرة على تتبع موثوق بها نفس الخلايا على مدى فترات زمنية أطول. يسمح التصوير البصري بدراسة العمليات الأكثر تنوعاً بفضل استبانتها الزمنية والمكانية العالية. ومع ذلك، فإن التصوير في الجسم الحي السابق لا يوفر سوى لقطات من العمليات الجارية، وبالتالي فإنه ليس مناسبا للدراسات الطولية التي تتعلم الحيوانات المعلومات وتستدعيها.

في التصوير البصري في الجسم الحي يجمع بين بعض مزايا التصوير بالرنين المغناطيسي والفيزيولوجيا الكهربائية مع مزايا التصوير البصري. ولذلك، فهي مناسبة بشكل جيد جدا للتحليلات الطولية والمترابطة لديناميات الدماغ الماوس والسلوك. وهذا أمر مهم في دراسات العمليات البيولوجية مع جداول زمنية سريعة جدا (مللي ثانية إلى ثانية) أو بطيئة جدا (أيام إلى أسابيع). أمثلة لمثل هذه العمليات ذات الصلة لعلوم الأعصاب هي ديناميات الجهد الغشاء، Ca2+ العابرين، اللدونة الخلوية والتغيرات الهيكلية، والتي يعتقد أن جميعها مهمة جدا لتكوين الذاكرة وأذكر. وقد امتدت أساليب مختلفة في التصوير الحي إلى الحصين الظهري18،19،20،21،22. وقد سمحت الاستعدادات الحادة تتبع نشاط الخلايا العصبية الهرمية (PN) وكذلك dendrites والعمود الفقري الددريل لعدة ساعات20،22. غير أن هذا الإطار الزمني الزمني لا يسمح بدراسة التغييرات الهيكلية الطويلة الأجل، التي قد تكون وراء التعلم التدريجي. الاستعدادات المزمنة - جنبا إلى جنب مع المناظير الدقيقة23،24 أو مع أهداف المجهر القياسية لمسافات طويلة (WD)21 - مكنت التصوير المتكرر للالحصين الظهري على مدى عدة اسابيع.

هنا، نقوم بوصف إعداد مزمن يوفر الوصول البصري المتكرر إلى المجال الفرعي CA1 من الحصين الظهري للفئران الحية باستخدام قنية التصوير المدرجة بشكل دائم. يسمح هذا الإعداد بالوصول المتكرر إلى CA1 دون اضطراب وظيفي وهو مناسب لتصوير الفوتون ثنائي الفوتون (2P) أو اللاإحتام الواسع المجال. وهناك مثالان على التصوير المزمن في الدماغ العميق 2P في CA1 الظهرية للفئران الحية مفصلة: التصوير الطولي للبنية التقشرية وديناميات العمود الفقري الددرية والتصوير الطولي لللدونة التي تثير النشاط. وتناقش المزايا البارزة والقيود البارزة لهذه التقنية.

Protocol

وقد وافقت على جميع الأساليب الموصوفة من قبل حكومة بافاريا العليا (ترخيص 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48) ومعهد ستانفورد وماكس بلانك فلوريدا للأفرقة الإدارية لعلوم الأعصاب في مجال رعاية الحيوانات المختبرية.

1. إعداد قنية التصوير

  1. عقد الحفر الدقة على موقف الحفر الموردة مع جدول مسطرة المنقولة.
  2. المشبك أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها 3.0 ملم على طاولة المسطرة المنقولة.
  3. قطع الأنبوب إلى حلقة معدنية بطول 1.6 ملم. إذا كانت حواف الحلبة ليست حادة بعد القطع، ملف من المخالفات.
  4. شطف حلقة معدنية وغطاء زجاجي دائري قطرها 4 ملم في الأسيتون 100٪ وترك لتجف لمدة 5 دقائق.
  5. ضع الحلقة المعدنية وغطاء الزجاج على مكان عمل سلس وناعم ونظيف، تحت منظار مجسم.
  6. ضع قطرة من الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصق بصري على سطح أملس، مثل طبق بيتري. استخدم إبرة أو ملعقة لنشر اللاصق لتشكيل طبقة رقيقة (<0.5 مم).
  7. استخدام ملقط لتراجع جانب واحد من الحلقة المعدنية في لاصقة. إيلاء اهتمام خاص لعدم ختم داخل الحلبة. إذا حدث هذا، استخدم إبرة لكسر لاصق بصري في الحلبة.
  8. باستخدام منظار مجسم، ضع الحلقة المعدنية في وسط غطاء الزجاج مع جانب الحلقة المغطاة بلمس لاصق للغطاء. حلقة رقيقة من لاصقة يجب أن تشكل في واجهة بين حلقة معدنية وغطاء. تجنب أي مادة لاصقة تنتشر إلى مركز غطاء.
  9. قم بتشغيل وحدة تشغيل LED المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية وتألق الضوء (365 نانومتر) لمدة دقيقة واحدة.
    تحذير: ضوء الأشعة فوق البنفسجية يثير حروق الجلد وهو عامل مطفرة. ارتداء نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية وتغطية اليدين والذراعين مع القفازات ومعطف المختبر لتجنب التعرض للجلد.
  10. لعلاج لاصق بالتساوي، تأكد من أن جميع جوانب الحلبة مضاءة على قدم المساواة عن طريق تغيير اتجاه مصدر الضوء.
  11. اسمحوا لاصق تصلب لمدة 2 ساعة على الأقل، ويفضل، بين عشية وضحاها.
  12. عقد بحزم قنية من نهاية مفتوحة من حلقة معدنية عن طريق hemostat. باستخدام مثقاب الأسنان مزودة ملف الدورية والعمل تحت منظار مجسم، ملف قبالة غطاء الزجاج الزائد حتى دافق مع جانبي الحلبة (الشكل1A).

2. زرع قنية التصوير على الحصين الظهري

  1. إعداد المعدات والإعداد
    1. تأكد من أن جميع الأدوات الجراحية نظيفة ومعقمة. إذا كنت تستخدم معقم حبة زجاجية للتعقيم، قم بتنظيف الأدوات ووضعها في المعقم (تعيين إلى 250 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق، قبل الاستخدام. بدلا من ذلك، الأوتوكلاف الأدوات قبل الاستخدام.
    2. إعداد جميع المواد اللازمة للعملية الجراحية، فضلا عن الأدوات الجراحية، بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة.
    3. تأكد من وجود ما يكفي من الأدوية الطازجة مثل مسكنات الألم أو الأدوية المضادة للالتهابات.
    4. تأكد من وجود ما يكفي من isoflurane طوال مدة الجراحة (حوالي 1 ساعة لكل عملية جراحية).
    5. تشغيل سجادة التدفئة وتعيينها إلى 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الحيوان مستقرة أثناء التخدير.
    6. تأكد من أن نظام المسح للisoflurane يعمل.
    7. فتح صمام تدفق الأكسجين.
  2. تحريض التخدير، وتثبيت الحيوان
    1. ضع الماوس في غرفة التخدير التعريفي في 3٪ isoflurane في 1 L / دقيقة O2 والانتظار حتى يفقد الوعي. تقييم التخدير باستخدام اختبار رد الفعل قرصة القدم.
    2. وزن الحيوان.
    3. تطبيق المضادة للالتهابات (ميلوكسيكام، 1ملغ / كغ) ومسكن الألم (Vetalgin، 200mg/kg) المخدرات تحت الجلد.
    4. وضع الماوس على سجادة التدفئة. تأكد من أن الحيوان ليس على اتصال مباشر مع سجادة التدفئة لتجنب الحروق الحرارية.
    5. تأمين الرأس إلى جهاز مجسمة ووضع مخروط الأنف لتغطية الوضع مغنم. للحفاظ على التخدير، وانخفاض isoflurane إلى 1.5-2٪. طوال الجراحة، ومراقبة حالة الماوس عن طريق رصد بصريا التنفس واختبار اصبع القدم قرصة رد الفعل. تنظيم نسبة الأيسوفلوران إذا لزم الأمر.
    6. تطبيق مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف والعمى المحتمل.
      ملاحظة: للتخدير والأدوية الحيوانية، يمكن استخدام طرق بديلة وأدوية. من فضلك، راجع رخصة الحيوان الخاصة بك والأدب النسبي.
  3. زرع قنية بصرية
    1. تشغيل مصدر ضوء الألياف البصرية.
    2. إزالة الشعر وتطهير الجلد فوق رأس الماوس.
    3. باستخدام مقص وملقط، وإزالة فروة الرأس الماوس. ابدأ بإجراء قطع صغير في فروة الرأس في وضع قريب من لامدا. استمر بفتح فروة الرأس على الجانبين. الخطوة الأولى أفقيا في اتجاه الأذنين، ثم rostrally، في اتجاه مدارات العين، لتشكيل مثلث على محور sagittal، ما يقرب من 4 ملم rostral إلى bregma. إيلاء الاهتمام لا لقطع قريبة جدا من الأذنين والعينين، ولكن فضح بريجما ولامدا، فضلا عن العظام الجدارية والنصف الخلفي من العظام الأمامية.
    4. تطبيق قطرة واحدة (10 ملغ) من ليدوكائين (28.9٪ الخامس / الخامس في الكحول) على الجمجمة.
    5. مسح periosteum وتجفيف الجمجمة باستخدام مسحة القطن.
    6. ضع أشرطة الأذن لإصلاح رأس الماوس.
    7. إجراء عملية استئصال الجمجمة الصغيرة، وذلك باستخدام الحفر الصغيرة مع لدغ عرض 0.5 ملم. ضع الثقب في العظم الأمامي المقابل لالحصين المصوّر، حوالي 1.5 مم من خياطة الترهل و2 مم بعيدًا عن الغرزالإكليلية.
    8. المسمار 0.86 مم عرض المسمار العظام الفولاذ المقاوم للصدأ في حفرة الجمجمة.
    9. إذا لزم الأمر، وتنظيف الحطام وتجفيف الجمجمة.
    10. إعداد خليط من الأسمنت اللاصق السريع
      1. باستخدام ملعقة صغيرة (، قطر 4.5 ملم)، الاستغناء عن 1-1.5 مغرفة مستوى من مسحوق L في بئر خلط.
      2. الاستغناء عن 3-4 قطرات من قاعدة سريعة في البئر.
      3. الاستغناء عن قطرة واحدة من محفز العالمي في البئر.
      4. حرّك المزيج لمدة 5-10 ق باستخدام قضيب دقيق.
        ملاحظة: تتوفر الأسمنتات البديلة. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة الخاصة بهم.
    11. استخدام تطبيق الدقة لتطبيق الاسمنت لاصقة سريعة على الجمجمة، المسمار والجلد المحيطة بها. دعيه يجف لمدة 30 إلى 1 دقيقة.
    12. استخدم مثقاب ترفين قطره 3.0 مم لإجراء عملية استئصال الجمجمة في العظم الجداري. وضع ثقب ما يقرب من 1.5 ملم بعيدا عن خياطة sagittal و 2 مم بعيدا عن خياطة lambdoid.
    13. إزالة بعناية رفرف العظام.
    14. تحقق من حجم استئصال الجمجمة باستخدام قنية للتأكد من أنه يناسب. استخدم مثقاب صغير بعرض 0.5 مم أو 0.9 مم لتكبير استئصال الجمجمة إذا لزم الأمر.
    15. إزالة السحائية باستخدام ملقط Dumont.
    16. المادة القشرية الأب، للوصول إلى الكبسولة الخارجية. استخدم إبرة حادة قطرها 0.9 مم (مقياس 19) متصلة بمضخة فراغ. الري مع المالحة لتجنب جفاف الأنسجة المكشوفة وغسل الدم المتبقي بعد حل النزيف. تمتص الأنسجة القشرية ببطء ، و50-100 ميكرومتر في وقت واحد ، حتى تنفصل القشرة عن الكبسولة ، مما يعرض ألياف الكليوم أو الجسم الكالوسوم. تغيير الإبرة في كثير من الأحيان، لمنع انسداد.
    17. الألياف تمتد أساسا في ثلاثة اتجاهات (الشكل1B). قشر بعناية الألياف الظهرية حتى تتعرض أعمق الألياف(الفيسوس من الحصين).
    18. شطف الأنسجة مع المالحة. استخدام ملقط رقيقة لتراجع قنية القاع في المالحة ووضعها على ثقب الجمجمة. قنية والأنسجة يجب أن تكون مختومة من قبل المالحة لتجنب محاصرة فقاعات الهواء بين قنية والأنسجة.
    19. دفع قنية في الجمجمة (الشكل1C)حتى غطاء الزجاج هو في اتصال مع الألياف.
    20. تجفيف الجمجمة جيدا باستخدام مثلثات الامتصاص، مسحات القطن و / أو مضخة فراغ.
    21. إعداد خليط من الأسمنت اللاصق السريع (راجع الخطوة 2-3-10).
    22. استخدام التطبيق الدقيق لتطبيق الاسمنت لاصقة سريعة على الجمجمة. تطبيق لاصق أيضا على حافة قنية. يجب الحرص على عدم السماح لللاصق تشغيل في قنية. دعيه يجف لمدة 30 إلى 1 دقيقة.
    23. استخدام ذراع مجسمة لوضع لوحة حامل الرأس على قنية، في اتصال مع الجمجمة.
    24. إعداد خليط من الاكريليك الأسنان
      1. باستخدام ملعقة (قطرها 9 مم)، الاستغناء عن مغرفة مستوى 1 (1 جزء) من مسحوق في بئر خلط.
      2. الاستغناء عن 2-3 أجزاء من السائل في نفس البئر. تغطية مسحوق كامل مع السائل.
      3. يُحرّك المزيج لمدّة دقيقة واحدة باستخدام ملعقة.
        ملاحظة: الاكريليك البديلة متوفرة. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة الخاصة بهم.
    25. استخدام ملعقة أو قضيب الدقة لتطبيق الاكريليك عبر الجمجمة. تغطية الجمجمة المكشوفة بأكملها، المسمار والجلد المفتوح مع الاكريليك الأسنان. وهذا يجعل الإعداد مستقراً. لا تدع الاكريليك تشغيل أسفل الرقبة والأذنين والعينين.
    26. اسمحوا الاكريليك الجافة وتصلب لمدة 15 دقيقة.
    27. تطبيق فيلم لاصق قابل للإزالة على لوحة حامل الرأس، لمنع الحطام من دخول قنية. من المستحسن أن حجم الفيلم يطابق حجم اللوحة.
    28. إيقاف تدفق isoflurane، وإزالة الحيوان من جهاز مجسمة ووضعه على لوحة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية في حين أنه يستيقظ من التخدير.
    29. مراقبة الحيوان حتى أنه قد استعاد الوعي الكافي للحفاظ على recumbency صارمة.
    30. إعادة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية إلى الشركة من الحيوانات الأخرى فقط عندما تعافى تماما.

3. الرعاية بعد العملية الجراحية

  1. تحقق من حالة الماوس لمدة يومين بعد الجراحة، من خلال مراقبة الوزن والسلوك العام.
  2. تطبيق الأدوية المضادة للالتهابات (ميلوكسيكام، 1 ملغ / كغ) ومسكن الألم (فيتالجين، 200 ملغ/كغ) تحت الجلد لمدة يومين بعد الجراحة
    ملاحظة: إجراءات الرصد البديلة, الأدوية والجرعات ممكنة للرعاية بعد العملية الجراحية. من فضلك، راجع رخصة الحيوان الخاصة بك والأدب النسبي.

4- التحضير لجلسة التصوير

  1. قم بتشغيل إعداد التصوير مسبقًا ودع الليزر يسخن ويستقر، إذا لزم الأمر.
  2. التخدير الماوس (راجع الخطوة 2.2.1).
  3. استخدام ملقط لإزالة بعناية فيلم لاصق من لوحة حامل الرأس. عقد الماوس في اليد ولوحة حامل الرأس مع الأصابع. إزالة الفيلم بلطف، لتجنب الإضرار الإعداد.
  4. وضع الماوس تحت المجهر، على سجادة التدفئة وتأمين لوحة الرأس إلى حامل (الشكل1D).
  5. وضع مخروط الأنف لتغطية الإنزم وتقليل isoflurane إلى 1.5-2٪.
  6. تطبيق مرهم العيون على عيون الماوس.
  7. تنظيف قنية التصوير عن طريق المنزوعة بالماء منزوع الأيونات. استخدام حقنة وإبرة رقيقة لإسقاط الماء في قنية ومضخة فراغ لإزالته.

5. جلسة تصوير

  1. استخدام التكبير منخفضة، وأهداف مسافة العمل لمسافات طويلة للتحقق بصريا قنية للمياه المتبقية، والأوساخ، والنزاهة ووجود الفلورة.
  2. محاذاة قنية إلى محور البصرية عن طريق ضبط زوايا الأسلحة حامل الرأس.
  3. قم بالتبديل إلى 25X 1.0 NA، 4 مم WD أو 40X 0.8 NA، 3 مم WD، أهداف غمر المياه. إضافة ما يكفي من الماء منزوع الأيونات لملء قنية والحفاظ على المياه الزائدة على رأس قنية. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
  4. استخدام 2P الإثارة وإشارات الفلورسنت الصورة.
    ملاحظة: يعتمد بروتوكول التصوير بشكل كبير على الوقت والمقاييس المكانية التي سيتم تصويرها. يرجى الرجوع إلى نتائج القسم التمثيلية والمناقشة للحصول على تفاصيل حول إعدادات التصوير التي استخدمناها لإنتاج الصور الموضحة في هذه المقالة.

Representative Results

منذ يتم وضع قنية الظهرية فقط إلى CA1، والجانب الظهري من CA1 هو أكثر شبه اكسيال إلى المجهر إذا ما قورنت بواحد بطني. الفيلوس هو الهيكل الأكثر تقاربا تليها في الترتيب من قبل الطبقة oriens (SO)، الطبقة الهرمية (SP)، الطبقة رادياتوم (ريال) والطبقة lacunosum الجزيئية (SLM)، والطبقة الأكثر تبعد (أرقام1B ،C). يتم تقديم التصوير الطولي 2P من بنية الخلايا العصبية مع القرار دون الخلوية واللدونة التي تثيرها الأنشطة مع القرار الخلوي كنتائج تمثيلية. لإثارة بروتين فلورسنت أخضر فلوروس فلوروس فلوروس (GFP)، d2Venus وTurboFP635، يتم استخدام ليزر فيمتوثانية نابض Ti:Sapphire ضبطها إلى 920 نانومتر ويتم تعديل متوسط قوة الليزر إلى 5-25 مللي واط في العينة. يتم فصل أطوال موجية الانبعاثات المختلفة باستخدام مرشحات الانبعاثات وأنابيب مضاعف ضوئي مختلفة.

التصوير الطولي للبنية التقشرية وديناميات العمود الفقري التقشري.

لتسمية قليلة الشبكات الافتراضية الخاصة فرس النهر وتصور بنيتها، يتم استخدام خط الماوس المعدلوراثيا Thy1-GFP (خط M). الفئران Thy1-GFP التعبير عن السيتوبلازمية تعزيز GFP تحت سيطرة المروج Thy1 في عدد قليل، والسكان عشوائية من النفثالينات25. بشكل عام، المحور الرئيسي للشبكات الشخصية CA1 عمودي تقريبًا على مستوى التصوير XY (الأشكال1B والشكل 2A والفيلم التكميلي1). تمتد الدندريات القاعدية القاعدية في SO، من سوما نحو قنية، في حين أن dendrites خصلات apical وapical تمتد بشكل غير مستقط إلى قنية، في الاتجاه المعاكس (الفيلمالتكميلي1). منذ إعداد يترك أعمق الألياف من الفيزيوس سليمة، وعدد قليل من الألياف الفلورية عبور مجال الرؤية، فقط تحت قنية، ينبغي أن تكون مرئية (الشكل2A والفيلم 1). إعداد يسمح تصوير dendrites PN مع قرار العمود الفقري (الشكل2 A-C). لتصوير dendrites والعمود الفقري dendritic، ويستخدم 25X 1.0 NA، 4 مم WD، المياه الغمر عدسة الهدف التجاري.

لتتبع طولية، يتم تعريف العديد من مناطق الدماغ داخل مجال رؤية قنية خلال جلسة التصوير الأولى. وتقابل كل منطقة مساحة تبلغ حوالي 240 × 240 درجة مئوية وتحتوي على ما بين 1 و7 أجزاء من التقشر (الشكل2B). يتم تعيين هذه المناطق يدويًا إلى كومة ذات أبعاد كبيرة منخفضة تظهر نمط تعبير GFP في وحدة التخزين أسفل قنية التصوير (الشكل2A). ثم، يتم الحصول على 1 ميكرومتر z-الخطوة مكدسات الصور من dendrites القاعدية PN CA1 على فترات زمنية مختلفة (من 24 ساعة إلى 3 أيام) لمدة تصل إلى حوالي 14 يوما (الشكل2C). أطول مدة التصوير والفواصل الزمنية ممكنة26. تستمر كل جلسة تصوير حوالي 60 إلى 90 دقيقة. على الرغم من أن معظم الصور هي من العمود الفقري الددري في SO، فمن الممكن أيضا أن صورة العمود الفقري الددرية في dendrites منحرف من ريال (أرقام2D-F). بالإضافة إلى كثافة العمود الفقري، تمكن هذه الطريقة من دراسة ديناميات العمود الفقري من خلال تحديد معدلات البقاء على قيد الحياة، والكسب والخسائر26،27،28،29،30، 31 , 32.ليسجل وتتبع العمود الفقري dendritic مع مرور الوقت (الشكل2C)،يتم استخدام واجهة MATLAB مخصصة. وهذا يتيح محاذاة مكدسات الصور المكتسبة في نقاط زمنية مختلفة ويدعم وضع العلامات اليدوية من dendrites والعمود الفقري في حين تتبع أطوال dendritic ومواقف العمود الفقري على مر الزمن26. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة للتمييز (في كل نقطة زمنية، باستثناء أول واحد) بين العمود الفقري الددرية الموجودة من قبل وحديثي الولادة. وهذا أمر مهم كما يعتقد أن فئات مختلفة من العمود الفقري dendritic أن يكون لها أدوار مختلفة في اكتساب الذاكرة والاحتفاظبها 33.

التصوير الطولي لللدونة التي تثيرالنشاط.

إلى اللدونة التي تثيرالنشاط الصورة في CA1 PNs، يتم حقن منطقة فرس النهر CA1 الظهرية مع ناقل فيروسي يعبر عن الفلورسنت الأخضر المزعزع للاستقرار d2Venus عن طريق شكل محسن من عنصر استجابة النشاط متشابك (E-SARE) داخل القوس محسن / المروج والأحمر الفلورسنت TurboFP635 عبر المروج ePGK 34. وهذا يسمح لمستويات التصوير من اللدونة التي تثير النشاط من مئات من النفثالينات CA1 في كل الحيوان35. وبالنظر إلى وضع العلامات الكثيفة جداً من الشبكات الافتراضية الخاصة، فإنه من غير الممكن عموماً حل dendrites من الشبكات المحلية CA1 (الفيلمالتكميلي2).

لتصوير somata من CA1 الشبكات الافتراضية الخاصة، يتم استخدام 40X 0.8 NA، 3 مم WD، عدسة موضوعية غمر المياه. للتتبع الطولي، يتم تعريف 1 إلى 9 مناطق الدماغ لكل ماوس خلال جلسة التصوير الأولى. وتقابل كل منطقة مساحة تبلغ حوالي 300 × 300 درجة مئوية وتحتوي على ما بين 50 و150 خلية (الشكل3A). يتم تعيين هذه المناطق يدويًا إلى معالم الأنسجة المحلية المرئية عند تكبير أقل. ثم، يتم الحصول على 3 μm z-step مكدسات الصور، والتي تشمل SP من CA1 PNs (الشكل3A والفيلم التكميلي2) في فترات زمنية مختلفة (من 24 ساعة إلى 6 أيام) لمدة تصل إلى 30 يوما. تستمر كل جلسة تصوير ما يقرب من 60 إلى 90 دقيقة. وهكذا، ونحن عموما صورة 6-8 ح بعد التجربة والسماح لمدة 5 أيام بين جلسات التصوير35.

لتحديد قيم الفلورة d2Venus وTurboFP635، يتم رسم منطقة دائرية من الفائدة 4.64 ميكرومتر في القطر، وهو أصغر من جسم الخلية العصبية، تتمحور إلى سوما الخلية. ثم نتقدم إلى نقطة المرة التالية، ويسجل سوما من نفس الخلية بنفس الطريقة، وتكرار هذا الإجراء لجميع النقاط الزمنية وجميع الخلايا المرئية في مجموعة البيانات الطولية. يتم تطبيع القيمة المتوسطة لكل خلية عصبية (تعتمد على النشاط) d2Venus الانبعاثات من قبل متوسط (النشاط المستقل) TurboFP635 الانبعاثات. هذه الطريقة تمكن من التحقيق في ديناميات طويلة الأجل من اللدونة الفرقة من CA1 PNs35 (الشكل3C).

Figure 1
الشكل 1: التحضير للتصوير البصري للدماغ العميق في الجسم الحي. (A). أعلى (يسار) والجانب (يمين) وجهات النظر من مثال التصوير cannuals. تحتوي قنية التصوير على قاع زجاجي شفاف للسماح بالوصول البصري إلى الحصين. (ب). وصف تخطيطي للإعداد تسليط الضوء على الموقف النسبي لقنية التصوير، وCA1 PN والطبقات الثلاث من الألياف من الظهرإلى البطني. (C,D). وصف تخطيطي لإعداد التصوير (C) وتثبيت الحيوان (D) أثناء جلسة التصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التصوير الطولي للبنية التقشرية وديناميات العمود الفقري التقشري. (A). 2P كومة صورة (الحد الأقصى للإسقاط كثافة (MIP) من 59 صورة الطائرات، 2 ميكرومتر z-تباعد) من الخلايا العصبية وdendrites وصفت من قبل GFP في ماوس Thy1-GFP الحية. (ب). التكبير أعلى (MIP من 53 صورة الطائرات، 1 ميكرومتر z-تباعد) بالتفصيل dendrites القاعدية الموجودة في SO. (C). تسلسل صورة الفاصل الزمني من قطعة dendritic المصورة على مدى 14 يوما. تشير رؤوس الأسهم إلى أن العمود الفقري التقشري تم تعقبه على مدى 14 يومًا. (D,E). 2P كومة صورة من الخلايا العصبية وdendrites وصفت من قبل GFP في ماوس Thy1-GFP الحية. (D) ZY الإسقاط (31 طائرات الصورة، 3 ميكرومتر z-تباعد) و (E) XY التوقعات (17 طائرات الصورة، 3 ميكرومتر z-تباعد). (F). أعلى التكبير (طائرة صورة واحدة) بالتفصيل dendrites apical والعمود الفقري dendritic الموجودة في SR. Arrowheads تشير إلى العمود الفقري dendritic. الإثارة: 920 نانومتر; ذروة الانبعاثات: 510 نانومتر. قضبان المقياس: A، 50 درجة مئوية؛ B, 10 μm; C, 2 μm; D و E، 15 ميكرومتر؛ F, 4 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصوير الطولي لللدونة التي تثير النشاط. (A). 2P الصور (طائرات صورة واحدة) من ماوس الحية، وتظهر نفس الخلايا في يوم خط الأساس 0 وبعد EE في اليوم 1. (B. 2P مكدسات الصور (MIPs من 4-6 طائرات الصورة، 3 μm z-التباعد) تظهر أنماط التنشيط E-SARE محددة للبيئة A (أيام 1، 19 و 25) والبيئة B (أيام 7 و 13). أخضر: d2فينوس الفلورة. الأحمر: TurboFP635 الفلورة. الإثارة: 920 نانومتر; d2Venus ذروة الانبعاثات: 530 نانومتر; TurboFP635 ذروة الانبعاثات: 635nm. قضبان المقياس: A، 20 درجة مئوية؛ B، 10 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Attardo وآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصوير البنية العصبية في دي جي فرس النهر باستخدام ثلاث فوتونات (3P) المجهرية. (A-H). صور 3P (طائرات صورة واحدة) من الخلايا العصبية وdendrites وصفت من قبل GFP في حية Thy1-GFP الماوس بالتفصيل (A-E) الشبكات الافتراضية في CA1 و (F-H) خلايا الحبيبية في DG. الإثارة: 1400 نانومتر; ذروة الانبعاثات: 510 نانومتر. شريط مقياس: 40 درجة.

تكميلية فيلم 1: مجال التصوير من العرض في ماوس Thy1-GFP الحية. 2P صورة المكدس (83 صورة الطائرات، 7 ميكرومتر z-تباعد) من الخلايا العصبية وdendrites وصفت من قبل GFP (أبيض) في ماوس Thy1-GFP الحية تمتد من الجزء السفلي من قنية إلى SLM. لحساب اضمحلال إشارة الفلورة مع عمق متزايد، استخدمنا تدرج غير خطي من كسب أنابيب المضاعف الضوئي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

تكميلية فيلم 2: تصوير اللدونة التي تثيرالنشاط. 2P صورة المكدس (28 طائرات الصورة، 3 م z-تباعد) من الخلايا العصبية التي تعبر عن E-SARE مراسل التعبير IEG في ماوس الحية التي تشمل SP. الأخضر: d2Venus الفلورة. الأحمر: TurboFP635 الفلورة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

هنا، يتم وصف إجراء للتصوير المتكرر 2P من CA1 الظهرية في الفئران الحية. بعد الجراحة، يتعافى الماوس عادة في غضون يومين. الإجراء يحفز الحد الأدنى من الغليوس الفلكية 26،43. عادة ما يتم إعادة امتصاص النزيف والوذمة التي قد تتبع الجراحة في غضون 10 إلى 14 يومًا. عموما، من 14 يوما بعد الزرع فصاعدا إعداد واضح بما فيه الكفاية لأداء التصوير داخل الحيوية. نجاح الجراحة لا يعتمد على العمل في بيئة معقمة. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان الحفاظ على مستوى عال من النظافة، لتجنب المضاعفات الناجمة عن العدوى المرتبطة بالجراحة. ويتم الحصول على ذلك عن طريق التنظيف الدقيق للأدوات الجراحية قبل وبعد الجراحة وعن طريق تعقيمها بالحرارة مباشرة قبل كل استخدام (الخطوة 2.1.1). يتم الاحتفاظ قنية البصرية في حاوية نظيفة ومعقمة وشطفها مع المالحة المعقمة قبل الزرع مباشرة. أداء الممارسات الجراحية الشائعة لتطهير اليدين وتنظيف المحطة الجراحية هو أيضا مهم جدا. التحضير لا يزال مستقرا ويسمح التصوير الدقة الخلوية ودون الخلوية لعدة أسابيع26،35.

الخطوات الهامة والتعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

من المهم تقشير الكبسولة الخارجية حتى يتم الكشف عن أعمق الألياف. قد يؤدي الفشل في الكشف عن الفيس إلى عدم القدرة على التركيز على ورم الـ PNs، أو في انخفاض دقة تصوير العمود الفقري الددري، عند استخدام الأهداف التجارية مع WD 3-أو 4 مم. لهذا الهدف، فمن المفيد أن تشطب القشرة الجديدة ببطء شديد باستخدام إبرة قطرها 0.9 ملم ومن ثم التبديل إلى إبرة قطرها 0.3-0.5 ملم (قياس 24-29) للسيطرة الدقيقة على الشفط عند إزالة الألياف الظهرية. بدلا من ذلك، يمكن استخدام ملقط غرامة لإزالة القشرة المتبقية بعد التعرض للألياف36.

يمكن أن يكون النزيف أثناء الجراحة مشكلة، حيث أن الدم يعيق الرؤية. في انتظار أن تتشكل الجلطة ثم تُصفّى بمحلول ملحي لغسل الدم المتبقي. كرر حسب الضرورة.

تناسب دافئ بين قنية واستئصال الجمجمة يساعد على زيادة استقرار التحضير عن طريق الحفاظ على قنية في مكان قبل تطبيق الاسمنت، وخاصة إذا كان الحافة الخارجية للقنية هو دافق مع الجمجمة. منذ أحجام الحفر trephine والقنانة متطابقة، يمكن أن تنشأ نوبة فضفاضة بسبب المخالفات على جانب قنية - التي تتطلب استئصال الجمجمة أكبر قليلا لتناسب (انظر الخطوة 2.3.14) - أو من استئصال الجمجمة غير النظامية. ويجب رفع أي مخالفات في القنية (الخطوتان 1-3 و1-12) ويجب أن يُعقد الترفين عمودياً على الجمجمة إلى أن يكتمل استئصال الجمجمة (الخطوة 2-3-12). قد تؤدي إزالة الربين من الجمجمة قبل اكتمال استئصال الجمجمة إلى استئصال الجمجمة بشكل غير منتظم.

القيود - الغازية والاستقرار في الإعداد.

ومن الصعب تقييم أثر الاستئصال القشري لأنه من الشاق تحديد المناطق المتأثرة بصورة مباشرة وغير مباشرة تحديدا دقيقا. بشكل عام، تزيل الجراحة جزءًا من القشرة الجدارية وجزءًا من القشرة الحسية البصرية والخلفية21. القشرة الاستئصالية لا تُعرض مباشرة على الحصين والأنسجة الحصينية لا يتم لمسها ولا إصابتها. الأهم من ذلك، وقد تبين أن زرع قنية التصوير لا يغير بشكل صارخ وظيفة فرس النهر وعلى وجه التحديد فرس النهر تعتمد على التعلم21،36،37،38، 39. ومع ذلك، سيكون من المهم تحديد مدى كل من قنية والجزء الخارجي من زرع (لوحة حامل الرأس وغطاء الاكريليك الأسنان) هي عوامل الإجهاد المزمنة من خلال تقييم مستويات الدم الكورتيكوستيوستيرون ووزن الغدة الكظرية بالمقارنة مع الفئران غير المزروعة.

الإعداد عموما لا يزال مستقرا من أسابيع إلى أشهر26. على المدى الطويل، ونمو الجلد والعظام تميل إلى إزاحة غطاء الاكريليك وزيادة عدم الاستقرار في إعداد التصوير.

القيود البصرية.

الفحص المجهري التقليدي 2P يسمح التصوير تصل إلى حوالي 1 ملم في عمق الأنسجة القشريةالجديدة 40،41. وتماشياً مع ذلك، من الممكن تصوير الدندريتس والعمود الفقري الددريالموجود في SR (الشكل2D-F)أو SLM36. ومع ذلك، التصوير من خلال قنية يضع قيودا على NA فعالة. لتحقيق الحد الأقصى للدقة، يجب أن يتطابق قطر وعمق قنية التصوير مع التصوير NA، حيث أن أقطار أصغر وأعماق أطول سوف مقطع ضوء من أهداف NA عالية. على سبيل المثال، عند التصوير مع 1.0 NA هدف الغمر المياه من خلال قنية 1.6 ملم طويلة، هناك حاجة إلى قطر داخلي 3.65 ملم للحفاظ على NA كامل. ومع ذلك، فإن استخدام قنية من هذا القطر زيادة الضغط على الحصين، ويمكن أن تؤثر على صحة الأنسجة، لهذا السبب، ونحن نستخدم قنية مع قطر أصغر. عند التصوير مع 0.8 NA هدف غمر المياه من خلال قنية 1.6 ملم طويلة، وقطر داخلي من 2.5 ملم سيكون كافيا للحفاظ على NA كامل. ومع ذلك، 0.8 أهداف الغمر المياه NA لديها WD أقصر (3 ملم في حالتنا)، والتي يمكن أن تمنع من التركيز في SP.

تنطبق هذه الحسابات على مركز مجال الرؤية في الجزء السفلي من القنية. ومع ذلك، فإن تحريك مجال التصوير من الرؤية جنبا إلى جنب - أقرب إلى حواف قنية - أو التركيز أعمق في الأنسجة - أبعد من السطح الزجاجي للقنية - يقلل من NA فعالة في المستوى البؤري وبالتالي يقلل من القرار. وهذا سيؤدي إلى دقة غير متجانسة عبر أحجام مختلفة من الأنسجة المصورة ويمكن أن يكون مصدر قلق للتصوير الكمي في دقة دون الخلوية، وخاصة عند استخدام تقنيات فائقة الدقة مثل 2P-STED المجهرية42. هذه المشكلات أقل أهمية عند التصوير بدقة خلوية.

حركة الأنسجة.

الحركة داخل الأنسجة - الناشئة من التنفس وضربات القلب في الحيوانات التخدير - يميل إلى أن تصبح أكثر شدة مع زيادة المسافة من قنية التصوير. هذا ربما لأن قنية التصوير يطبق الضغط الميكانيكي على الدماغ وبالتالي مواجهة بعض الحركة في محيط قنية (على غرار الاستعدادات القشرية الجديدة). وهكذا، على الرغم من أن تصوير العمود الفقري الددري ة ممكن في SR وSLM، في أيدينا، فمن أقوى الظهرية إلى SO تصل إلى 200 ميكرومتر من سطح قنية. للتعويض عن الحركة، ونحن نستخدم الماسحات الضوئية الرنانة ومتوسط حاليا. يتم الحصول على عدة صور (4 إلى 6 تكرارات) لكل مستوى صورة من مكدس z بأقصى سرعة متاحة (30 إطار/ث). ثم يتم deconvolved جميع التكرارات لكل طائرة z (باستخدام البرنامج التجاري، أوتوكوانت)، مسجلة (باستخدام ImageJ) ومتوسط في صورة واحدة26. لتصوير سوماتا، وغالبا ما تكون الحركة لا تذكر عند التخدير35 ومتوسطين غالبا ما تكون كافية للتعويض عن التحف الحركة.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات للطريقة .

ويمكن الجمع بين إعداد مع المناظير الدقيقة26،43. المناظير الدقيقة هي تحقيقات بصرية جامدة التي تستخدم العدسات الدقيقة مؤشر الانكسار التدرج (GRIN) لتوجيه الضوء من وإلى الأنسجة العميقة18. استخدام المناظير الدقيقة يسمح قنية من أقطار أصغر أو حتى لا قنية على الإطلاق. ومع ذلك، فإن المناظير الصغيرة التجارية أقل تصحيحاً للانحرافات البصرية ولها أقل من الأهداف التجارية. تصل المسبارات الحالية إلى الدقة الجانبية والمحورية من 0.6-1 ميكرومتر، 10-12 ميكرومتر، على التوالي17،18،44. كما أن استخدام المناظير الدقيقة يمكّن من الجمع بين هذا الإعداد مع المجاهر المتكاملة المثبتة على الرأس45و46و47.

الطريقة تصلح أيضا لاستخدامها في الفئران غير التخدير، وقد تم استخدامه للتحقيق في النشاط الخلوي باستخدام أجهزة الاستشعار Ca2 + في الفئران مستيقظا رئيس ثابت21،37،48،49. في هذه الحالات، بسبب الجداول الزمنية السريعة للتغيرات الفلورية، فمن المستحسن لتنفيذ خط التسجيل50. ومن الممكن أيضا تكييف التحضير لتصوير المناطق الفرعية فرس النهر الأخرى مثل سايروس dentate (DG)39،51،52. الجمع بين هذا الإعداد مع 3P الإثارة53،54 مع 1 ميغاهيرتز تردد الليزر النبض ضبطها إلى 1400 نانومتر ، كنا قادرين على صورة أعمق في تشكيل فرس النهر تصل إلى الطبقة الجزيئية ، طبقة الخلية الحبيبية و من المديرية العامة(الشكل 4) دون إزالة CA1 تراكب.

في الختام، نقدم طريقة توفر الوصول البصري إلى الحصين الظهري ويسمح الدراسات الطولية والنسبية لديناميات بنية فرس النهر والنشاط. هذه التقنية توسع إمكانيات تحليل وظيفة فرس النهر في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

U. A. F. بدعم من مؤسسة شرام; C.-W. T. P. و W. G. تدعمها جمعية ماكس بلانك; L.Y. وR.Y. بدعم من جمعية ماكس بلانك والمعهد الوطني للصحة (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. بدعم من منحة FP7 من المجلس الأوروبي للبحوث، وERANET وبرامج I-CORE، ومكتب كبير العلماء في وزارة الصحة الإسرائيلية، ووزارة التعليم والبحوث الاتحادية، روبرتو وريناتا روهمان، برونو وسيمون ليش، مركز نيلا وليون بينوزيو للأمراض العصبية، معهد هنري شانوش كرينتر للتصوير الطبي الحيوي وعلم الجينوم، مؤسسة العلوم الإسرائيلية عائلة بيرلمان، أديليس، مارك بيسين، برات وإيرفينغ أ. موسكوفيتز؛ A. A. بدعم من جمعية ماكس بلانك، ومؤسسة شرام والألمانية Forschungsgemeinschaft (DFG). تم الحصول على الصور 3P خلال الدورة المتقدمة على تقنيات التصوير العصبي في معهد ماكس بلانك فلوريدا لعلم الأعصاب. ويدعم الدورة المتقدمة في تقنيات التصوير العصبي من قبل جمعية ماكس بلانك، وبرنامج زمالة ماكس بلانك العلمية في ولاية فلوريدا، وبرنامج شراكة مؤسسة معهد ماكس بلانك فلوريدا. نود أن نشكر ثورلابس، متماسكة وSpectraPhysics لتقديم الدعم والمعدات لنظام التصوير 2P / 3P خلال الدورة. كما أننا ممتنون لهنري هابيرل وميليسا إيبيرل على مساعدتهما في النظام خلال الدورة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Professional drill/grinder IBS/E Proxxon GmbH 28481 Pecision drill
MICROMOT drill stand MB 200 Proxxon GmbH 28600 Movable ruler table
MICRO compound table KT 70 Proxxon GmbH 27100 Movable ruler table
Machine vice MS 4 Proxxon GmbH 28132 Movable ruler table
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm Sawade R00303 Stainless steel tube for the cannula metal ring
Microscope Cover glass (4 mm round) Engelbrecht Medizin and Labortechnik Glass coverslips for the cannula glass
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui Hoffmann Group 713750 160 Manual files
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 Hoffmann Group 527230 4 Manual files
UV-Curing Optical Adhesives Thorlabs NOA81 UV-curing adhesive
UV Curing LED System, 365 nm Thorlabs CS2010 UV-curing LED driver unit
Stemi 305 Zeiss Stereoscope
Presto II NSK-Nakanishi Germany Z307015 Dental drill
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein MF Dental F837.014.FG Files for the dental drill
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob MF Dental G837.014.FG Files for the dental drill
Graefe Forceps - Straight / Serrated Fine Science Tools 11050-10 Forceps for the surgery
Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19008-05 0.5 mm width burr for the micro-drill
Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19008-09 0.9 mm width burr for the micro-drill
MicroMotor mit Handstück DentaTec MM11 Micro-drill for the craniotomy
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30 Dumont forceps for the surgery
Fine Scissors - ToughCut Fine Science Tools 14058-09 Scissors for the surgery
Trephine MW Dental 229-020 Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws Fine Science Tools 19010-10 0.86 mm width bone screws
Stereotaxic apparatus Kopf Stereotaxic apparatus
3-D-Gelenkarm Hoffmann Group 442114 Stereotaxic arm and plate holder
Aufnahme 2SM Hoffmann Group 442100 2SM Stereotaxic arm and plate holder
Hot Bead Sterilizers Fine Science Tools 18000-45 Glass beads sterilizer
Isofluran CP, Flasche 250 ml Henry Schein VET GmbH 798932 Liquid isoflurane for anesthesia
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer Harvard Apparatus GmbH 34-1040 Isoflurane vaporizer
Lab Active Scavenger Gropper Medizintechnik UV17014 Isoflurane scavenger system
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml Henry Schein VET GmbH 798566 Meloxicam, anti-inflammatory
Vetalgin 500 mg/ml MSD Tiergesundheit Vetalgin, pain killer
CMA 450 Temperature Controller Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH 8003770 Heating blanket
Bepanthen Augen- und Nasensalbe Bayer AG Ophtalmic ointment
KL 1500 LCD Schott Fiber optic light source
Xylocain Pumpspray AstraZeneca GmbH Lidocain, local anesthetic
Absorption Triangles - Unmounted Fine Science Tools 18105-03 Absorption triangles for the surgery
Parkell C&B Metabond clear powder L Hofmeester dental 013622 Quick adhesive cement
Parkell C&B Metabond Quick Base B Hofmeester dental 013621 Quick adhesive cement
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C Hofmeester dental 013620 Quick adhesive cement
Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379 Precision applicators for the surgery
Blunt needles 0.9x23 mm Dentina 0441324 Blunt needles
Blunt needles 0.5x42 mm Dentina 0452155 Blunt needles
Blunt needles 0.3x23 mm Dentina 0553532 Blunt needles
Kallocryl A/C Speiko 1615 Acrylic liquid component
Kallocryl Speiko 1609 Acrylic powder
Hydrofilm transparent roll Hartmann Adhesive film
Head plates Custom made 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium
Head plate clamp Custom made Head plate holder
Pedestal post holders Thorlabs PH20E/M Head plate holder
Stainless steel post Thorlabs TR30/M Head plate holder
Stainless steel post Thorlabs TR75/M Head plate holder
Stainless steel post Thorlabs TR150/M Head plate holder
Post connector clamps Custom made Head plate holder
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps Thorlabs MB3045/M Microscope stage
7" x 4" Lab Jack Thorlabs L490/M Microscope stage
Low profile face mask small mice Emka Technologies VetFlo-0801 Anesthesia facemask holder
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table Newport Floating table
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling Newport Floating table
Power Meter Model 1918-R Newport Power meter
X-Cite 120Q Excelitas Technologies Fluorescence lamp
Two-photon microscope Bruker Ultima IV Two-photon microscopes
Two-photon microscope Thorlabs Bergamo Two-photon microscopes
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 Olympus Objectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 Olympus Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 Olympus Objectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 Olympus Objectives
Ultafast tunable laser for 2P excitation Spectraphysics Mai Tai Deep See Excitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 2P excitation Spectraphysics InSight DS+ Dual beam Excitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 3P excitation Coherent Monaco Excitaiton lasers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O’Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press; Oxford University Press. (1978).
  2. Zola-Morgan, S., Squire, L. R. Memory Impairment in Monkeys Following Lesions Limited to the Hippocampus. Behavioral Neuroscience. 100 (2), 155-160 (1986).
  3. Squire, L., Zola-Morgan, S. The medial temporal lobe memory system. Science. 253 (5026), 1380-1386 (1991).
  4. Leutgeb, S., Leutgeb, J. K., Barnes, C. A., Moser, E. I., McNaughton, B. L., Moser, M. B. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
  5. Silva, A. J., Zhou, Y., Rogerson, T., Shobe, J., Balaji, J. Molecular and cellular approaches to memory allocation in neural circuits. Science. 326 (5951), 391-395 (2009).
  6. Tonegawa, S., Pignatelli, M., Roy, D. S., Ryan, T. J. Memory engram storage and retrieval. Current Opinion in Neurobiology. 35, 101-109 (2015).
  7. Poo, M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, (2016).
  8. O’Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
  9. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  10. Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anatomical Record. 145, 573-591 (1963).
  11. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  12. Sorrells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  13. Boldrini, M., et al. Human hippocampal neurogenesis persists throughout aging. Cell Stem Cell. 22 (4), 589-599 (2018).
  14. Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity — towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2017).
  15. Rosene, D. L., Van Hoesen, G. W., et al. The hippocampal formation of the primate brain. in Cerebral Cortex. Jones, E. G., et al. Chapter 9, Plenum Press. New York. 345-456 (1987).
  16. Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist. 17 (5), 539-559 (2011).
  17. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Reviewof Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  18. Jung, J. C., Schnitzer, M. J. Multiphoton endoscopy. Optics Letters. 28 (11), 902 (2003).
  19. Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
  20. Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution in vivo imaging of hippocampal dendrites and spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147-3151 (2004).
  21. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  22. Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid- for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (22), 8740-8745 (2012).
  23. Jung, J. C., Mehta, A. D., Aksay, E., Stepnoski, R., Schnitzer, M. J. In vivo mammalian brain imaging using one- and two-photon fluorescence microendoscopy. Journal of Neurophysiology. 92 (5), 3121-3133 (2004).
  24. Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  26. Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
  27. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  28. Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W. B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-265 (2005).
  29. Holtmaat, A. J. G. D., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
  30. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  31. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  32. Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34, 13948-13953 (2014).
  33. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (42), 177-187 (2011).
  34. Kawashima, T., et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods. 10 (9), 889-895 (2013).
  35. Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
  36. Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
  37. Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
  38. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
  39. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  40. Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media. Optics Communications. 188, 25-29 (2001).
  41. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 mm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  42. Pfeiffer, T., et al. Chronic 2P-STED imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. eLife. 7, e34700 (2018).
  43. Barretto, R. P. J., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature Medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
  44. Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
  45. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  46. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
  47. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  48. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  49. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), aaa5694 (2016).
  50. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. SIMA: Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, (2014).
  51. Gonçalves, J. T., et al. In vivo imaging of dendritic pruning in dentate granule cells. Nature Neuroscience. 19 (6), 788-791 (2016).
  52. Danielson, N. B., et al. Distinct contribution of adult-born hippocampal granule cells to context encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
  53. Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 1 (1), 71 (1996).
  54. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).

Tags

السلوك العدد 148 الحصين التصوير البصري في الجسمالحي طولية الماوس اثنين من الفوتون جراحة اللدونة العصبية
التصوير الطولي اثنين من الفوتون من CA1 فرس النهر الأورسيال في الفئران الحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ulivi, A. F., Castello-Waldow, T.… More

Ulivi, A. F., Castello-Waldow, T. P., Weston, G., Yan, L., Yasuda, R., Chen, A., Attardo, A. Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice. J. Vis. Exp. (148), e59598, doi:10.3791/59598 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter